專利名稱：作物無融合生殖誘導劑的制作方法
技術領域：
本發明是屬于一種誘導作物無融合生殖的化學藥劑。
目前國內外所使用的化學無融合生殖誘導劑，一般誘導頻率低，并且具有毒性，所以沒有實用價值。據調查，國內外還沒有這種作物無融合生殖誘導劑。
本發明的目的是為提供一種誘導頻率高，而且沒有毒性，同時具有廣譜性，可用于各種作物誘導產生無融合生殖材料的作物無融合生殖誘導劑。
下面對本發明予以詳細說明，所提出的作物無融合生殖誘導劑，從1988年開始，經過5年的實踐，找到了一種無毒化學無融合生殖誘導劑，具有使各種作物產生無融合生殖材料，該誘導劑暫定為TAM，它是利用各種植物生長刺激素，按配方配制而成的，其組成是由滲透劑二甲基亞砜粘著劑茶籽皂素、乳化劑吐溫80、細胞伸長劑赤霉素、生長素抑制劑順丁烯二酰肼、光和作用增強劑三十烷醇和乙烯生成阻止劑氨氧基乙酸。通過多年實踐摸索，其組成比例為滲透劑二甲基亞砜0.2～1%、粘著劑茶籽皂素0.25～0.5%、乳化劑吐溫80為0.25～0.5%、細胞伸長劑赤霉素0.002～0.005%、生長素抑制劑順丁烯二酰肼0.004～0.01%、光和作用增強劑三十烷醇0.004～0.008%、乙烯生成阻止劑氨氧基乙酸0.006～0.01%、水99.284～93.867%。
無融合生殖誘導劑TAM的配制工藝是先將配方中光合作用增強劑三十烷醇用少量無水乙醇加熱溶解后，加入吐溫80再加熱混溶，用適量水稀釋繼續加熱混合均勻，然后加入組成中的其它成份，最后使無融合生殖誘導劑TAM中各成份比例達到如下濃度范圍滲透劑二甲基亞砜0.2～1%、粘著劑茶籽皂素300～600PPm、乳化劑吐溫80為400～800PPm、細胞伸長劑赤霉素20～50PPm、生長素抑制劑順丁烯二酰肼40～100PPm、乙烯生成阻止劑氨氧基乙酸60～100PPm、光和作用增強劑三十烷醇40～80PPm。配方的配心即主要成份是順丁烯二酰肼和氨氧基乙酸，當生長素抑制劑順丁烯二酰肼濃度增加時，植株生殖器官中的吲哚乙酸含量減少，而乙烯生成阻止劑氨氧基乙酸減少時，植株生殖器官中的脫落酸含量增加，由于植株內源生長素的平衡失調，導致植物發生無融合生殖。
利用無毒化學無融合生殖誘導劑TAM在水稻抽穗揚花時，將稻穗用溫水殺雄后，用諉導劑TAM浸漬1分鐘，待藥液涼干后用透明紙套裝，經過10天可使稻穗花穗胚珠胞原細胞發育成胚，次生極核不通過受精能發育形成胚乳，誘導頻率高達10%以上。
本發明與現有(當前)技術相比所具有的優點本發明所用藥劑是無毒的，利用組成中各種植物生長刺激素相互配合，調控植株體中的新陳代謝，促使在植物生殖器官中生長刺激素平衡失調，諉導產生無融合生殖作用，其諉導頻率較高，可用于生產實踐。
實施例水稻在抽穗揚花期，用溫水殺雄，將去雄后的稻穗用無毒化學諉導劑TAM浸漬1分鐘，套上透明袋，10天后取袋，穎花可以結實，結實率為4～11%，通過細胞胚胎學觀察，無毒化學諉導劑TAM處理水稻可諉導產生無融合生殖，胚是由胚珠胞原細胞發育形成，胚乳是由次生極核不通過受精發育形成的，即無融合生殖。下面對發明的研究、應用和實施作進一步地加以詳細說明。
現已篩選出無毒無融合生殖諉導劑TAM。水稻經溫水殺雄用TAM處理并套袋，去雄后的雌蕊能結實，結實率為4～11%，見表一。
表一諉導劑TAM處理不同水稻品種的結實率
從表一可見，TAM諉導劑諉導水稻去雄雌蕊結實的特性，即無融合生殖特性。
一、無融合生殖諉導劑TAM的篩選我們共研制六種無融合生殖諉導劑，這六種諉導劑的代號為HWHTAM、HWTAM、WHTAM、HTAM和TAM現將這六種諉導劑對水稻諉導無融合生殖的結果列于表二。
表二不同諉導劑對水稻諉導結實的對比
