專利名稱：含有分離的多角體病毒的生物防治劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及以前未分離的和未鑒定的昆蟲致病病毒毒株、含有該毒株的生物防治劑以及其復制和在蟲害防治中的用途。
背景技術：
核型多角體病毒是桿狀病毒科(Baculoviridae)昆蟲特異性DNA病毒，其中有被膜的桿狀病毒粒子咬合于已知為多角體的蛋白基質內，所述病毒粒子包含50～100M道爾頓的環狀雙鏈DNA基因組。按照每被膜內的病毒粒子數，NPVS可以分為單個包埋(Singly-embedded)或多個包埋(multiply embedded)(MNPV)的。由于這些病毒對農作物及森林的主要鱗翅害蟲具有致病性，因此被廣泛研究作為生物害蟲防治劑。雖然用于此目的的防治劑已有銷售，但這類產品的廣泛使用受到其持久性差、殺滅速率緩慢及單位施用面積的成本高的局限。
發明概述本發明描述了一種新的單個包埋的谷實夜蛾(Heliothis Zea)核型多角體病毒毒株，它保藏于歐洲動物細胞培養物保藏中心，保藏號為V93071301。高致病力是其特征，這比現有毒株更有優勢。因此本發明的一個方面提供了一種分離的核型多角體病毒，它具有保藏于歐洲動物細胞培養保藏中心、保藏號為V93071301的樣品的特征。
例如當將該病毒配制成農用噴霧劑時，它可用于防治害蟲，如夜蛾(Heliothis)和Helicoverpa屬的種。因此，本發明的另一方面是提供一種含有本發明病毒的生物防治劑和一種對抗棲息地處蟲害的方法，該方法包括用本發明的生物防治劑治理昆蟲或棲息地。
本發明還提供一種體外復制本發明病毒的方法，包括用該病毒感染在培養基中培養的昆蟲細胞，并將該細胞培養一段時間直至在細胞核內檢測到多角包含體，再從細胞和/或培養基中收獲病毒。
發明詳述分離該病毒最早在Pikeville，North Carolina，U.S.A發現的三只死Helicoverpazea幼蟲上繁殖。通過將蟲尸轉移到盛有新制昆蟲食物的塑料杯內，在食物表面碾碎蟲尸并引入可喂食該污染食物的煙蚜夜蛾(Heliothis virescens)或Helicoverpa zea的幼蟲來繁殖該病毒。感染通常在20～25℃進行。繁殖以兩周至一年間變化間隔進行。蟲尸儲存于室溫的塑料食物杯中。
純化如上述在煙蚜夜蛾中繁殖該病毒。癥狀與病毒感染的那些一致。感染的幼蟲變得松軟、發黑，并傾向于破裂和液化。通常用包含病蟲組織的無菌塑料環在食物表面劃線，進一步轉移到食物中來產生接種病原體。將蟲尸儲存于-20℃。以這種方式得到50只感染的幼蟲。
收集蟲尸，在無菌蒸餾水中研碎并經兩層平紋細布(muslin)濾過。濾液在1000rpm下進行重復離心5分鐘除去昆蟲碎片。然后上清液在4100rpm離心20分鐘，洗后沉淀仍然保留。該沉淀重新懸浮于水并在顯微鏡下檢測。觀察到典型的核型多角體病毒(NPV)顆粒。每只幼蟲得到的約5×107個多角包含體(IB)。
將該病毒樣品保藏于PHLS，Salisbury，Wilts SP4 OJG，U.K.的歐洲動物細胞培養保藏中心，保藏號為V93071301。
生物鑒定為進行比較，將該病毒與棉鈴蟲(Heliothis armigera)核型多角體病毒的特征毒株，HaSNP A44EB一起進行生物鑒定，該毒株從前已顯示出能感染煙蚜夜蛾，Helicoverpa zea，Helicoverpa armigera和Helicoverpa punctigera。該毒株由RobertTeakle博士在1974年。澳大利亞昆士蘭的棉花上收集的感染的Helicoverpaarmigera的分離體克隆。
將直徑約1mm的斑豆昆蟲食物料塊放入微量滴定皿的孔中。然后將1ul水中的各種濃度的多角體加在每個料塊表面。將吃光食物料塊的所有幼蟲轉移到盛有食物的塑料盆中。7天后檢查這些昆蟲。
下表I列出了結果。
證據表明至少是對煙蚜夜蛾和H.zea，HzNPV V93071301的致病性比HaSNPVA44EB至少強一個數量級。
雖然未將HzNPV V93071301與商品標準品進行直接比較，但一個相似的試驗表明對煙蚜夜蛾HaSNPV A44EB比稱作“Elcar”的HzSNPV商品毒株具有稍強的致病性，正如下表2列出的那樣。“Elcar”是注冊商標。
表IHzSNPV V93071301和HaSNPV A44EB的比較性生物鑒定數據
表IIHaSNPV A44EB和HzSNPV“Elcar”毒株對HeliothisVirescens的比較性生物鑒定數據
