專利名稱：：農作物花粉的貯藏方法農作物花粉的貯藏方法涉及作物的栽培方法，尤其是作物的雜交育種制種方法。一般來說，花粉成熟從花藥裂出后，如得不到適宜的萌發條件，就會很快喪失生活力，如水稻成熟花粉離開花藥后，大約5～10分鐘萌發力就大為降低，15分鐘后花粉的萌發力幾乎全部喪失；這在常規作物生產中沒有成為制約因素。自從我國雜交水稻三系配套成功并應用于生產以來，在雜交制種時，常常出現父母本的花期與花時不遇，從而造成花粉量不足，異交結實率低，產量不高甚至失收的情況。解決水稻雜交制種低產的途徑是將水稻的父母本相間栽種，并調節父母本的花期，如美國專利4305225公開的是水稻的父母本相間種植，然后用控制田間水量和使用赤霉素來調節父母本抽穗和授粉的同步以達到花期相遇的目的；CN92106819.0公開的是在父本散粉高峰期統一趕粉和提高母本柱頭外露率，創造最佳異交態勢以及使母本劍葉角度改變，排除授粉障礙，毋需調節父母本花時而達到高產制種的方法；CN92111766.3公開的是一套較完整的全面調節花時，提高花粉利用率、實現高產制種方法。但是如何從根本上解決雜交制種父母本的花期、花時相遇，同時減少如趕粉、父母本間種等人工繁瑣制種程序以達到穩定高產制種，走利用貯藏花粉的道路是一條有效的途徑。本發明旨在提出一整套的花粉貯藏技術，以延長花粉壽命，使貯藏一段時間的花粉不僅有萌發力，而且具有授精能力，授粉后能正常結實；更是為建立一個“世界作物花粉庫”，隨時為育種家們供應世界各地的優良性狀或有利基因的品種花粉提供科學的技術參數。實現本發明目的的技術方案是將采集的花粉置于下列條件中貯藏，(1)低溫貯藏，花粉的短期貯藏的貯藏溫度為0～5℃，長期貯藏時貯藏溫度為-196℃，(2)濕度控制花粉短期貯藏時，溫度為30～35％，長期貯藏時，濕度為25～30％，(3)避光貯藏離開花藥的花粉必須立即置于絕對黑暗中避光貯藏直至使用，(4)花粉貯藏時使用1～5ppm的放線菌素(Actinomycin)0作花粉呼吸抑制劑，(5)貯藏時的花粉厚度應控制在5mm以下；在超低溫度中長期貯藏的花粉在貯藏前需預冷處理，即先將花粉置于0℃溫度條件下1～2小時，再置于-80℃溫度條件下3～4小時，再進入超低溫(-196℃)貯藏；同時，在超低溫中長期貯藏的花粉，貯藏時，使用2～5％DMSO4(二甲基亞礬)或5％葡萄糖加2～5％DMSO4作防凍劑；對于貯藏花粉育性的檢測，采用的人工萌發培養基配方為淀粉0.05g/ml蔗糖40～50％MnSO48～10-5瓊脂0.5～1.0％H3BO350～100ppmPH5.6～6.0下面以水稻為例進一步詳述本發明。待貯藏的水稻花粉，采集時期應為父本盛花期，采集時間為上午10～12點，下午1～3點，花粉離開花藥后要立即進入低溫瓶內(溫度為0℃左右)，并處于黑暗條件中；注意機械采粉后的花粉萌發率不低于40％。采集的花粉貯藏前用篩或人工方法除去雜物，如花藥、穎托收其它雜質；并將萌發率在40％以上的金黃色花粉與萌發率較低的花粉分類貯藏；在機械采粉過程中，有時由于采粉機械的轉速過快，使花粉運動過烈，造成暫時“休克”，但只要花粉粒未破裂，經恢復性處理，即在黑暗條件下從低溫轉入25℃常溫條件下在3—4小時內能萌發的，仍可貯藏作為授粉用。花粉的低溫貯藏分為普通低溫貯藏和超低溫貯藏二種，當花粉貯藏的時間在7～15天時，可采取普通低溫貯藏，即置于0～5℃的冰箱中貯藏，而對于需貯藏60天以上的花粉，即可置于液氮罐(-196℃)內貯藏；在液氮罐內保存了60天的花粉，各品種花粉萌發率和萌發花粉的花粉管長度，幾乎保持了新鮮花粉的水平，而置于5～7℃冰箱內的花粉，60天后的花粉萌發率大多比新鮮花粉的萌發率降低了30～40％，有的降低了一半以上(見表1)。表1低溫貯藏對花粉萌發的影響(貯藏時間60天)在低溫條件下，花粉的生活力是隨貯藏時間的延長而逐漸降低。