專利名稱:農業細菌接種物的制作方法
本發明涉及農業細菌產品，包括根瘤菌接種物以及制造和保存這些農業細菌產品的方法。
眾所周知，豆科植物在某些條件下可直接從空氣“固氮”并將其轉變成含有機氮的化合物，因而將氮提供給植物作蛋白質合成并通過將含氮營養物留在土壤中來使豆科植物周圍的土壤變肥供以后的作物之用。當然，在實際上，植物本身并不固氮，但固氮發生在根瘤菌中，該菌是在植物根部所形成的根瘤中與豆科植物共生地存在著。能與根瘤菌形成共生關系的豆科植物的例子為豌豆、蠶豆、紫苜蓿、紅三葉草、白三葉草、巢菜、羽扁豆等等。
其他在農業上很重要的非豆科植物如禾本科植物和谷物不能從空氣直接固氮。非豆科植物一般完全依賴于土壤中的結合氮，如硝酸鹽及銨鹽來提供進行蛋白質合成所需的氮。在任一給定的田地上已經種過了一系列這類作物之后，在土壤中的結合氮就被消耗掉。因而常常進行作物輪作，從而固氮植物與非固氮植物輪種以補充土壤中的氮。再者，一些豆科植物特別是大豆、豌豆、蠶豆及紫苜蓿作為作物本身在商業上是很重要的，而且這些作物的生長由于能獲得豐富的結合氮而大為便利。
某一固氮植物所需的特定的根瘤菌可能并不普遍存在于土壤之中。不同的根瘤菌種僅適用于在專門的豆科植物中形成根瘤。因而十分普遍的做法是用適當的根瘤菌的培養物對豆科植物的種子接種。人工接種可以在種子上涂上、在種植的種子或作物上撒上接種物或可在種植的豆科種子的溝中撒上接種物來進行。
對豆科種子接種的一種方法是通過將細菌的潮濕培養物與諸如腐殖質或泥炭之類的載體相混合以使根瘤菌培養物維持在活的狀態。這種載體維持細菌在潮濕生活狀態。然而，這樣的活的細菌培養物的貨架壽命(貯藏壽命)相對較短，因為在貯存條件下由于在其環境中食物及潮氣的相對短缺而使細菌死亡。在授予愛雷克生(Erickhson)的美國專利第2，726，948號中，描述有潮濕類型的接種混合物的例子，其中活性潮濕細菌的培養物是與泥炭、木炭及石灰石的混合物相混合，因而水是在約為混合物總重量的38%的水平上。
另一種制備豆科植物種子接種物的方法是將細菌培養物轉變到休眠狀態。如在授予斯考特(Scott)等的美國專利第3，168，796號中所描述的那樣，用以產生休眠細菌的一種已知方法是冷凍-干燥。在斯考特專利中，將根瘤菌在-35～-70℃的溫度范圍中進行冷凍-干燥。然后將干燥了的細菌餅進行磨碎，并與粉狀載體混合，該載體是一種尺寸小于40微米的非吸濕性的惰性粉末。在斯考特專利中，細菌對載體的重量比為5～400毫克細菌/英兩載體。根據斯考特專利，在將細菌與載體進行混合的步驟期間，排除掉水是至關重要的。
盡管在與載體混合之前，冷凍-干燥根瘤菌通常可得到高的起始回收率，但細菌在長保存期間中并不總是保持穩定的。因而提供一種干燥且休眠的細菌接種物是有利的，而且這種接種物可以很容易制備出來并在相當長的保存時間內是很穩定的，且在重新曝露到潮氣中后，有活力的根瘤菌的數量也大。
有人已提出看法認為其它的非根瘤菌的細菌可能對一些作物是有利的。許多陸地上的細菌菌種是已知的很可能是由于在植物與細菌之間所形成的共生關系，其中一些細菌對田間作物的栽培是特別有用。結果是這類共生關系被確定了，那么為了利用此共生現象就需有效地將細菌施加到田地之中去。
