專利名稱：大量生產無類病毒和病毒馬鈴薯繁殖材料的方法
技術領域：
本發明涉及通過植物組織培養，大量繁殖無類病毒、無病毒馬鈴薯的方法。
馬鈴薯(solanumtuberosum)是一種基本食物。為了提高其繁殖力、抗病力以及對于環境的適應力，曾做過大量的實驗和實際工作。盡管如此，但至今還沒有獲得抗各種重要病害，同時具有其它優良特性的栽培品種。
盡管也能產生雙倍體和單倍體馬鈴薯品系(Houglas，R.W.，Ploquin，S.J.，GabertA.C.Effectofseedparentandpollinatoronfrequencyofhaploidsinsolanumtuberosum.Crop.Sci.4.593-595.(1964))，但是大多數的馬鈴薯栽培品種都可分為四倍體馬鈴薯亞種(Howard，H.W.Geneticsofthepotato(Solanumtuberosum)，LogosPress，London(1970)126.P.)。
一般認為，為了得到最大繁殖力和生長率，馬鈴薯一定是雜合體。然而，利用同系配合減少等位基因間的雜合體特性，馬鈴薯苗的生長率卻明顯降低。
由于一些國家的生態條件，不能長期保存無病害的不同馬鈴薯栽培品種。因此，改良的目標就是利用野生的抗性品種作雜交材料，培殖出抗逆境，抗病原體的栽培品種。
但是，抗性的提高有限，因為對于馬鈴薯來說，所謂的“一步”傳統法不行(使用這種方法獲得新的所希望的特性也可通過保存其它有利特性產生)。
已經研究出幾種方法，體外營養繁殖馬鈴薯，如Roca，W.M.Esponoza，N.O.，Roca，M.R.、和Bryan，J.E.等的“迅速繁殖馬鈴薯的組織培養方法”(AmPotatoJ.55.691-701(1978));Goodwin，P.B.，Kim，Y.C.、Adisarwanto.T等的“利用莖尖培養繁殖馬鈴薯”(PotatoRes.23，9-23(1980));Roest.S.和Bokelmann的“用于馬鈴薯(Slanumtuberosum)的營養繁殖和誘變育種的體外不定芽技術Ⅰ，通過形成不定枝在體外進行營養繁殖”(Potato.Res.23.167-181(1980);Hussey.G和Stacey.N.J.的“馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)的體外繁殖”(Ann.Bot.48.787-796(1981);Henszky.L.E.、Enyingi.K和SzaboⅠ等的“馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)種質的長期保藏和繁殖的組織培養技術”(PlantCellCultureinCrop.ImprovementS.K.Sen，K.L.Gilesad.，PlenumPress，NewYork，London，(1983)9～18)。
這些方法基本上被推薦用來繁殖無病毒馬鈴薯品系。除了篩選外，還有另一種可供選擇的可能性，即分離病毒感染的植株的分生組織細胞，并進行體外培養，生產無病毒品系(Morel，G.，MullerJ.F.Lacultureinvitroduméristémeapicaledelapommedeterre;Compt.REnd.258.5250-5252(1964);Mellor，R.C.Stace-Smith，RVirus-freepotatoesbytissueculture，“AppliedandFundamentalAspectsofPlantCell，TissueandOrganCulture”，edit.ReinertJ.andBajajY.P.S.，Springer-Verlag，Berlin-NewYork，(1977)615-637;Faccioli，G.;Rubies-Autonell，CPVXandPVYdistributioninPotatomeristem-tipsandtheireradicationbytheuseofthermotherapyandmeristem-tipculture，Phytopeth.Z.103，66-76(1982))。其原因是，由于某些生化過程的結果至今可以部分解釋植物的分生組織細胞無病毒感染。
通過分生組織培養除去病毒和在體外進行營養繁殖是廣泛使用的保藏馬鈴薯種的普遍方法。體外生產小的馬鈴薯，即所謂馬鈴薯微塊莖，也是一種已知方法(AmericanPotatoJournal59.33-37.(1982))。