在2～5℃條件下，在貯藏的前60天，花粉生活力下降降顯著，以后下降速度減低，經180天后還可保持約10％以下的萌發率，貯藏時間365天后，所有品種的花粉生活力全部喪失。然而在液氮罐(-196℃)中貯藏花粉的生活力保持更好，貯藏180天的花粉，萌發率僅比新鮮花粉降低約20％左右，365天后仍具有較高的萌發率，相當于新鮮花粉的70％左右(見表2)。表2超低溫(-196℃)貯藏的花粉生活力<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="720">品種威優35威優642.6窄早余赤236-8農虎6號IR26項目(貯藏時間)萌發率(％)相對的百分數萌發率(％)相對的百分數萌發率(％)相對的百分數萌發率相對的百分數萌發率相對的百分數萌發率相對的百分數新鮮花粉(28-30℃)38.6410040.9410041.0010041.4210041.8610032.95100液氮內(180天)29.7577.3534.4184.0435.5286.6333.2080.1562.6077.8728.3085.88液氮內(365天)26.5569.0328.6670.0029.7072.4327.7466.9729.3270.0424.2073.44</table></tables>溫度對花粉生活力的影響，主要是高溫會使花粉的酶活性迅速降低，而低溫有利于酶活性特別是有利于細胞色素氧化酶活性的保持。貯藏的花粉必須是干燥的，才能保持較長時間的生活力，而且授粉時萌發率較高，育性好。因此采集的花粉，在25℃左右溫度、相對濕度60％的大氣中晾干2～3小時，或經過Cacl2和硅膠脫水干燥，使花粉含水量降低才能貯藏，短期貯藏的花粉，濕度控制在30～35％，而長期貯藏的花粉，濕度應控制在25～30％。貯藏的花粉，從采集下來就應立即置于黑暗條件下，貯藏的全過程不能見光，絕對避光，一直至花粉使用時為止；黑暗貯藏花粉也是提高貯藏花粉生活力的重要條件，因為水稻花粉對光輻射比較敏感，即使微弱的光輻射對花粉的生活力也有破壞作用，主要表現在抑制花粉的萌發和花粉管的伸長。貯藏花粉時，使用1～5ppm放線菌素O(Actinomycin0)可以降低花粉呼吸強度，以延長花粉壽命，這是因為放線菌素0是mRNA轉錄抑制劑，而花粉萌發需要新轉錄的mRNA，因此花粉貯藏使用低濃度的放線菌素0是延長花粉壽命的措施之一。貯藏花粉層的厚度控制在5mm以下是為了防止花粉層過厚引起的花粉“自熱”現象，造成局部溫度高而影響花粉壽命。對于超低溫(-196℃)液氮罐中長期貯藏的花粉，為了防止快速降溫的冷沖擊，應進行預冷處理，即先在0℃溫度中預冷1～2小時，再進入-80℃溫度條件下3～4小時，最后移入液態罐中貯藏，同時為了防止低超溫貯藏引起的凍害，可使用2～5％DMSO4或5％葡萄糖+2～5％DMSO4作防凍劑。花粉育性的檢測是花粉貯藏技術中不可缺少的部分，以前曾報導過一種水稻花粉萌發培養基，但花粉在該培養基上的萌發率僅5％左右，而柱頭上的花粉萌發率高達60～70％，因此這種培養基不能用作花粉的育性檢測。本發明提出的育性檢測培養基，其花粉萌發率接近柱頭上的花粉萌發率，因此可以用作花粉的育性檢測。用IR26花粉在人工培養基上作萌發試驗，同時在IR26柱頭上進行授粉觀察，結果表明，新鮮花粉和離開花粉5分鐘內的花粉在人工培養基上的萌發率分別為40.61％和31.52％與柱頭上的萌發率50.60％比較接近。貯藏花粉的目的是為了提高雜交水稻育種和制種的結實率。研究表明，水稻花粉貯藏2個月以上的還有較高的萌發率，一年內仍能保持一定的萌發水平。然而真正反映花粉育性是授粉試驗，87～88年的貯藏花粉育性試驗表明，經貯藏2個月的花粉，除秈×粳交的結實率稍低(6.25％)外，都在10％以上，說明貯藏花粉保持了較好的育性，達到了與新鮮花粉授粉的結實率水平(見表3)。