本發明可概述為一種制造在農業上有用的在惰性粒狀載體上含有休眠細菌培養物的干燥的組成物的方法。根瘤菌或其它種細菌的菌落是成批培養的，并將其從培養基中分離出來，在無菌的條件下溫度為約0～30℃的范圍內，保持約0到96小時。然后將細菌與在化學上呈惰性的多孔的粒狀載體相混合，以致使細菌對培養物的重量比是在約0.5～1.5的范圍。然后細菌與載體的混合物在無菌條件下，在室溫下，空氣干燥約2～10天。
本發明的目的是提供一種制造在農業上有用的包括有活力的休眠細菌(或是根瘤菌或其他有用的細菌菌種)的組成物的方法。
本發明的進一步目的是為豆科植物提供一種種子涂層，該涂層包括根瘤菌接種物，其中涂層與種子在長的保存期間內將是穩定的。
本發明的另一目的是提供一種細菌接種物，其中細菌是休眠的容易處理，而且在持久的保存期間，細菌將是穩定和活的。
本發明的其他目的、優點及特征從下面的詳細說明中可很明顯地看出。
本發明揭示了一種制造在農業上有用的包含有活力的細菌成分(根瘤菌特別有用)的組成物的方法。細菌培養物本身可以有效地在半固體支持物如AMA-瓊脂上或在液態(AMA-液體)中生長(AMA為美國醫學協會)。在大量的適當的所要的根瘤菌或其他細菌的菌種被培養以后，從培養基中收獲細菌。適合的根瘤細菌菌種包括用于大豆的大豆根瘤細菌(R.japonicum)，用于三葉草的三葉草根瘤細菌(R.trifolii)用于紫苜蓿和草木犀的苜蓿根瘤細菌(R.meliloti)，用于豌豆及巢菜的豌豆根瘤細菌(R.leguminosarum)，用于菜豆的菜豆的根瘤細菌(R.phascoli)及用于羽扁豆的羽扁豆根瘤細菌(R.Lupini)。此外也可以用各自的根瘤菌種的混合物。所選擇的收獲方法視使用的培養物的類型而定。例如，如果采用半固體支持物如AMA-瓊脂那么可從瓊脂頂上刮下培養物來收獲細菌。如果采用液體培養物則可用離心法從其培養基中分離細菌。
一旦根瘤菌已基本上從培養基分離出來后;細菌在無菌條件下在溫度為約0～30℃的范圍內保持約0～96小時。最好是細菌懸浮液在無菌條件下溫度在約22～30℃(即正常室溫)的范圍內保持約3到25小時，接著在無菌條件下溫度在約0～15℃的范圍內，進一步把細菌懸浮液保持約3～20小時。在此步驟時細菌要保持濃縮的液體懸浮。在此階段，在大量液體培養基被去掉之后，細菌不再能很活躍地生長。對于根瘤細菌來說，細菌密度應為107～1012個細菌/毫升的數量級。濃縮的細菌懸浮液看起來應更像粘糊的稠密的液體。
然后，將濃縮的細菌懸浮液與多孔的化學上呈惰性的粒狀載體相混合，且使濃縮的細菌懸浮液對干燥載體的重量比為約0.5～1.5的范圍內，最好約為1.0。適合的載體的例子包括蛭石，珍珠巖和活性炭。如用活性炭則那飽和的糖溶液最好從蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨糖醇及阿東糖醇所組成的一組中選用，并在細菌保持在0～30℃的步驟之前，將該溶液加到細菌懸浮液之中。加到細菌懸浮液的飽和糖溶液的重量是按重量應為在約0，5～1.5的范圍內的比例，最好約為1.0。活性炭載體是有利的，對于某些應用來說是更好的，因為活性炭可以吸收對根瘤細菌有毒的化合物，如生物堿和木質素化合物，它們是在發芽期間由許多豆科植物種子自然地放出的物質。
下一步是將細菌-載體混合物慢慢地干燥，最好在無菌條件下在空氣中在大約為室溫即22～30℃下干燥約2到10天。準確的時間周期當然是隨在液體培養物中細菌的濃度的變化而變化。干燥應繼續到細菌與載體的混合物看起來全部為干燥為止。干燥了的混合物的剩余含水量應接近于環境的相對濕度。