細胞培養通過從感染昆蟲提取血淋巴到Helicoverpa zea的靜態培養物中來建立HzNPV V93071301的細胞培養。該病毒成功地感染細菌，在核內形成多角體并且可在細胞培養物中被繁殖。當暴露于非閉合形式的HzNPV V93071301時，在匯合的H.zea細胞層上形成空斑。
鑒定在感染的昆蟲在1％十二烷基磺酸鈉(SDS)水溶液中研磨。調校多角體懸浮液至每份樣品約5×109PIB，過濾、離心并如前面所述進行洗滌，除去SDS。而后將多角體溶于pH10的Na2CO3緩沖溶液中。懸浮液于5000rpm離心5分鐘以除去碎片，上清液于14000rpm離心45分鐘。將病毒粒子重懸浮于pH8的200ul TE(10mM的Tris HCl，1mM的EDTA)。蛋白通過加到病毒制品的200ul提取緩沖液(0.2％w/v KCl，0.2％肌氨酸(scarcosyl)的TE)，再加入終濃度為0.1mg/ml蛋白激酶K進行消化。該消化液在65℃和溫和攪拌下孵育3～4小時，與400ul苯酚/氯仿/異戊醇(50∶48∶2)混合并于13000rpm下離心5分鐘。該提取進行兩次。透析約12小時除去過量鹽、洗滌劑、苯酚和氯仿。然后分別用核酸限制性內切酶EcoRI、EcoRV、HindIII和BamHI消化DNA制品5～6小時。通過瓊脂糖凝膠電泳(0.7～0.8％瓊脂糖)分析DNA制品。
HzNPV V93071301、HaSNPV A44EB和HaSNPV“Elcar”樣品同時進行電泳。觀察到的每種病毒的總譜帶數，以及觀察到的兩對病毒間的相同譜帶數列于表3。
表III根據瓊脂糖凝膠電泳鑒定病毒毒株
由于這些病毒間有充分的同源性，將HzNPV V93071301劃分為單個包埋的谷實夜蛾核型多角體病毒(HzSNPV)是顯然的，根據DNA圖譜，毒株V93071301與其它任一試驗毒株顯著不同。
本發明毒株新穎性的其它證據可從
圖1看出，
圖1顯示了本發明病毒的多角體切片的電子顯微照片。為獲得該電子顯微照片，于4℃將樣品固定于含3％戊二醛的0.05M磷酸緩沖液中，用含1％鋨酸的0.05M磷酸緩沖液后固定放在瓊脂糖凝膠上，脫水并滲透。然后將該樣品固定于Spurr’s樹脂。超薄切片用含0.2％檸檬酸鉛的0.1N氫氧化鈉染色5分鐘。用Philips PW 6002透射電子顯微鏡檢測切片。
制劑及用途本發明的新病毒毒株適于用生物防治劑，以防治蟲害，特別是農作物，例如棉花、蔬菜、水果、大豆、谷類等的幼鱗蝶蟲。其中用病毒對抗和防治的害蟲是夜蛾屬和Helicoverpa屬，如H.zea，煙蚜夜蛾，棉鈴蟲，H.Puncitigera等。
該病毒以組合物形式應用于害蟲或害蟲棲息地(如生長的作物)，組合物中病毒與適宜的固體或液體稀釋劑或載體混合，可以存在或不存在其它組份如表面活性劑、潤濕劑、分散劑，以及旨在保護病毒存活的組份如紫外吸收劑和抗氧化劑等。優選的制劑包括可潤濕粉、油懸浮液和病毒的微膠囊懸浮液(如其中囊衣通過coascervation技術或原位交聯形成聚脲或聚酰胺殼得到)。D.J Rhodes在D GJones編輯的1993年出版(Chapmant & Hall，London)的“Exploitation ofMicroorganisms”第411～439頁的“Formulation of Biological Control Agents”更全面地公開了作為生物防治劑制劑的核型多角體病毒配制技術，該文獻引入本文供參考。
權利要求
1.一種分離的核型多角體病毒毒株，它具有保藏于歐洲動物細胞培養保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures)，保藏號為V93071301的樣品的特征。
2.一種生物防治劑，包含與固體或液體稀釋劑或載體結合的權利要求1的病毒。
3.一種防治棲息地處蟲害的方法，它包括用權利要求2的生物防治劑治理害蟲或其棲息地。
4.根據權利要求3的方法，其中蟲害是夜蛾(Heliothis)或Helicoverpa屬昆蟲。
5.根據權利要求4的方法，其中蟲害是H.zea，煙蚜夜蛾(H.virescens)，棉鈴蟲(H.armigera)或H.punctigera。
6.一種體外復制權利要求1的病毒的方法，它包括用病毒感染培養基中培養的昆蟲細胞，并培養細胞一段時間直至在細胞核內檢測到多角包含體，再從細胞和/或培養基中收獲該病毒。
全文摘要
一種分離的核型多角體病毒毒株，它具有保藏于歐洲動物細胞培養保藏養中心，保藏號為V93071301的樣品的特征。
文檔編號A01N63/00GK1141648SQ94194809
公開日1997年1月29日 申請日期1994年11月7日 優先權日1993年11月15日
發明者D·J·羅迪斯, P·J·居斯特, R·G·布倫克 申請人:曾尼卡有限公司