動態導入外源遺傳物質獲得雜交生物的方法

            文檔序號:100811閱讀:738來源:國知局
            專利名稱:動態導入外源遺傳物質獲得雜交生物的方法
            本發明是關于通過外源遺傳物質動態導入法獲得遠緣雜交生物,特別是獲得遠緣雜交植物的方法。
            本發明的方法采用植物分生細胞或人工脫分化的細胞作為受體細胞,將純化的或未純化的外源遺傳物質導入上述受體細胞,然后利用植物活體組織培養技術,也就是通過適當處理使植物分生細胞在植物體或部分器官組織上迅速萌芽,從而通過另外處理使該芽枝發根的技術,或輔以已有的離體組織培養技術,迅速獲得雜交生物。
            在為獲得遠緣雜交生物的現有技術中,有較為新穎的技術,譬如植物細胞融合技術,通過某些處理,使兩種不同植物的去壁原生質體融合,然后通過植物離體組織培養技術,使融合細胞產生體細胞雜種。但上述過程需要無菌操作,并且由于植物體細胞雜交的不親和性,至今無法獲得科間的雜交植物,并且僅能在少數植物,例如不同種的煙草及矮牽牛屬的某些植物中進行。另外,將目標基因與載體質粒聯結后轉入微生物細胞,也能使該微生物產生與目標基因相關的蛋白質,國內外將這種單基因工程的方法移植在高等生物的遺傳工程中,至今效果甚微。因為高等生物的遺傳機制高度復雜,高等生物的性狀特別是與經濟利益有關的性狀,絕大多數是由不同的多基因系統決定的,顯然用單基因工程的技術使高等生物具有外源多基因系統決定的性狀是難能實現的。此外,向植物或動物的生殖細胞微注射外源DNA溶液,試圖獲得新性狀動植物的研究也有所報導,但是由于這一方法采用的受體細胞是生殖細胞,實驗材料有一定的局限性,而且獲得雜交生物的速度比輔以活體組織培養技術獲得雜交生物的速度慢得多。因此,目前來說,采用該方法還無法普遍獲得各種性狀明顯改變的遠緣雜交生物。如果向動物的去核生殖細胞植入另一種動物的細胞核,也有可能獲得雜交生物,但是該技術也較難克服不同種屬生物的不親和性,至今尚未超越科間雜交的界限,僅在少數兩棲類動物例如蛙類中或魚類例如鯽魚與鯉魚的雜交中取得成功。
            本發明人發現,采用外源遺傳物質動態導入法向特定狀態的植物體細胞(分生細胞)導入外源遺傳物質,可以明顯克服遠緣雜交不親和性的困難,能實現綱間(例如大蒜-青菜,胡蔥-青菜等)、門間(例如羅漢松-青菜,見照片)甚至界間(例如能表達噬菌體(入)蛋白質的甘藍)的生物雜交。受體細胞在導入外源遺傳物質后,由于采用活體組織培養技術,因而不需要調換培養基,僅需幾個星期就能簡便地獲得具有明顯新性狀的雜交個體。
            本發明提供的遠緣雜交方法的基本實施例過程是,首先對某受體植物采取一定措施,例如去頂、摘心或部分摘心(圖1A)等,使植物體上的某些分生細胞,例如腋部的分生細胞處于劇烈分化的狀態;然后馬上用利刃在上述受體細胞附近處切開一縫(圖1B),但不可損傷分生細胞;同時將供體例如上下面通過人工損傷的葉片或葉柄薄片或莖段薄片等插入上述切縫處,如結合不夠緊密,可用塑料絲帶縛緊,但不可堵住腋芽發生部位(圖1C)。然后,將此植株移至陰涼處或造成一個陰涼的環境,這時發生如下過程供體細胞內的遺傳物質通過穿壁運動導入受體細胞并馬上與分生細胞內的DNA得以重組。幾天后,腋部分生細胞萌生出芽點(圖1D),即可移至光照正常的環境。待該芽點長出4至5張葉片時,可用剪刀著基部剪下,然后使其發根,成為完整植株,移至大田種植即可。如果再將該雜交植物的葉片或莖段配合采用常規的離體組織培養,可獲得大量雜交植物。前述綱間與門間雜交植物就是用如圖1所示的方法獲得的。
            與現有的有性雜交技術相比,本發明的特點能克服不同種屬的植物難以授精雜交的困難;與現有的嫁接技術相比,本發明采用植物分生細胞作為受體細胞,對于供體來說,只要它完成提供外源遺傳物質的作用而不必考慮它的成活問題。因此非但可以克服不同種屬植物嫁接不親和性的困難,而且能高效快速改變受體細胞的遺傳控制,與現有的植物細胞融合技術相比,本發明不是通過細胞融合而是通過外源遺傳物質的導入實現基因雜交,不是通過原生質體的組織培養而是通過分生細胞的活體組織培養獲得雜交植物,因此既能克服不同種屬細胞難以融合雜交成功的困難又能經濟簡捷地獲得雜交植物;與現有的DNA微注射技術相比,本發明利用植物自身的穿壁運動與細胞間的各種通道向體細胞(分生細胞)導入未純化或純化的遺傳物質,甚至可將以自然狀態存在于供體細胞內的DNA導入受體細胞,因此適用范圍廣。加之將分生細胞作為受體細胞,因此雜交成功率高。