在完成干燥之后所得到的組成物包括在松餅中干燥的休眠的，但有活力的根瘤菌和多孔的粒狀載體。該松餅是易碎的以便提供成塊的粗粒狀產品。這種粒狀產品可以不可以重新磨成更細的粉末形狀決定于所用的特定運輸方式。
因而，根據所用的運輸方法，然后可將細菌與載體的混合物磨成相對地細的粉末，可用粘合劑或不用粘合劑使該粉末直接撒在或涂在豆科植物的種子上或者可在種植前或種植時撒在田地上。對較粗的粒狀的細菌載體混合物可以不磨碎，然后在種植時可很容易地將干燥的粒狀混合物直接引入到溝中以便使種子接種。因而，從細菌-載體混合物的干燥而產生的材料很容易地適用于不同的運輸方法，如任何已知的應用所需要的那樣。
由本發明所制備的用根瘤菌接種的豆科種子涂層包括根瘤細菌與多孔的在化學上呈惰性的載體的混合物，其中細菌-載體混合物已由空氣干燥成基本上不潮濕的狀態。濃縮的細菌培養液對干燥載體的重量比應在約0.5～1.5的范圍內最好約為1.0。上述的任何根瘤細菌菌種都可用于這種豆科植物種子涂層上。最好的載體是從由蛭石，珍珠巖及活性炭所組成的一組中選用，豆科植物種子涂層還包括糖。糖以飽和溶液方式引入到細菌懸浮液中，糖溶液與細菌懸浮液的重量比為在約0.5～1.5的范圍內，最好約為1.0。適用的糖的例子包括蔗糖、乳糖、海藻糖醇、山梨糖醇及阿東糖醇。最好是在對豆科植物種子涂覆之前將干燥的細菌-載體混合物磨碎。如果這樣做，則這樣磨碎最好在該混合物已經空氣干燥后進行。
當此方法特別對根瘤菌種有用(其農業用途現已為公眾所承認)時，已發現不管是農業上應用還是其他應用，它對于使其他非根瘤細菌菌種的有活力的培養液干燥也是有用的。
下列非模仿的例子用來說明本發明。
例1本例中所用的細菌是從美國路易斯安那州的大豆田中分離出來的大豆根瘤細菌菌株。在包括例1的五個實驗中的每個實驗中，細菌在AMA-瓊脂中培養14天，在培養后，通過從瓊脂支持物上刮下培養物來收獲細菌。在本例中所試驗用的兩種載體為珍珠巖和活性炭。當用珍珠巖時，細菌首先在兩種不同溫度(T1及T2)中保持不同小時數，然后與珍珠巖載體相混合。當活性炭被選作載體時，細菌首先與等重量的飽和蔗糖相混合，然后在不同溫度(T1及T2)下保持不同小時數。在細菌已保持所需的時間之后，然后將細菌與等重量的活性炭相混合。表1所示為包含例1的五個實驗的條件。表2包含例1的試驗的結果，并以每克干燥產品中的活的細菌數表示。該結果說明了用本發明的農產品所能得到的穩定性。
表1例1的條件載體/細菌 糖/細菌 小時 小時實驗培養重量比重量比在T1在T2(a) 14天 0.5 - 4小時 18小時AMA-瓊脂 珍珠巖 23℃ 10℃(b) 14天 1.0 - 4小時 18小時AMA-瓊脂 珍珠巖 23℃ 10℃(c) 14天 1.0 - 18小時 7小時AMA-瓊脂 珍珠巖 23℃ 10℃(d) 14天 1.0 1.0 4小時 18小時