在體外產生的馬鈴薯小植株的進一步栽培，可在暖房進行。用繁殖無病毒的母株進行單芽扦插也被廣泛使用(Sunarjono，H.，Krisnawati，Y.PotatoseedmultiplicationbystemcuttingI.Theinfluenceofthemotherplantageonthegrowthandyieldofthecutting.Bull.Penel，Hort.8(2)39-47(1980);Goodwin，P.B.，Brown，G.Fieldperformanceofpotatoshoot-tipsproliferatedinculture.PotatoRes.23，449-452(1980);Goodwin，P.B.Rapidpropagationofpotatobysinglenodecuttings，Fieldcrops，Res.4，165-173(1981))。
為了通過組織培養產生馬鈴薯無性繁殖材料盡管做了各種努力，但仍沒有解決大量而又經濟效益地的生產馬鈴薯的問題。雖然有些部分結果有價值，但至今還沒有得到一種綜合系統，能夠成功地用于大規模生產一種適宜的馬鈴薯繁殖材料，能夠提供一種解決辦法，生產不同的繁殖材料(即生根插條、微塊莖，或小塊莖)的需要。
現已發現，也是本發明的目的，通過下列組織培養的方法可以大量地生產無類病毒(和病毒)的馬鈴薯繁殖材料(即生根插條，微塊莖和/或小塊莖)分離發芽的馬鈴薯分生組織細胞(苗端組織)，將這種分離出來的無類病毒和病毒的部分分開，培養在營養劑上，直至長出6～8個芽，不久它就會在營養劑中生根，或在芽上誘導發出微莖塊;將體外生根的植株轉移到花房，在此，作為割離的分生組織株系，將成為母本植物，或者，再次在體外生根的植株上誘發出微塊莖，再從這些微塊莖，從這些母株苗，或小塊莖獲得母本植株作為繁殖材料。或者用微塊莖作繁殖材料，用影響母本植株的塊莖素(patatin)合成導至幼苗或塊莖的形成。
本發明所列舉的方法可以應用，大量生產有經濟效益的馬鈴薯繁殖材料，并且適于常年穩定供應繁殖材料。
分離分生組織細胞、培養和繁殖幼苗、生根以及微塊莖的形成都是在實驗室條件下進行的。從生根植物培養母本植株在花房中進行。從母本植株培養籽苗或小塊莖在無媒介環境條件下在花房或試驗田中進行。
按照本發明的第一步就是選擇無病毒和類病毒的馬鈴薯品系。
在同樣的栽培品種的馬鈴薯塊莖上，可用例如赤霉素來誘導芽形成，然后將它放置在一個無光照的氣侯箱中，該塊莖將會發芽。大約三周以后，從5～10厘米長的芽上消毒條件下分離0.2～0.3毫米的芽尖。將所分離的芽尖一個一個繁殖在無菌營養劑中。這樣每一個分生細胞將被作為一個單獨的品系被處理和繁殖。除去病毒和類病毒的每一繁殖品系可用病毒學試驗方法，即酶免疫測定(EIA)檢驗(J.gen.Virol.33.165-167(1976);RevueSuisseAgric.11.253-265(1979);J.gen.Virol.34.475-483(1977);Noevényvédelem15(8)，354-358(1979);Phytopath.Z.90.364-368(1977);Phytopath.67.145-150(1977)。
為了長期繁殖，只有那些無各種馬鈴薯病毒和類病毒的分生組織品系可被使用。在開始體外繁殖后，可以用此方法達到幾次檢驗無病毒的株系。
將經過滿意檢定和選擇的分生組織培養在有營養物的Wassermann試管中，直到長有6～8個芽。營養劑的組成如下MS大成分二分之一濃度MS小成分Inozit100毫克/升鹽酸硫胺素0.5毫克/升鹽酸吡哆醇0.5毫克/升煙酸5毫克/升甘氨酸2毫克/升葉酸0.5毫克/升生物素0.05毫克/升水解酪蛋白500毫克/升Ca-泛酸2毫克/升萘乙酸(Naphtylaceticacid)0.001毫克/升蔗糖1.5%瓊脂0.8%至于大成分和小成分，見Hurashige和Skoog的文章Physiol.Plant15.473-497(1962)。
將所長出的帶有6～8個芽的分生組織植株水平放置在固體營養劑中，與上述情況相似(大成分為原來的濃度，3%蔗糖)，輕輕地擠放到培養基中。用這一方法，所有將有可能開始起動。在這一時期，植物就可在體外繁殖。