從表二可見，諉導劑HWTAM和TAM諉導率較高，由于HWTAM成本高，為此我們選用TAM作為水稻無融合生殖諉導劑。
二、諉導劑TAM諉導無融合生殖，處理時期是關鍵。1990年改進配方和施用時期，諉導率提高到10%以上。無融合生殖諉導劑在不同時期處理水稻的諉導頻率列于表三。
表三諉導劑TAM在不同時期處理水稻的諉導結實率
從表三可見，諉導劑TAM諉導水稻產生無融合生殖，導導劑的處理時期應在胚珠處于孢原細胞時期，諉導水稻產生無融合生殖的頻率較高。
三、諉導劑TAM諉導V優46F1無融合生殖的經過及其特性1989年8月15日在湖南農學院和湖南桃江，用無融合生殖諉導劑處理雜交稻V優46F1，經溫水殺雄，TAM諉導劑諉導后套袋，去雄后的雄蕊能結實，共獲得35粒種子，1990年將獲得的種子播種繁殖，保持V優46F1性狀的有30株，分別收集種子于1991年按單株播種繁殖，F2出現了少量分離現象，我們從中篩選出保持或增強的V優46F1性狀的株系，1992年在湖南桃江播種繁殖，從F1代中已篩選出保持或增強V優46F1性狀的四個品系，1992年通過細胞胚胎學觀察，用TAM諉導劑處理V優46F1，能諉導胚珠原細胞發育成胚，次生極核未受精能發育形成胚乳。因此TAM諉導劑能諉導出無融合生殖材料。
四、諉導劑TAM諉導V20A無融合生殖的經過及其特性1989年8月15日在湖南桃江，利用TAM諉導劑處理完全不育的V20A不育系，經溫水殺雄后用TAM諉導并套袋，結實率見表四。1990年將89年經諉導處理所獲得的39粒種子播種繁殖，選擇適當株號穗套袋隔離觀察結實情況見表五。1991年將V20A諉導結實的種子混收，于1992年播種繁殖，通過壓片、切片鏡檢，花粉粒仍完全不育，但能無融合生殖。
表四諉導劑TAM處理V20A的諉導結實率
表五 V20AF1隔離結實率
1992年通過細胞胚胎學觀察，用TAM諉導劑處理雄性不育系V20A能諉導胚珠孢原細胞發育成種子，并具有遺傳特性。
在此值得提出的是，經89年諉導處理所獲得的39粒種子，于1990年播種繁殖時，從中發現一株突變株，分葉力特別強，結實率達60.5%。1992年將所獲得的種子單株播種繁殖，F3代的結實率高達94.5%。1992年通過顯微切片觀察，花粉變成完全可育，目前這株突變株，經F3代繁殖已培育成五個穩定的優良性狀品系。
1992年6月15日，我們把上一年種植入選的材料，在桃江播種，7月18日至19日移栽入大田，按4×6寸密度單本移植，選出了有發展前景的品系10個，列表說明如下表六大田初選株系考種復選及決選結果
表七入選株系性狀比較表
從表七可以看出，在以上比較項目中與CK(V46F1)相同的有PF325PF331兩個株系。而PF307、PF313、HF311等株系除在分蘗能力、穗粒結構和成熟期上同CK存在一定差異外，其它性狀不存在明顯差異。由V20A經諉導獲得的變異株系，HF333、HF336、HF337在株高方面存在優勢。HF333在分蘗力、主穗長、穗粒數、粒長/寬等方面較V46有明顯優勢，且米質優，莖桿粗壯，抗倒伏，并在成熟期上有所提早。而HF336、HF337除成熟期延后、千粒重有所降低外，其它性狀都與V46比較接近。
五、無融合生殖的細胞胚胎學初步觀察1992年我們對上述水稻無融合生殖材料，用石蠟制片法、壓碎法，進行細胞胚胎學的初步觀察，試圖從細胞胚胎學角度來弄清無融合生殖的機制，以及TAM諉導劑對稻株的影響。現將觀察結果分述如下(一)對不育系V20A材料的觀察
1.經溫水去雄后，用TAM諉導劑處理并套袋的穎花，其雌蕊柱頭腺毛增多，子房逐漸長大發育成穎果。