AMA-瓊脂 活性炭 蔗糖 23℃ 10℃(e) 14天 1.0 1.0 18小時 7小時AMA-瓊脂 活性炭 蔗糖 23℃ 10℃表2例1的結果(每克干燥產品中有活力的根瘤菌數)實驗 1周 11周 13周 43周 48周(a) 109109107(b) 109108108(c) 109109108(d) 109108106(e) 109109109108例2在本例中試驗的大豆根瘤細菌是從美國依利諾斯州的大豆田中分離的。在包括本例的四個實驗中，用了兩種不同的培養方法。在前兩個實驗中，細菌在AMA-瓊脂中培養14天。在本例的后兩個實驗中，細菌在AMA-瓊脂中培養7天。如在例1中那樣在收獲細菌后，在與載體混合前，在不同溫度下，將細菌保持不同的時間周期。也如同例1那樣，當活性炭為載體時，細菌首先與相當重量的飽和蔗糖混合，然后細菌保持在溫度T1。在例2中所用的條件在表3中說明。本例的結果列于表4。
表3例2的條件載體/細菌 糖/細菌 小時 小時實驗培養重量比重量比在T1在T2(a) 14天 1.0 1.0 4小時 18小時瓊脂 活性炭 蔗糖 23℃ 10℃
(b) 14天 0.5 - 4小時 18小時瓊脂 珍珠巖 23℃ 10℃(c) 7天 1.0 - 4小時 18小時瓊脂 珍珠巖 23℃ 10℃(d) 7天 1.0 22小時 -瓊脂 珍珠巖 23℃表4例2的結果(每克干燥產品中的有活力的根瘤菌數)實驗 1周 5周 11周 15周 48周(a) 107107(b) 10101010106(c) 1095×108(d) 1095×1082×108例3在本例中試驗的細菌(大豆根瘤細菌)是從美國衣阿華州田地中分離的。例3的條件列于表5，而例3的結果則以每克干燥產品中有活力的根瘤菌數表示并列于表6。
表5例3的條件載體/細菌 糖/細菌 小時 小時實驗培養重量比重量比在T1在T2(a) 14天 1.0 - 4小時 18小時瓊脂 珍珠巖 23℃ 10℃(b) 14天 1.0 1.0 4小時 18小時瓊脂 活性炭 蔗糖 23℃ 10℃(c) 7天 1.0 24小時 -
瓊脂 珍珠巖 23℃表6例3的結果(每克干燥產品中的有活力的根瘤菌數)實驗 1周 5周 6周 9周 14周 18周 19周(a) 10101010109107(b) 1010108106(c) 10101010109107例4在本例中試驗的另一種大豆根瘤細菌是從美國路易斯安那州分離的。例4的條件列于表7，該例的結果列于表8。
表7例4的條件載體/細菌 糖/細菌 小時 小時實驗培養重量比重量比在T1在T2(a) 14天 1.0 - 4小時 18小時瓊脂 珍珠巖 23℃ 10℃(b) 14天 1.0 1.0 4小時 18小時瓊脂 活性炭 蔗糖 23℃ 10℃表8例4的結果(每克干燥產品中的有活力的根瘤菌數)實驗 1周 5周 9周 14周 19周(a) 10101010108107(b) 1010109109108107例5在本例中所利用的另一大豆根瘤菌是從美國依阿華州分離的。例5的條件列于表9。本例的結果列于表10。
表9例5的條件載體/細菌糖/細菌在T1在T2實驗 培養 重量比 重量比 小時 小時(a) 14天 1.0 - 4小時 18小時瓊脂 珍珠巖 23℃ 10℃(b) 14天 1.0 1.0 4小時 18小時瓊脂 活性炭 蔗糖 23℃ 10℃表10例5的結果(每克干燥產品中的有活力的根瘤菌數)實驗 1周 5周 9周 14周 19周(a) 10101010109108107(b) 108108107例6在本例中，以相同方法對兩種非根瘤菌進行試驗。稱為LAIC-2及LA Ic-6的兩細菌培養物是從美國路易斯安那州的大豆植物的根中分離的。兩種培養物都不會如根瘤菌那樣使豆科植物結根瘤。兩培養物都是桿菌形的，LA Ic-2是長桿菌形而LA Ic-6是短桿菌，而根瘤菌當然是短桿形的。兩培養物都是革蘭氏染色陽性(根瘤菌為革蘭氏染色陰性)，兩培養物在對根瘤菌培養物不利的營養肉湯及瓊脂中卻能生長良好。使用珍珠巖作為粒狀載體，制備這些培養物中每個培養物的干燥混合物。檢查該干燥制品并發現其含有的有活力LA Ic-2為1.2×10個細菌/克，而含有的有活力LA Ic-6則為1.9×10個細菌/克。在每種情況下，約5%細菌復活。