對于生根來說，同樣的營養劑可用于繁殖，只是沒有瓊脂。對于微塊莖的形成，Hungarican的專利說明書183，978和187，396中所給的營養培養基也可以使用。在液體培養中，該苗塊的芽迅速生出芽、生出根組織。10～12天之后，根分枝成束，可以立即取出。該植株上只有極小的葉子，這對于在花房種植它們非常有利。不管是為了獲得生根苗還是微塊莖，都可用已知方法施加影響(AnnalsofBotany53.565-578(1984))。
在花房中，可將體外生根的植株培養在固體土壤上。
將生根植株成束置于土壤表面。為了保持土壤適當濕度，用薄金屬片覆蓋植物，控制光照。每天要對薄金屬片下的植物通氣。到第二周時，逐步去掉覆蓋物，使植物適應花房環境條件。植物移栽三周后，就可以無覆蓋而生長，這樣就可用它們進行扦插。
至于植物的生長則不均一，只要適于直接用它們繁殖產籽苗就可以了。因此，這些植物可用作母株提供苗。
為了生產均一的籽苗材料，可將頂部插條(具有3至4個芽)在栽培木箱中生根。
插條帶有1～2厘米長的葉子的幼菌。因為較老的苗將發育成塊莖，不適合用它們培養生根籽苗。在覆蓋的條件下籽苗生根，將它們在栽培木箱中培養兩周，直至長出5～6片葉子。然后就可以將籽苗移栽到花房中，或在無傳染媒介環境的試驗田中。
從苗繁殖誘出的微塊莖所得到的植株也可以用作母本植株。
將在花房中培養的籽苗以一種方式移栽到無傳染媒介的地里，正好使籽苗的上部葉子露出地面。所有這些水平座植的植物地下芽都將發育成苗，以后發育成塊莖。為了能控制變種和生育力的真實性，最好是按分生組織系將植物分別種植在無傳染媒介環境中。這樣就可能除去不好的品系，選擇好的特性。
在試驗田中的這種繁殖材料的進一步繁殖就可采用傳統的農業方法進行。
如上所述，從親本植株得到的插條可被移栽，以獲得塊莖。假如我們不希望得到塊莖，而是進一步獲得能提供插條的親本植株，那么就必須抑制塊莖的形成，才能增加其插條形成的能力。一旦開始形成塊莖之后，插條就不再能有效生根。
現已發現，馬鈴薯塊莖形成的誘導是與馬鈴薯開始合成塊莖形成素(papatin)緊密相聯的。葉子中開始的合成塊莖形成素也就意味著塊莖形成誘導作用的預兆。合成塊莖形成素以及因此而來的塊莖形成的誘導或抑制可以用酶偶聯的塊莖形成素抗血清測定。
基于控制塊莖形成素合成，可以通過改變環境條件或者化學處理影響塊莖的形成。可以通過降溫或者是除去無機氮源(氨，硝酸鹽)而代之用有機氮源尿素來誘導。
按照本發明所公開的具體方法之一，可以誘導實驗苗的塊莖形成，從而在體外得到具有幾個毫米直徑的微塊莖。這些微塊莖非常便于作為繁殖材料。與季節苗的生產相反，該微塊莖可以一年四季穩定生產，而且能夠以小體積藏在冰箱。
然而，微塊莖也有不利的一面，它們的密度疏松，極易萎縮和受到損傷。這些缺點可以通過用一種保護層，包被體外產生的塊莖而消除，從而防止它們的萎縮，防止機械損傷。這些包被的塊莖適合用插種機進行播種。
本方法如下從培養瓶中取出微塊莖后，一定要除去莖殘余物，然后將塊莖徹底沖洗后干燥。可以在一有1～2層的淺盤中，溫度為20℃、濕度為40%的條件下干燥大約兩周。干燥一直要進行到塊莖的最初體積減少三分之一為止。然后用已知方式包裹塊莖(0.5～0.6mm)形成顆粒化。可以采用包裹種子時所用的常規方法進行顆粒化。被包裹的塊莖經干燥后，于2～5℃下保藏。在該方法的實踐過程中，還沒有發現自發的遺傳變化。
下面的例子非限定性的說明了本發明。
實例1無病毒培育原種的生產及栽培品種的體外保藏用10%次氯酸鈉和0.1%濕潤劑的溶液洗滌10個“Somogygyongye”馬鈴薯塊莖，用于洗擦。將它們浸泡在同樣的溶液中30分鐘。經消毒之后，用無菌蒸餾水將該塊莖洗滌三次，干燥。為了促進發芽，將該塊莖放在10毫克/升的GA-3(赤霉素)溶液中浸泡30分鐘，然后再干燥。讓它在溫度為5℃、相對濕度為70～80%、無光照的氣溫箱中發芽18～22天，直至長出4～6厘米長的苗。用塊莖和苗將培養物標記和記錄。
將切下的苗在4%次氯酸鈉溶液中滅菌，然后用無菌蒸餾水洗滌三次。再在顯微鏡下用鋒利的柳葉刀切下苗尖，將它置于上面詳述的營養培養基。將一個苗尖分生組織放在試管中，它在溫度為20～22℃、光強度為500勒的條件下開始生長3～4周。在生長營養基上方的光照強度增加到2000勒，在6～8周發育成有5～7片葉子的小植株。
從試管中取出植株，放在上面提到過的一種營養基上，只是蔗糖的濃度必須增加至3%。含40毫升營養培養基的標準螺旋蓋瓶(400毫升)非常合乎這一目的(1株/瓶)。在20～22℃以及3000勒光波度的條件下，所有的芽將在6～8周長出，在瓶中長成4～8厘米的苗。此時必須首先控制除去病毒。