2.當雌蕊在穎Q花內并為穎花長度的三分之一時，雌蕊珠心中已產生孢原細胞，經TAM處理并套袋，在成熟的胚囊中，助細胞消失最早，卵細胞經分裂，發育成球形胚，進而發育呈梨形胚，然后在頂端朝外形成舌狀體繼而向內外側分別產生盾片和外胚葉。隨著胚體長大，胚芽鞘、胚芽、胚根鞘和胚根相繼形成，最后成長為成熟的胚。從孢原細胞出現到成熟胚的形成，約需10天時間。
胚乳的發育極核在胚囊中位置常不定，未受精的兩個極核比較靠近，以后核膜融解，核質融合，隨后二核仁融合，成為次生極核，隨胚囊發育長大，珠心組織逐漸消失，次生極核進行有絲分裂，形成多數游離極核，并由胚囊內四周逐漸向中央形成胚乳細胞。從子房壁的結構來看，果皮和種皮的發育都正常。
成熟胚囊的反足細胞，常由胚囊的合點端移到胚囊的側壁，并分裂成4～6個細胞的反足組織，造成位移和分裂的直接原因，可能與供應胚囊發育的營養物質是從合點進入有關。此后反足組織停止發育，直至胚體各部形成，反足組織才消失。
3.雄性不育系V20A經TAM諉導劑處理后，所得無融合生殖的子代經壓片、切片鏡檢，其花粉粒仍為完全不育，但經TAM處理后，所產生的V20A突變株F3，經壓片、切片鏡檢，其花藥發育正常，花粉粒已完全恢復了可育。
(二)對V46材料的觀察用TAM諉導劑，用同樣的方法，處理雜交稻V46，經切片觀察，未受精的卵細胞能發育成胚，未受精極核能發育成胚乳，與上述情況基本相同。所不同的V46的孢原細胞和胚體均比V20A的要小些，成熟的胚也有這種現象，這可能與品種間的差別有關。
綜合上述，我們初步認為TAM諉導劑可將水稻孢原細胞不經減數分裂過程，直接發育成二倍體胚囊。一方面是由于在我們研究的幼嫩材料，尚未發育孢原細胞有減數分裂過程，另一方面是正當小穗處于孢原細胞時期，用TAM諉導劑處理小穗，其無融合生殖率達10.5%，如為二倍體孢子無融生殖，即所形成胚是二倍體，胚乳是四倍體，這樣所得后代生活力更強，對育種工作將具有戰略性的重要意義。
權利要求
1.一種作物無融合生殖諉導劑，其特征在于它是利用植物生長刺激素按配方配制而成的，在其組成是由滲透劑二甲基亞、粘著劑茶籽皂素、乳化劑吐溫80、細胞生長劑赤霉素、生長素抑制劑順丁烯二酰肼、光合作用增強劑三十烷醇和乙烯生成阻止劑氨氧基乙酸，在其組成的比例滲透劑二甲基亞為0.2～1%、粘著劑茶籽皂素0.25～0.5%、乳化劑吐溫80為0.25～0.5%、細胞伸長劑赤霉素為0.002～0.005%、生長素抑制劑順丁烯二酰肼為0.004～0.01%、光合作用增強劑三十烷醇0.004～0.008%、乙烯生成阻止劑氨氧基乙酸0.006～0.01%、水為99.284～93.867%。
2.據權利要求1所述的作物無融合生殖諉導劑，其特征在于組成中各成份的比例濃度范圍滲透劑二甲基亞為0.2～1%、粘著劑茶籽皂素為300～600PPm、乳化劑吐溫80為400～800PPm、細胞伸長劑赤霉素為20～50PPm、生長抑制劑順丁烯二酰肼為40～100PPm、乙烯生成阻止劑氨氧基乙酸為60～100PPm、光合作用增強劑三十烷醇為40～80PPm。
全文摘要
一種作物無融合生殖誘導劑，它是利用植物生長刺激素，即二甲基亞、茶籽皂素、吐溫80、赤霉素、順丁烯二酰肼、三十烷醇和氨氧基乙酸、按配方配制而成的。這種作物無融合生殖誘導劑是無毒的，利用組成中各種植物生長刺激素相配合，調控植株體中的新陳代謝，促使在植物生殖器官中生長刺激素平衡失調，誘導產生無融合生殖作用，且誘導頻率高，同時具有很大的經濟與社會效益。
文檔編號A01P21/00GK1091592SQ9311060
公開日1994年9月7日 申請日期1993年3月5日 優先權日1993年3月5日
發明者唐明遠, 胡久清, 陳守泉, 莫壽康, 潘覺知 申請人:渤海桃江縣科學技術委員會