應該了解的是，對上述制造在農業上有用的細菌組成物及此處所述的農業細菌產品的方法進行改變很可能是在本發明的精神之內。例如將其他成分加到本發明的干燥細菌產品中可能是有利的。其他農業產品如對細菌無害的干的或液體的肥料或除草劑或殺蟲劑都可以加到該混合物中。此外在使用此處所揭示的干燥的細菌組成物作為種子涂層是特別有用的同時，也可施在溝中或再濕潤或噴射或以某些其他形式施用。因而，本發明并不限于上述說明，但應根據下列權利要求
進行解釋。
權利要求
1.一種制造在農業上有用的休眠細菌的接種物的方法，包括的步驟為(a)在無菌條件下溫度在約0～30℃的范圍內將基本上從其培養基分離出來的細菌濃縮懸浮液保持約0～96小時的一段時間。(b)將細菌懸浮液與多孔的在化學上呈惰性的粒狀載體混合，使得干燥載體對濃縮細菌懸浮液的重量比在約0.5到1.5的范圍內；及(c)在無菌條件下在22～30℃之間，使細菌與載體的混合物進行空氣干燥，干燥時間約為2～10天。
2.權利要求
1所述的方法，其中細菌是根瘤細菌。
3.權利要求
1所述的方法，其中載體是蛭石。
4.權利要求
3所述的方法，還包括將細菌與載體的混合物磨成粉末的步驟。
5.權利要求
1所述的方法，其中的載體為珍珠巖。
6.權利要求
5所述的方法，還包括將細菌與載體的混合物磨成粉末的步驟。
7.權利要求
1所述的方法，其中載體為活性炭，并且還包括在保持細菌在0到30℃的步驟前，將飽和的糖溶液加到細菌的步驟，使得該溶液對細菌懸浮液的重量比的范圍約為0.5到1.5。
8.權利要求
7所述的方法，還包括將細菌和載體的混合物磨成粉末的步驟。
9.權利要求
7所述的方法，其中在糖溶液中的糖是從蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨糖醇、阿東糖醇所組成的一組中選用的。
10.權利要求
9所述的方法，還包括將細菌與載體的混合物磨成粉末的步驟。
11.一種制造在農業上有用的休眠細菌的接種物的方法，包括的步驟為(a)在無菌條件下，溫度在范圍為約22～30℃，將在最小量的液體培養基中的細菌的濃縮懸浮液保持約3～25小時;(b)在無菌條件下，溫度在范圍為約0～15℃，將細菌懸浮液再保持約3～20小時。(c)將濃縮的細菌懸浮液與多孔的化學上呈惰性的載體混合，使得干燥載體對濃縮細菌懸浮液的重量比在約0.5～1.5的范圍內;及(d)在無菌條件下，使細菌與載體的混合物干燥約2～10天的一段時間。
12.權利要求
11所述的方法，其中細菌是根瘤細菌。
13.權利要求
11所述的方法，其中載體是蛭石。
14.權利要求
13所述的方法，還包括將細菌與載體的混合物磨成粉末的步驟。
15.權利要求
11所述的方法，其中載體是珍珠巖。
16.權利要求
15所述的方法，還包括將細菌與載體的混合物磨成粉末的步驟。
17.權利要求
11所述的方法，其中載體是活性炭，還包括在保持細菌在0到30℃的步驟前，將飽和糖溶液加到細菌中的步驟，使得糖溶液對細菌懸浮液的重量比的范圍為約0.5～1.5。