被病毒感染的品系通過進一步培養而被消除，將合格的苗切成有1～2個芽的塊，置于另外的培養瓶，按上述方法培養。在每一次的移植周期中，必須進一步控制至少三次，從而使無病毒的品系繁殖。使用上面詳述的方法，就可以從每一品系大量地生產該植物。
實例2生產微塊莖將按實例1生產的植株在上面所提到的不含營養劑(液體)中進一步培養(22℃，3000勒)，培養植物的瓶按植株編號。大約三周之后，必須用另一種營養劑更換瓶中的營養劑，以促進塊莖形成素合成。這種營養劑不同于其他營養劑，它含有10毫克/升的苯基-腺嘌呤，10毫克/升的香豆素和8%的蔗糖，但只有原量10%的無機氮源。在17℃，1000勒下培養10～12周。這時，可發育出40～60個直徑為0.3～0.6厘米的微塊莖。打開瓶子，干燥植物，取出塊莖，在室溫下放置一周，隨后在黑暗和干燥的地方于+2～4℃保藏。
實例3親本植株和籽苗的生產將按實例1所生產的植株以松散成束移栽到花房有泥炭和珍珠巖的混合物的土壤中(500～750個植物/米)。土壤保持在20℃，室溫在24℃為了保證濕度，用薄金屬片覆蓋地面。培養物可能在2～4周內適應花房條件植物越來越健壯，將發育出7～8片葉子。這就是親本植物，通過噴灑0.2%Mikramid的人造肥料溶液阻止塊莖素的合成，從而抑制塊莖的形成。從這種親本植株可以再次獲得具有4～5片葉子的頂端苗，生根后就可進行培養，或者作為馬鈴薯籽苗投放市場。從每一個培養瓶中可以得到80～100個籽苗。
實例4小塊莖的生產用實例2的微塊基，或從實例3的籽苗在暖房或隔離器中，生產小塊莖。播種或栽植在含有0.5千克/米3的尿素人造肥料的泥炭和珍珠巖的混合土中，(400個植株/米)。
必須在自然溫度和光照條件下給植株澆水，以滿足它們的需要。營養物的供給可以通過葉子進行。八周后，必須使用一種生長調節劑-氯-膽堿-氯化物阻止葉子的生長，并停止澆水。播種后85～90天可得到3～4個小塊莖(原種)(直徑0.5～2.0厘米)。
權利要求
1.通過組織培養大量生產無病毒和類病毒的馬鈴薯繁殖材料的方法，其特征在于分離馬鈴薯苗尖組織的發芽細胞，體外培養在營養劑中繁殖，得到的苗在營養劑中生根，或在苗上誘導塊莖形成，將體外生根植株移載到花房，培養成親本植株，或者將體外生根的植株誘導塊莖形成，如果需要的話，從微塊莖，培養成親本植株，從親本植株得到籽苗或小塊莖的繁殖材料，或者用得到的微塊莖作為繁殖材料，籽苗和塊莖形成，可通過影響親本植株塊莖素合成進行控制。
2.如權利要求1所述的生產微塊莖作為繁殖材料的方法，其特征在于直接或試管生根的體外繁殖所得的苗，可以誘導塊莖形成。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于得到的微塊莖繁殖材料用保護層包被。
4.如權利要求1所述的生產用作繁殖材料的馬鈴薯籽苗的方法，其特征在于體外繁殖得到的苗可在營養劑中體外生根，然后移栽到花房，因此得到親本植株的繁殖材料，同時，親本植株塊莖素的合成受到阻止。
5.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于可通過環境條件，或者使用化學處理影響塊莖素的合成。
6.如權利要求1所述的生產作為繁殖材料的馬鈴薯小塊莖的方法，其特征在于在從體外生根所培養的親本植株，或微塊莖，可以誘導塊莖形成。
7.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于從母本植株得到的苗，可以進一步培養母體植株。
8.如權利要求1至7中任一項所述的方法，其特征在于是在無病毒和類病毒的環境條件下生產馬鈴薯繁殖材料。
全文摘要
本發明涉及通過組織培養大量生產無病毒和類病毒的馬鈴薯繁殖材料的方法。用一種方法，即分離馬鈴薯的苗尖組織細胞，在營養劑中體外培養，然后透導生根，或者誘導微塊莖形成。培養生根的植株成母本植物，或者進一步誘導微塊莖，由微塊莖進一步培養成母本植株。由這些苗或小塊莖得到繁殖材料，或者用微塊莖體為繁殖材料。
文檔編號A01G7/00GK1031637SQ8710604
公開日1989年3月15日 申請日期1987年9月1日 優先權日1987年9月1日
發明者弗倫克·德爾·福格利恩, 伊斯特萬·德爾·蘇姆, 吉尤拉·奧利亞爾, 米克洛斯·馬吉亞爾, 安納馬里亞·麥薩羅斯, 米克洛斯·澤吉迪 申請人:諾沃特拉德公司