表3貯藏花粉(60天)的育性鑒定(1987年長沙)結實率(％)常菲22A×79—85(秈)11.5常菲22A×混合花粉(品種)14.0常菲22A×岳農2號(粳)6.25常菲22A×混合花粉(新鮮花粉)12.08(C.K)四個品種的花粉在2～5℃低溫貯藏7天后進行田間授粉試驗，結實率平均為9.41％，其中同品種的花粉授粉率高達18.81％(見表4)。表4貯藏花粉的育性鑒定(1988)雜交組合的親本不同，授粉的結實率有一定差異，一般同品種雜交比異品種雜交的結實率要高。88年8月在雜交水稻制種田進行的貯藏花粉育性實驗，結果如下(見表5)，表5貯藏(貯藏七天)花粉的育性鑒定以龍陽A為母本，授以不同恢復系的貯藏花粉，結實率平均達到9.81％。特別要提出的是，當時正值湖南罕見的秋汛，一般的制種田的自然異交率接近于零，幾乎失收，而利用貯藏花粉授粉可獲得較高的結實率，證明本發明的貯藏方法是可靠的，同時也說明貯藏花粉不僅可用于雜交育種，也可用于制種，提高制種產量。小麥開花時氣溫較低，因此花粉貯存時，可以不加呼吸抑制劑；同時由于花粉采集時，田間相對濕度在70～80％，因此進入貯藏時，花粉含水量可以稍高些，但貯藏后應繼續脫水，使含水量保持在30％以下。經低溫條件下(0—7℃)貯藏的小麥花粉的結實率(見表6)。表6小麥貯藏花粉的結實率小麥花粉對H3BO3不敏感，因此小麥貯藏花粉的育性檢測中采用的人工萌發培養基不必加H3BO3。在0～5℃溫度條件下貯藏的油菜花粉，貯藏16天后，花粉萌發率仍可達53.2％(見表7)。表7油菜花粉的貯藏時間與萌發率油菜在花瓣全展時，花粉的成熟度高，此時采集的油菜花粉活力強，萌發率高。玉米花粉在液態罐中(-196℃)貯藏15—18天，花粉的萌發率在55～65％。農作物花粉的貯藏方法可以應用于各種作物的花粉貯藏，因此對提高農作物的雜交育種制種結實率開辟了新的途徑，并為農作物花粉庫的建立打下了堅實的基礎。權利要求1.一種與雜交制種技術配套的農作物花粉貯藏方法，其特征在于將采集的花粉置于下列條件下貯藏(1)花粉短期貯藏的貯藏溫度為0—5℃，長期貯藏時，貯藏溫度為-196℃，(2)、濕度控制，花粉短期貯藏時，濕度為30—35％，長期貯藏的濕度為25～30％。(3)、避光貯藏，離開花藥的花粉必須立即置于絕對黑暗中避光貯藏直至使用。(4)、貯藏時使用1—5ppm的放線菌素(Actinomycin)0用作花粉呼吸抑制劑，(5)、貯藏時花粉層厚度控制在5mm以下。2.按權利要求1所述的農作物花粉貯藏方法，其特征在于超低溫度中長期貯藏的花粉在貯藏前需預冷處理，即先將花粉置于0℃溫度條件下1—2小時，再置于-80℃條件下3—4小時，最后再進入超低溫貯藏。3.按權利要求1、2所述的農作物花粉貯藏方法，其特征在于超低溫長期貯藏時，用2—5％DMSO4(二甲基亞礬)或5％的葡萄糖+2—5％DMSO4作防凍劑。4.一種專門用于貯藏花粉育性檢測的方法，其特征在于采用的人工萌發培養配方為淀粉0.05g/ml蔗糖40～50％MnSO48～10-5瓊脂0.5～1.0％H3Bo350～100ppmPH56～6.0全文摘要農作物花粉的貯藏方法涉及作物的栽培方法，尤其是作物的雜交育種、制種方法。本發明提出的花粉貯藏技術是將采集的花粉置于低溫和超低溫度中黑暗條件下貯藏，并控制貯藏濕度在25～35％，貯藏時使用花粉呼吸抑制劑放線菌素0，并控制好貯藏花粉厚度在5mm以下，在超低溫中長期貯藏的花粉在貯藏前應進行預冷處理，貯藏時使用DMSO文檔編號A01H1/02GK1118650SQ9411116公開日1996年3月20日申請日期1994年9月15日優先權日1994年9月15日發明者周廣洽,李訓貞,譚周镃,陳良碧申請人:湖南師范大學