            本發明的第二個實施方法是,如果在植物去頂后的界面,從上向下沿中髓向下挖一孔穴,并通過這個孔穴向分生細胞導入各種形式存在的DNA(圖2),本發明人曾獲得的(入)蛋白-甘藍就是按圖2方法獲得的(參見“世界科學”1986年第1期p.1-5);或者,第三個實施方法是不挖孔穴,而將吸水性強的中性薄膜作為載體插入受體細胞附近的切縫處,通過滴在薄膜上的各種形式存在的DNA向受體細胞導入外源基因(圖3)。按圖3的方法,向甘藍分生細胞導入青菜DNA和葉用甜菜DNA(均存在于葉、莖汁液中),也能得到雜交植物。因此,與現有的基因體外重組技術相比,本發明雖然也可以將目標基因與載體作為外源基因,但是也可以不必獲取目標基因與載體,直接向活體植物或活體植物的某些器官組織的分生細胞導入各種形式存在的遺傳物質,例如各種DNA溶液、各種生物器官組織的汁液以及包括以自然狀態存在于生命細胞內的DNA等各種類型的遺傳物質,簡捷地獲得各種類型的新植物。另外,與現有的所有雜交技術相比,本發明獲得雜交植物的時間最短,一般僅需幾周就可以,并且成本最低廉,設備最簡單,既可以被普通人員普遍采用又可以成為專家學者手中進行遺傳工程和探索生命本質的手段。
            本發明按照不同的情況,可作出相應的許多變更和變化。例如,按圖4的第四個實施方法,可將兩種植物的遺傳物質進行雙向導入。在這個實施方法中,供體與受體是相對的,也就是說受體可以從供體中獲得遺傳物質,也可以向供體反過來導入受體自己的遺傳物質,使供體本身所有的分生細胞也產生基因雜交。圖4所示的實施方法特別適用于獲得既作供體又作受體的雜交植物或者向細軟莖段的植物導入外源遺傳物質,例如,青菜-馬蘭就是這樣獲得的(《中國科學》,印刷中)。
            圖5所示的第五個實施方法,是將包含分生細胞的植物莖段浸在含有DNA的溶液或汁液的各種遺傳物質中,幾天后,這些分生細胞萌芽,待芽稍大,可將芽連莖枝著基部剪下發根,就獲得完整的雜交植株。或者將該植物莖段浸在營養液中,然后用本發明的其他實施方法在它的分生細胞附近導入各種遺傳物質。例如,用圖5所示的方法可以將(入)DNA導入甘藍體細胞。
            又例如,按圖6所示的第六個實施方法,可直接向植物頂端的分生細胞導入外源遺傳物質,往往能獲得變異強烈的雜交植物,本發明人獲得的大蒜-青菜,玉米-青菜(見照片)就是按圖6所示的方法實施成功的。這個實施例特別適用于腋部分生細胞難于分化出芽或者太易分化出芽(即不經去頂就見腋芽萌生)的植物,還適用于生長期不適宜獲取腋芽的植物。
            另外,本發明可以在分生細胞導入外源的遺傳物質后,馬上將含分生細胞的器官組織塊進行離體組織培養,獲得大量的雜交植物。
            本發明的方法,對于具有特殊形狀的植物器官,例如,馬鈴薯塊莖,在外源遺傳物質的導入實驗中,其方法可作相應的改變。例如將具有分生細胞的該器官切成小塊或者去除表皮后浸在含有外源DNA的溶液中,又例如將含有外源遺傳物質的中性薄膜敷貼在估計能發生分生細胞變異芽的部位進行外源基因的導入,也能夠獲得雜交植物。
            本發明的方法,對于不屬于分生細胞但經適當處理產生的脫分化細胞也是適用的。例如圖7所示甘薯塊根,經機械切割可促使塊根上的某些細胞脫分化,從而使其具有分生能力。對這些具有分生能力的細胞導入外源DNA也能獲得雜交植物。當然,敷貼含有外源DNA的中性薄膜也可實施。
            本發明的技術方法,對于單子葉植物,例如水稻,向第一分蘗節的分生細胞或其它富有分生細胞的部位導入外源遺傳物質,也可迅速獲取各種類型的雜交植物。對于高大的果樹或喬木,可將分枝條剪下插在營養液里,當然也可不剪下,直接在分枝上或頂芽直接實施本發明的方法。
            附圖的簡要說明如下圖1表示本發明方法的基本實施例,其中,圖1A表示受體的去頂;圖1B表示受體的切縫;圖1C表示供體的插入與外源遺傳物質的導入,圖1D表示腋部分生細胞的萌芽-即為雜交植物。
            圖2表示本發明方法的第二實施例,在植物分生細胞附近去頂后的界面從上向下挖的孔穴中導入外源DNA。
            圖3表示本發明方法的第三個實施例,用吸水性強的中性薄膜作為載體插入受體細胞附近的切縫處,以導入DNA。
            圖4表示本發明方法的第四個實施例,兩種植物的遺傳物質的雙向導入。
            圖5表示本發明方法的第五個實施例,將包含分生細胞的植物莖段浸在含有DNA的液體中,或者浸在營養液中實施本發明的其他方法以導入各種遺傳物質。
            圖6表示本發明方法的第六個實施例,直接向植物頂端的分生細胞導入外源遺傳物質。
            圖7表示本發明方法的第七個實施例,通過機械切割,促使甘薯塊根的某些細胞脫分化,然后將上述切塊浸入含有各種外源DNA的溶液中,即可進行雜交。
            本發明已通過上述附圖和實施例的描述詳細公開了本發明的內容,這謹是為了說明本發明而不是對本發明加以任何限制。可以理解的是,對于那些本技術領域
            中的科學技術人員來說,可以作出許多改換和變更而不偏離本發明權利要求
            書所確定的本發明的特征和保護范圍。
            權利要求
            1.動態導入外源遺傳物質而獲得雜交生物的方法,特別是獲得遠緣雜交植物的方法,其特征在于,采用受體植物分生細胞或人工脫分化的細胞作為受體細胞,將純化的或未純化的外源遺傳物質導入上述受體細胞,然后使上述已導入外源遺傳物質的受體細胞通過活體組織培養或者離體組織培養,從而迅速獲得雜交生物。
            2.按照權利要求
            1的方法,其進一步特征在于,所述的植物分生細胞在導入外源遺傳物質之前是處于尚未萌芽但卻是劇烈分化的狀態。
            3.按照權利要求
            2的方法,其進一步特征在于,所述的植物分生細胞其劇烈分化狀態是通過一定措施,例如去頂、摘心或部分摘心等造成的。
            4.按照權利要求
            1的方法,其進一步特征在于,所述的純化或未純化的外源遺傳物質是選自各種DNA溶液、各種生物器官組織的汁液以及以自然狀態存在于生命細胞內的DNA等各種類型的遺傳物質。
            5.按照權利要求
            4的方法,其進一步特征在于,所述的各種生物器官組織的汁液是由供體植物的葉片或葉柄薄片或根、莖段薄片或其他部位的組織產生的,也包括動物器官組織的汁液或微生物含有其DNA的內含物。
            6.按照權利要求
            1的方法,其進一步特征在于,所述的外源遺傳物質的導入是在受體細胞附近的切縫界面處向分生細胞導入的。
            7.按照權利要求
            6的方法,其進一步特征在于,所述的在受體細胞附近切縫處進行外源遺傳物質的導入,是用人工損傷的供體植物的葉片或葉柄薄片或莖段薄片或枝條等插入上述切縫處產生的。
            8.按照權利要求
            6的方法,其進一步特征在于,所述的在受體細胞附近切縫處進行外源遺傳物質的導入,是用吸水性強的中性多孔物質作為載體,插入上述切縫處,然后在上述載體上滴以純化的或未純化的外源遺傳物質而產生的。
            9.按照權利要求
            8的方法,其進一步特征在于,所述的在上述切縫處滴入的外源遺傳物質是選自各種DNA溶液、各種生物器官組織的汁液以及以自然狀態存在于生命細胞內的DNA等各種類型的遺傳物質。
            10.按照權利要求
            3的方法,其進一步特征在于,所述的外源遺傳物質的導入,是在受體細胞附近的去頂界面,從上向下沿中髓向下挖一孔穴,并且向上述孔穴中滴入純化的或未純化的外源遺傳物質而產生的。
            11.按照權利要求
            10的方法,其進一步特征在于,所述的在上述孔穴中滴入的外源遺傳物質是選自各種DNA溶液、各種生物器官組織的汁液以及以自然狀態存在于生命細胞內的DNA等各種類型的遺傳物質。
            12.按照權利要求
            7的方法,其進一步特征在于,所述的人工損傷的枝條的插入是用帶有分生細胞的枝條,插入受體細胞附近的切縫處,發生遺傳物質的雙向相互導入,從而獲得受體與供休、供體與受體雙雜交的植物。
            13.按照權利要求
            1的方法,其進一步特征在于,所述的受體是高大的喬木,可將其帶有分生細胞的分枝短條剪下,插在含有外源遺傳物質的溶液中進行外源遺傳物質的導入,或者將上述分枝條插在營養液里,然后進行動態導入外源遺傳物質。
            14.按照權利要求
            13的方法,其進一步特征在于,所述的分枝條插在營養液里進行外源遺傳物質的動態導入,是在其分生細胞附近切口的切縫處產生的。
            15.按照權利要求
            13的方法,其進一步特征在于,所述的分枝條插在營養液里進行外源遺傳物質的動態導入,是在其分生細胞附近去頂界面從上向下沿中髓向下挖一孔穴,并且向上述孔穴中滴入純化的或未純化的外源遺傳物質而產生的。
            16.按照權利要求
            13、14或15的方法,其進一步特征在于,所述的外源遺傳物質是選自各種DNA溶液、各種生物器官組織的汁液以及以自然狀態存在于生命細胞內的DNA等各種類型的遺傳物質。
            17.按照權利要求
            1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的方法,其進一步特征在于,所述的受體植物是單子葉植物,向其第一分蘗節或其他富有分生細胞部位的分生細胞導入外源遺傳物質,可迅速獲得各種類型的雜交植物。
            18.按照權利要求
            17的方法,其進一步特征在于,其中所述的受體單子葉植物是水稻,則向其第一分蘗節的分生細胞導入外源遺傳物質,可迅速獲得各種類型的雜交植物。
            19.按照權利要求
            1的方法,其進一步特征在于,其中所述的分生細胞在特殊形狀的器官上,則將具有分生細胞的器官切成小塊或將去除表皮的器官浸在含有外源DNA的溶液中,或者將含有外源遺傳物質的中性薄膜敷貼在估計能發生變異芽的部位,進行外源基因的導入,也可獲得各種類型的雜交生物。
            20.按照權利要求
            19的方法,其進一步特征在于,其中所述的具有分生細胞的受體植物器官是馬鈴薯塊莖。
            21.按照權利要求
            1的方法,其進一步特征在于,其中所述的人工脫分化的細胞是指本不是分生細胞,但經適當處理例如機械切割,可促使某些細胞脫分化,從而具有分生能力,例如向甘薯塊根的切塊導入外源DNA,也能獲得雜交植物。
            專利摘要
            一種通過外源遺傳物質動態導入法獲得遠緣雜交生物,特別是獲得遠緣雜交植物的方法。采用植物分生細胞或人工脫分化的細胞作為受體細胞,將純化的或未純化的外源遺傳物質導入上述受體細胞,然后利用植物活體組織培養技術,也就是通過適當處理使植物分生細胞在植物體或部分器官組織上迅速萌芽,從而通過另外處理使該芽枝發根或者輔以已有的離體組織培養技術而迅速獲得雜交生物。例如,青菜-馬蘭;大蒜-青菜;羅漢松-青菜等等。
            文檔編號A01H1/02GK86105147SQ86105147
            公開日1987年1月14日 申請日期1986年8月11日
            發明者朱培坤 申請人:朱培坤導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
            網友詢問留言 已有1條留言
            • 訪客 來自[中國] 2022年01月30日 01:17
              朱培坤發明
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