18.權利要求
17所述的方法，還包括將細菌與載體的混合物磨成粉末的步驟。
19.權利要求
17所述的方法，其中在糖溶液中的糖從由蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨糖醇和阿東糖醇所組成的一組中選用。
20.權利要求
19所述的方法，還包括將細菌與載體的混合物磨成粉末的步驟。
21.一種豆科植物種子用的接種物，包括干燥的休眠的但有活力的根瘤菌與多孔的化學上呈惰性的載體的混合物，其中細菌與載體的混合物已被空氣干燥成基本上不潮濕狀態及干燥前濃縮的細菌懸浮液對干燥載體的重量比的范圍為約0.5～1.5。
22.權利要求
21所述接種物的涂層，其中載體是蛭石。
23.權利要求
22所述的涂層，其中細菌與載體的混合物已經被磨成粉末。
24.權利要求
21所述接種物的涂層，其中載體是珍珠巖。
25.權利要求
24所述的涂層，其中細菌與載體的混合物已經被磨成粉末。
26.權利要求
21所述的接種物的涂層，其中的載體是活性炭，該涂層還包括糖。
27.權利要求
26所述的涂層，其中細菌、載體與糖的混合物已被磨成粉末。
28.權利要求
26所述的涂層，其中糖從蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨糖醇和阿東糖醇所組成的一組中選用。
29.權利要求
28所述的涂層，其中細菌、載體與糖的混合物已被磨成粉末。
30.一種農業上有用的組成物包括涂有由干燥的、休眠的但有活力的根瘤菌與多孔的、在化學上呈惰性的載體混合而成的涂層的豆科植物種子，其中細菌與載體的混合物已被空氣干燥成基本上不潮濕的狀態且干燥前濃縮的細菌懸浮液對干燥載體的重量比的范圍是約0.5～1.5。
31.權利要求
30所述的種子，其中載體是蛭石。
32.權利要求
30所述的種子，其中細菌與載體的混合物已被磨成粉末。
33.權利要求
30所述的種子，其中載體是珍珠巖。
34.權利要求
33所述的種子，其中細菌與載體的混合物已被磨成粉末。
35.權利要求
30所述的涂層，其中載體是活性炭，該涂層還包括糖。
36.權利要求
35所述的種子，其中細菌、載體與糖的混合物已被磨成粉末。
37.權利要求
35所述的種子，其中糖營養物選自一個由蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨糖醇和阿東糖醇所組成的組。
38.權利要求
37所述的種子，其中細菌、載體與糖的混合物已被磨成粉末。
專利摘要
對一種制造在農業上有用的干燥休眠細菌的接種物的方法作了描述。為了制造接種物在無菌條件下，溫度在約0～30℃的范圍內，將基本上從其培養基分離出來的根瘤菌或其他細菌的懸浮液保持不同的時間。然后將細菌懸浮液與多孔的、在化學上呈惰性的粒狀載體相混合，使得載體對細菌的重量比的范圍是約0.5～1.0。最后在無菌條件下，將細菌與載體的混合物空氣干燥約2到10天。
文檔編號C12N1/04GK86102971SQ86102971
公開日1986年12月31日 申請日期1986年4月24日
發明者阿倫·波 申請人:阿格拉塞特斯導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan