具有β-葡萄糖苷酶作為白蟻卵識(shí)別信息素的人工白蟻卵及用其控制白蟻的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng):具有β-葡萄糖苷酶作為白蟻卵識(shí)別信息素的人工白蟻卵及用其控制白蟻的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于滅殺和控制害蟲(chóng)，特別是白蟻的新的模擬卵；以及一種使用所述模擬卵滅殺和控制害蟲(chóng)，特別是白蟻的方法，以及一種使用所述模擬卵進(jìn)行生物學(xué)研究的工具。更具體地，本發(fā)明涉及一種使用β-葡萄糖苷酶、其鹽、其生物學(xué)片段或其相關(guān)肽的白蟻模擬卵；以及一種使用所述模擬卵滅殺和控制白蟻的方法，以及一種使用所述模擬卵進(jìn)行生物學(xué)研究的工具。
背景技術(shù)：
害蟲(chóng)導(dǎo)致的破壞是世界上嚴(yán)重的問(wèn)題，迄今已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種控制方法。特別地，害蟲(chóng)中的白蟻對(duì)木制房屋造成巨大破壞，因此已經(jīng)深入研究并開(kāi)發(fā)了白蟻的滅殺劑和滅殺方法。
用于滅殺白蟻的方法包括將溶液藥劑如有機(jī)磷藥劑、氨基甲酸酯藥劑或擬除蟲(chóng)菊酯藥劑注射到侵入位置中以殺滅昆蟲(chóng)的方法，或通過(guò)溴代甲烷等進(jìn)行煙熏以殺滅昆蟲(chóng)的方法(參見(jiàn)，例如，非專(zhuān)利文獻(xiàn)I)。
作為噴射藥劑方法的備選方法，存在誘餌法，其中將緩慢作用的殺蟲(chóng)活性成分混合在誘餌中，并且將誘餌喂給白蟻，從而滅殺白蟻(參見(jiàn)，例如，非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。
常規(guī)滅殺技術(shù)基本上是從被破壞的木材外投擲大量藥劑以殺滅昆蟲(chóng)。然而，該技術(shù)導(dǎo)致健康損害如病屋綜合征(sick house syndrome),或?qū)е颅h(huán)境污染。而且,存在這樣的問(wèn)題，即如果剩余一些白蟻群體，則該破壞將擴(kuò)散到另一個(gè)地方。最嚴(yán)重的問(wèn)題是，滅殺所需的勞動(dòng)力成本過(guò)多。使用溴代甲烷的熏蒸技術(shù)已被頻繁采用，然而，溴代甲烷是引起臭氧層破壞的物質(zhì)，并且近年來(lái)， 試圖控制溴代甲烷的使用的趨勢(shì)已經(jīng)增加。
作為用于滅殺以與白蟻相同的方式組織群居生活的螞蟻的方法，存在這樣的有效方法，即將螞蟻喜好的食物混合到毒藥中，并且將混合的食物作為誘餌提供，以允許螞蟻將所述食物帶到它的巢中，并且殺滅螞蟻的整個(gè)種群。然而，由于白蟻食用在其中建巢的木材本身，通過(guò)使用毒藥誘餌允許白蟻將藥劑從巢的外部運(yùn)送到巢的內(nèi)部的誘餌方法并不總是有效。特別是，難以通過(guò)誘餌方法根除屬于散白蟻屬(Reticulitermes)的白蟻的巢(參見(jiàn)，非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。
作為用于比誘餌方法更有效地使害蟲(chóng)攝取活性成分的方法，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了 “通過(guò)運(yùn)送模擬卵滅殺害蟲(chóng)的方法”，其中利用了作為害蟲(chóng)基本群居行為的卵運(yùn)送本能(專(zhuān)利文獻(xiàn)I)。卵識(shí)別信息素的主要成分是稱(chēng)為溶菌酶的抗微生物蛋白，并且已經(jīng)明確單獨(dú)的溶菌酶具有卵識(shí)別信息素活性(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。也已知添加作為白蟻卵識(shí)別信息素輔助物質(zhì)的纖維素酶(EC3. 2.1. 4)，即內(nèi)切-1，4-β -葡聚糖酶，具有提高模擬卵運(yùn)送活性的效果(參加專(zhuān)利文獻(xiàn)2，非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。
迄今為止，存在這樣的方法，該方法中向溶菌酶添加作為輔助物質(zhì)的纖維素酶(EC3. 2.1. 4)用來(lái)穩(wěn)定模擬卵的運(yùn)送活性。然而，纖維素酶并未顯著改善運(yùn)送活性(專(zhuān)利文獻(xiàn)2，非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)，并且尚未獲得與真正白蟻卵提取物相同或更高的卵運(yùn)送活性。
專(zhuān)利文獻(xiàn)1:日本未審專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2000-342149
專(zhuān)利文獻(xiàn)2 :日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?007-035030
非專(zhuān)利文獻(xiàn)1:“Termites and strategies for control (白蟻及控制策略)”, TheJapan Termite Control Association (日本白蟻控制協(xié)會(huì))，2000,第 219 頁(yè)
非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2 ,Activity evaluation of Japanese underground termitesusing a monitoring station and the control by bait methods (使用監(jiān)控站的日本地下白蟻的活動(dòng)評(píng)價(jià)以及通過(guò)誘館方法的控制)”，New developments of monitoringtechnique of insect ecology in a living zone (生活區(qū)中昆蟲(chóng)生態(tài)監(jiān)控技術(shù)的新發(fā)展)，2006，第48頁(yè)
非專(zhuān)利文獻(xiàn)3 Matsuura, K.，Tamura, T. Kobayashi, N.，Yashiro, T. Tatsumi, S.The antibacterial protein lysozyme identified as the termite egg recognitionpheromone (抗菌蛋白溶菌酶被鑒定為白蟻卵識(shí)別信息素).PLoS ONE 2(8) e813.
doi 10. 1371/journal, pone. 0000813

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問(wèn)題
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種模擬卵，特別是一種白蟻的模擬卵，該模擬卵具有比常規(guī)模擬卵更高的運(yùn)送活性，也提供一種具有更令人滿(mǎn)意的效率的滅殺和控制方法，以及一種進(jìn)行生物學(xué)研究的工具。
解決問(wèn)題的手段
在上述情況下，本發(fā)明人已深入研究了在卵識(shí)別中有溶菌酶以外的物質(zhì)用作白蟻卵識(shí)別信息素參與的可能性，以便進(jìn)一步改善和穩(wěn)定模擬卵的運(yùn)送活性。他們廣泛調(diào)查了可能由白蟻?zhàn)陨懋a(chǎn)生的蛋白質(zhì)，對(duì)多種蛋白質(zhì)制劑進(jìn)行了卵運(yùn)送活性試驗(yàn)。結(jié)果是，他們通過(guò)使模擬卵中包含葡萄糖苷酶(EC3. 2.1. 21，該酶已知是白蟻的消化酶)，成功地顯著提高了模擬卵的運(yùn)送活性，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供以下各項(xiàng)
(1) 一種模擬卵，所述模擬卵在其模擬白蟻的卵的基材中包含葡萄糖苷酶、其鹽、其生物學(xué)片段或β-葡萄糖苷酶-相關(guān)肽作為卵識(shí)別信息素；
(2)根據(jù)(1)的模擬卵，其中所述基材包含溶菌酶、其鹽、其生物學(xué)片段或溶菌酶-相關(guān)肽；
(3)根據(jù)(1)或(2)的模擬卵，其中所述基材包含從白蟻的卵提取的成分；
(4)根據(jù)(1)至(3)中任一項(xiàng)的模擬卵，其中所述基材包含纖維素酶、其鹽、其生物學(xué)片段或纖維素酶-相關(guān)肽；
(5)根據(jù)⑴至(4)中任一項(xiàng)的模擬卵，其中所述基材包含甘油；
(6)根據(jù)⑴至(5)中任一項(xiàng)的模擬卵，其中所述基材包含溶菌酶、其鹽、其生物學(xué)片段或溶菌酶-相關(guān)肽，和纖維素酶、其鹽、其生物學(xué)片段或纖維素酶-相關(guān)肽；
(7)根據(jù)⑴至(6)中任一項(xiàng)的模擬卵，包含選自由殺蟲(chóng)活性成分、孵化抑制物質(zhì)、繁殖抑制物質(zhì)、生長(zhǎng)抑制活性成分或昆蟲(chóng)病原微生物組成的組中的一種或多種成分；[0027](8) 一種滅殺白蟻的方法，所述方法包括對(duì)白蟻提供根據(jù)(7)的模擬卵；和利用卵運(yùn)送行為使所述白蟻將所述模擬卵運(yùn)送到它的巢中；以及
(9) 一種生物學(xué)研究的工具，所述工具基本包含根據(jù)(I)至(7)中任一項(xiàng)的模擬卵。
發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明人通過(guò)添加β -葡萄糖苷酶作為昆蟲(chóng)(特別是白蟻)的卵識(shí)別信息素成功地顯著提高了模擬卵的運(yùn)送活性。本發(fā)明模擬卵的運(yùn)送活性比真正白蟻卵提取物更高(48小時(shí)后的數(shù)據(jù)，參見(jiàn)實(shí)施例)。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)利用害蟲(chóng)(特別是白蟻)的卵運(yùn)送本能使害蟲(chóng)(特別是白蟻)將其中含有殺蟲(chóng)活性成分的模擬卵運(yùn)送到它的巢中，可能有效滅殺和控制害蟲(chóng)。另外，本發(fā)明的模擬卵能夠簡(jiǎn)單地誘導(dǎo)和觀(guān)察昆蟲(chóng)的卵運(yùn)送行為，因而所述模擬卵也適合作為生物學(xué)研究的工具用于學(xué)習(xí)和研究昆蟲(chóng)的行為和信息素。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示測(cè)試開(kāi)始24小時(shí)后卵識(shí)別活性(運(yùn)送率)的研究結(jié)果。每種縮寫(xiě)詞表示如下；L :卵清溶菌酶，C :纖維素酶，LC :卵清溶菌酶和纖維素酶的混合溶液，B : β -葡萄糖苷酶，LB :卵清溶菌酶和β -葡萄糖苷酶的混合溶液，LBC :卵清溶菌酶、β -葡萄糖苷酶和纖維素酶的混合溶液，E :白蟻卵提取物。n.s.:與對(duì)照沒(méi)有顯著區(qū)別。**:存在1%的顯著水平的顯著區(qū)別。***:存在O.1 %的顯著水平的顯著區(qū)別(雙側(cè)T檢驗(yàn)(two-sided Ttest))。圖中誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖2顯示測(cè)試開(kāi)始48小時(shí)后卵識(shí)別活性(運(yùn)送率)的研究結(jié)果?？s寫(xiě)詞和符號(hào)與圖1中的那些相同。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式
具有運(yùn)送卵的特征的昆蟲(chóng)如白蟻具有這樣的特征，即通過(guò)以下方式照顧卵將卵運(yùn)送并堆疊在它們的巢中，并且舔舐卵的表面等，或與其它個(gè)體進(jìn)行交哺。通過(guò)利用這種特征，可以滅殺或控制害蟲(chóng)。例如，白蟻將具有類(lèi)似于天然卵的尺寸和形狀，并且在其表面上含有卵識(shí)別信息素的模擬卵識(shí)別為卵，并且將該模擬卵運(yùn)送到巢中它的卵塊中。在巢中，白蟻進(jìn)行護(hù)理行為，如舔舐模擬卵的表面，并且與其它個(gè)體進(jìn)行交哺。因此，通過(guò)使模擬卵包含活性物質(zhì)，例如，活性成分諸如殺蟲(chóng)活性成分、孵化抑制物質(zhì)、繁殖抑制物質(zhì)、或生長(zhǎng)抑制成分，并且使白蟻將該模擬卵運(yùn)送到卵塊中，可以有效破壞群體的繁殖中心。
如上所述，本發(fā)明人已研究了在卵識(shí)別中有溶菌酶以外的物質(zhì)用作卵識(shí)別信息素參與的可能性，以便進(jìn)一步改善和穩(wěn)定模擬卵的運(yùn)送活性。結(jié)果是，他們通過(guò)添加β_葡萄糖苷酶(EC3. 2.1. 21，該酶已知是白蟻的消化酶)、其生物學(xué)片段或其相關(guān)肽，成功地顯著提高了模擬卵的運(yùn)送活性，從而完成了本發(fā)明。換言之，在本發(fā)明中，葡萄糖苷酶(其僅僅作為白蟻的消化酶而為人所知)、其鹽、其生物學(xué)片段或相關(guān)肽首次用作卵識(shí)別信息素，并且因此已獲得令人滿(mǎn)意的結(jié)果。
因此，在第一方面中，本發(fā)明提供模擬卵，所述模擬卵在其模擬白蟻的卵的基材中包含β_葡萄糖苷酶、其鹽、其生物學(xué)片段或β_葡萄糖苷酶-相關(guān)肽作為卵識(shí)別信息素。
運(yùn)送本發(fā)明的模擬卵并且可以通過(guò)本發(fā)明的方法滅殺的害蟲(chóng)可以是任何害蟲(chóng)，條件是它具有卵運(yùn)送本能并且識(shí)別作為卵識(shí)別信息素的β_葡萄糖苷酶、其鹽、其生物學(xué)片段或β_葡萄糖苷酶-相關(guān)肽。對(duì)其優(yōu)選應(yīng)用本發(fā)明的模擬卵和方法的害蟲(chóng)是白蟻。通過(guò)本發(fā)明滅殺的白蟻可以是任何種類(lèi)的白蟻，并且不僅在日本，而且在世界范圍內(nèi)的白蟻可以是目標(biāo)。通過(guò)本發(fā)明滅殺的白蟻的典型實(shí)例包括，但不限于，屬于散白蟻屬(Reticulitermes)和家白蟻屬(Coptotermes)的白蟻。在本說(shuō)明書(shū)中，害蟲(chóng)的滅殺還包括控制害蟲(chóng)。在本說(shuō)明書(shū)中，害蟲(chóng)的意思是對(duì)人、農(nóng)業(yè)動(dòng)物、農(nóng)產(chǎn)品、財(cái)產(chǎn)等造成有害效果的昆蟲(chóng)。其典型的實(shí)例包括白蟻。
在本發(fā)明中，β_葡萄糖苷酶、其鹽、其生物學(xué)片段或相關(guān)肽用作卵識(shí)別信息素。葡萄糖苷酶廣泛分布于微生物、植物和動(dòng)物中。本發(fā)明中使用的葡萄糖苷酶可以源自任何種類(lèi)，其來(lái)源的實(shí)例包括，但不限于，植物諸如杏樹(shù)(almond)和蘇鐵科植物(cycad);動(dòng)物諸如白蟻、食木材性蟑螂、和蝸牛；和微生物諸如米曲霉(Aspergillusoryzae)、酵母、腸球菌(Enterococcal)、和屬于桿菌(Bacillus)屬的細(xì)菌。本發(fā)明中使用的β_葡萄糖苷酶可以是未提純或提純的。此外，本發(fā)明中使用的β_葡萄糖苷酶可以通過(guò)遺傳重組方法制備。蛋白、多肽、或肽通過(guò)遺傳重組方法的制備對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的。通常，期望的蛋白可以通過(guò)將期望蛋白的基因與載體連接并且將其引入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)諸如大腸桿菌(Escherichia coli)或酵母中，并增殖該細(xì)胞來(lái)獲得。載體或宿主細(xì)胞的類(lèi)型、載體引入條件、宿主細(xì)胞的培養(yǎng)條件、分離和提純期望蛋白的方法等，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員從已知材料和已知方法中適當(dāng)?shù)剡x擇。
本發(fā)明中使用的葡萄糖苷酶可以是鹽的形式。葡萄糖苷酶鹽可以是與能夠形成鹽的各種物質(zhì)的鹽，例如與有機(jī)酸的鹽、與無(wú)機(jī)酸的鹽、與有機(jī)堿的鹽或與無(wú)機(jī)堿的鹽。而且，例如，構(gòu)成葡 萄糖苷酶的天冬酰胺酸或谷氨酰胺酸的或Y-羧基與金屬如鈉或鉀可以形成鹽。而且，例如，可以與構(gòu)成葡萄糖苷酶的堿性氨基酸的側(cè)鏈形成鹽。在本發(fā)明中，β_葡萄糖苷酶的生物學(xué)片段或β_葡萄糖苷酶-相關(guān)肽可以具有鹽的形式。
此外，在本發(fā)明中，葡萄糖苷酶的生物學(xué)片段可以用作卵識(shí)別信息素。葡萄糖苷酶的生物學(xué)片段是多肽或肽，其具有β_葡萄糖苷酶的部分氨基酸序列，并且具有與β_葡萄糖苷酶類(lèi)似的卵識(shí)別活性。該片段是短鏈，且因此適于通過(guò)遺傳重組方法大規(guī)豐吳制備。
此外，在本發(fā)明中，葡萄糖苷酶-相關(guān)肽可以用作卵識(shí)到信息素。葡萄糖苷酶-相關(guān)肽是蛋白、多肽或肽，其具有與β -葡萄糖苷酶類(lèi)似的卵識(shí)別活性，并且與
葡萄糖苷酶和葡萄糖苷酶的生物學(xué)片段不同。葡萄糖苷酶-相關(guān)肽可以源自天然來(lái)源，或可以是合成的化合物。通過(guò)技術(shù)如定點(diǎn)誘變法(site-directed mutagenesismethod)，β-葡萄糖苷酶-相關(guān)肽可以具有與天然葡萄糖苷酶不同的氨基酸序列。例如，在本發(fā)明中可以制備和使用具有白蟻更喜好的氨基酸序列的β-葡萄糖苷酶、β -葡萄糖苷酶的生物學(xué)片段、或葡萄糖苷酶-相關(guān)肽。而且，例如，在本發(fā)明中可以制備和使用具有這樣的氨基酸序列的β -葡萄糖苷酶、β -葡萄糖苷酶的生物學(xué)片段、或β -葡萄糖苷酶-相關(guān)肽，所述氨基酸序列對(duì)特定白蟻具有高特異性。
基材中β -葡萄糖苷酶、β -葡萄糖苷酶的生物學(xué)片段、或β -葡萄糖苷酶-相關(guān)肽的含量可以根據(jù)多種因素，諸如待使用的β_葡萄糖苷酶的種類(lèi)、特征、和量，害蟲(chóng)的種類(lèi)，活性物質(zhì)的種類(lèi)和量，以及期望效果的種類(lèi)和程度而確定。
本發(fā)明的模擬卵必須具有與待滅殺的害蟲(chóng)的卵的形狀、尺寸和特征類(lèi)似的形狀、尺寸和特征。本發(fā)明中使用的模擬卵的形式和尺寸可以通過(guò)模擬害蟲(chóng)的天然卵的形式和尺寸而制備。在白蟻的情形中，模擬卵的形式可以是長(zhǎng)卵形或球形。在模擬白蟻卵具有長(zhǎng)卵形的情形中，優(yōu)選地，其短直徑近似等于或稍微大于待滅殺的白蟻的卵的短直徑。例如，當(dāng)白蟻卵的短直徑為約O. 25至約O. 45毫米時(shí)，長(zhǎng)卵形模擬卵的短直徑可以為約O. 25至約O. 6毫米，優(yōu)選約O. 4至約O. 55毫米，并且更優(yōu)選約O. 45毫米。而且，在球形模擬白蟻卵的情形中，優(yōu)選地，其直徑近似等于或稍微大于待滅殺的白蟻的卵的短直徑。例如，當(dāng)白蟻卵的短直徑為約O. 25至約O. 45毫米時(shí)，球形模擬卵的直徑可以為約O. 25至約O. 6毫米，優(yōu)選約O. 4至約O. 6毫米，并且更優(yōu)選約O. 45至約O. 55毫米。從容易形成的觀(guān)點(diǎn)考慮，球形模擬卵是優(yōu)選的。
必要的是，本發(fā)明的模擬卵不僅物理性質(zhì)如上述形狀和尺寸以及重量或硬度，而且化學(xué)性質(zhì)，特別是卵識(shí)別信息素的存在狀態(tài)，都與害蟲(chóng)的天然卵的那些相同或類(lèi)似。即，優(yōu)選的是，當(dāng)模擬卵的基材含有β_葡萄糖苷酶、β_葡萄糖苷酶的生物學(xué)片段、或β_葡萄糖苷酶-相關(guān)肽時(shí)，這些物質(zhì)存在于基材的表面上。
本發(fā)明的模擬卵的基材可以是可以制備具有與害蟲(chóng)的天然卵的形狀和特征類(lèi)似的形狀和特征的模擬卵的任意材料。優(yōu)選用于制備本發(fā)明的模擬卵的基材包括熱塑性樹(shù)脂如聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚酯，聚氯乙烯和聚碳酸酯；熱固性樹(shù)脂如尿素樹(shù)脂，環(huán)氧樹(shù)脂，酚醛樹(shù)脂和 聚氨基甲酸酯；和多孔材料如硅膠和沸石；陶瓷和玻璃。
基材含有β -葡萄糖苷酶、其鹽、其生物學(xué)片段或β -葡萄糖苷酶-相關(guān)肽，以及活性成分，由此制備本發(fā)明的模擬卵。許多用于使這些物質(zhì)包含在基材中的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。在制備基材中，可以將這些物質(zhì)混合在其中，或可以將這些物質(zhì)在制備基材以后包含在基材中。例如，在制備基材中，可以將這些物質(zhì)混合或揉和(knead)在其中，或可以用這些物質(zhì)覆蓋、浸潰、涂敷或噴射(splay)所制備的基材。而且，由于用于將蛋白、多肽、或肽固定到固體支持物的方法是已知的，因此可以將這些方法應(yīng)用于此。固定方法包括吸附法、共價(jià)鍵法、離子鍵法、包囊法等。
對(duì)本發(fā)明的模擬卵的基材施用的β -葡萄糖苷酶、其鹽、其生物學(xué)片段或β -葡萄糖苷酶-相關(guān)肽的量可以容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，這取決于多種因素，諸如害蟲(chóng)的物種(來(lái)源生物體)、物理化學(xué)性質(zhì)等、種類(lèi)，活性物質(zhì)的種類(lèi)和量、以及期望效果的種類(lèi)和程度(參見(jiàn)，例如，本申請(qǐng)的實(shí)施例)。
優(yōu)選地，使得基材包含β_葡萄糖苷酶、其鹽、其生物學(xué)片段或β_葡萄糖苷酶-相關(guān)肽，和活性成分的模式的具體實(shí)例包括表面涂敷模式、基材添加模式、和膠囊溶解模式。在表面涂敷模式的一個(gè)實(shí)例中，將活性成分涂敷到基材的表面上，并且將β_葡萄糖苷酶、其鹽、其生物學(xué)片段或β_葡萄糖苷酶-相關(guān)肽涂敷于其上。在基材添加模式的一個(gè)實(shí)例中，在其中混合有活性成分的基材的表面上，涂敷β_葡萄糖苷酶、其鹽、其生物學(xué)片段或葡萄糖苷酶-相關(guān)肽。在膠囊溶解模式的一個(gè)實(shí)施中，將膜形基材成形為膠囊形基材，并且將活性成分密封在其中，并且將β_葡萄糖苷酶、其鹽、其生物學(xué)片段或β_葡萄糖苷酶-相關(guān)肽涂敷在基材的表面上。
可以用于本發(fā)明的模擬卵和滅殺方法的活性物質(zhì)可以是可以實(shí)現(xiàn)害蟲(chóng)的滅殺或控制的任意物質(zhì)。例如，活性物質(zhì)可以擾亂害蟲(chóng)的行為，并且因而導(dǎo)致群體的破壞。適于滅殺或控制害蟲(chóng)的活性物質(zhì)包括殺蟲(chóng)活性成分、孵化抑制物質(zhì)、繁殖抑制物質(zhì)或生長(zhǎng)抑制成分?？梢愿鶕?jù)多種因素，諸如活性物質(zhì)的種類(lèi)或害蟲(chóng)的種類(lèi)和期望活性(要對(duì)害蟲(chóng)給予的破壞)的種類(lèi)或程度，選擇可以用于本發(fā)明的模擬卵和方法的活性物質(zhì)的種類(lèi)和量。通常，選擇活性物質(zhì)的種類(lèi)和量，以使得可以對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)充分施加期望的作用。然而，選擇還在這樣的考慮下進(jìn)行，即以使得害蟲(chóng)的模擬卵的運(yùn)送率不會(huì)下降，并且使得通過(guò)使用本發(fā)明的模擬卵和方法，對(duì)人和周?chē)r(nóng)業(yè)動(dòng)物或有益昆蟲(chóng)不會(huì)產(chǎn)生不利影響。
可以將一種或兩種以上的活性成分用于本發(fā)明的模擬卵和滅殺方法。例如，可以使用殺蟲(chóng)活性成分，諸如擬除蟲(chóng)菊酯化合物、有機(jī)磷化合物、氨基甲酸酯化合物、N-芳基二唑化合物、腙化合物、氨磺?；衔锘蛱烊粴⑾x(chóng)成分。另外，可以將昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑如殼多糖合成抑制劑、保幼激素-樣活性化合物和蛻皮激素-樣活性化合物用作活性成分。不用說(shuō)，可以用于本發(fā)明的活性成分不限于以上化合物。
在本發(fā)明的模擬卵中，優(yōu)選地，活性成分是緩慢作用的。如上所述，害蟲(chóng)如白蟻將這樣的模擬卵識(shí)別為卵并且將該模擬卵運(yùn)送到巢中它的卵塊中，所述模擬卵具有與天然卵類(lèi)似的尺寸和形狀，并且在其表面上包含卵識(shí)別信息素。害蟲(chóng)通過(guò)護(hù)理行為例如舔舐模擬卵的表面攝取活性成分。當(dāng)群體的一些個(gè)體攝取活性成分時(shí)，活性成分通過(guò)經(jīng)由口道食物和肛道食物的高頻交哺而遍及整個(gè)群體。因此，本發(fā)明中使用的優(yōu)選活性成分不在運(yùn)送模擬卵時(shí)或害蟲(chóng)攝取以后即刻發(fā)揮作用，或以不影響行為如模擬卵運(yùn)送或交哺的程度發(fā)揮作用，且在將模擬卵運(yùn)送到巢中并且在許多個(gè)體之間進(jìn)行交哺以后發(fā)揮作用。通過(guò)使用這種緩慢作用的活性成分，可以有效滅殺目標(biāo)群體中的許多個(gè)體，并且活性成分的用量小。因此，對(duì)其它生態(tài)系統(tǒng)的影響也小。可以用于本發(fā)明的模擬卵的緩慢作用的活性成分不僅包括緩慢作用的殺蟲(chóng)成分如伏蟻腙(hydramethylnon),還包括緩慢作用的孵化抑制成分、緩慢作用的繁殖抑制成分、以及緩慢作用的生長(zhǎng)抑制成分，但不僅限于此。
在本發(fā)明的模擬卵中，還優(yōu)選的是，基材由持續(xù)釋放材料制成。其基材由持續(xù)釋放材料制成的模擬卵是優(yōu)選的，由此，模擬卵被運(yùn)送到巢中，然后活性物質(zhì)逐漸釋放并被害蟲(chóng)攝取。這種模擬卵包括由可被害蟲(chóng)的唾液降解的材料制成的卵。優(yōu)選地，使活性成份包含在基材內(nèi)部(通過(guò)混入、混合、填充等)，模擬卵被運(yùn)送到巢中，然后基材被害蟲(chóng)的唾液降解，并且由此釋放內(nèi)部活性成分。特別地，在以上基材添加模式或膠囊溶解模式等情形中，優(yōu)選使用可以被害蟲(chóng)的唾液降解的基材?？梢员缓οx(chóng)的唾液降解的基材的材料可以取決于害蟲(chóng)的唾液中的消化酶的種類(lèi)而選擇。例如，當(dāng)害蟲(chóng)的唾液中含有纖維素酶時(shí)，可以使用由纖維素材料制成的基材。
本發(fā)明的模擬卵的特別優(yōu)選類(lèi)型是上述膠囊溶解類(lèi)型。具體地，本發(fā)明的模擬卵可這樣制備，即，通過(guò)將含有β_葡萄糖苷酶、其鹽、β_葡萄糖苷酶的生物學(xué)片段或β_葡萄糖苷酶-相關(guān)肽的膜形基材成形為類(lèi)似于天然卵的形狀(即，成為膠囊形式)，并且使活性成分包含在膠囊內(nèi)而制備。形成這種膠囊的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。所述膜的材料的實(shí)例包括氧化物膜和纖維素膜。優(yōu)選地，膜形基材具有持續(xù)釋放性質(zhì)，并且優(yōu)選使用例如可以被害蟲(chóng)的唾液降解的纖維素膜。由這種膠囊密封模式制備的模擬卵還適于在野外(field)滅殺大的群體。
含有由這種持續(xù)釋放材料制成的基材的模擬卵在活性物質(zhì)緩慢作用的情況下也有效，并且在活性物質(zhì)不緩慢作用的情況下特別有效。
除了 β -葡萄糖苷酶、其鹽、β -葡萄糖苷酶的生物學(xué)片段或β -葡萄糖苷酶-相關(guān)肽以外，可以使本發(fā)明的模擬卵的基材包含一種或多種類(lèi)型的其它卵識(shí)別信息素。其它卵識(shí)別信息素的類(lèi)型或量可以根據(jù)目標(biāo)害蟲(chóng)的種類(lèi)適當(dāng)選擇。當(dāng)害蟲(chóng)是白蟻時(shí)，可以使本發(fā)明的模擬卵的基材包含溶菌酶、其鹽、溶菌酶的生物學(xué)片段或溶菌酶-相關(guān)肽。溶菌酶、其鹽、溶菌酶的生物學(xué)片段或溶菌酶-相關(guān)肽可以源自任何物種的生物體，例如，可以源自卵清溶菌酶、其鹽、其生物學(xué)片段或其相關(guān)肽。作為用于本發(fā)明的模擬卵的β_葡萄糖苷酶、其鹽、β-葡萄糖苷酶的生物學(xué)片段或β-葡萄糖苷酶-相關(guān)肽以外使用的卵識(shí)別信息素，不是必需要使用高度提純的產(chǎn)品?；闹新炎R(shí)別信息素的含量可以根據(jù)多種因素，諸如待使用的β_葡萄糖苷酶的種類(lèi)、特征、和量，害蟲(chóng)的種類(lèi)，活性物質(zhì)的種類(lèi)或量，以及期望效果的種類(lèi)或程度而確定。
溶菌酶鹽可以是與能夠形成鹽的各種物質(zhì)的鹽，例如，與有機(jī)酸的鹽、與無(wú)機(jī)酸的鹽、與有機(jī)堿的鹽，或與無(wú)機(jī)堿的鹽。而且，例如，構(gòu)成溶菌酶的天冬酰胺酸或谷氨酰胺酸的
或Y-羧基與金屬如鈉或鉀可以形成鹽。而且，例如，可以與構(gòu)成溶菌酶的堿性氨基酸的側(cè)鏈形成鹽。在本發(fā)明中，溶菌酶的生物學(xué)片段或溶菌酶-相關(guān)肽可以具有鹽的形式。溶菌酶的生物學(xué)片段是多肽或肽，其具有溶菌酶的部分氨基酸序列，并且具有與溶菌酶類(lèi)似的卵識(shí)別活性。溶菌酶-相關(guān)肽是蛋白、多肽或肽，其具有與溶菌酶類(lèi)似的卵識(shí)別活性，并且與溶菌酶和溶菌酶的生物學(xué)片段不同。溶菌酶-相關(guān)肽可以源自天然來(lái)源或可以是合成的化合物。通過(guò)技術(shù)如定點(diǎn)誘變法，溶菌酶-相關(guān)肽可以具有與天然溶菌酶不同的氨基酸序列。
而且，例如，還優(yōu)選的是，本發(fā)明的模擬卵的基材含有從目標(biāo)害蟲(chóng)的卵提取的組分。由此，可以獲得較高的卵運(yùn)送效果。可以將來(lái)自卵的粗提取物包含在基材中，或可以將提純的提取物包含在基材中?；闹械拇痔崛∥锘蚱涮峒儺a(chǎn)物的含量可以根據(jù)多種因素，諸如待使用的β_葡萄糖苷酶、其鹽、β_葡萄糖苷酶的生物學(xué)片段或β_葡萄糖苷酶-相關(guān)肽的種類(lèi)、特征、和量，害蟲(chóng)的種類(lèi)，以及期望效果的種類(lèi)和程度而確定。本領(lǐng)域中已知的方法可以用作從卵提取和提純有效成分的方法。
還可以在基材中包含甘`油，以維持或穩(wěn)定本發(fā)明的模擬卵中的葡萄糖苷酶、其鹽、其生物學(xué)片段或β -葡萄糖苷酶-相關(guān)肽作為卵識(shí)別信息素的活性，并且將其保持在基材的表面上。為了同樣的目的，纖維素酶、其鹽、其生物學(xué)片段或纖維素酶-相關(guān)肽也可包含在基材中。用于本發(fā)明的纖維素酶、其鹽、其生物學(xué)片段或纖維素酶-相關(guān)肽可以源自任何物種的生物體，或可以是合成的化合物。
纖維素酶的鹽可以是與能夠形成鹽的各種物質(zhì)的鹽，例如，與有機(jī)酸的鹽、與無(wú)機(jī)酸的鹽、與有機(jī)堿的鹽，或與無(wú)機(jī)堿的鹽。而且，例如，構(gòu)成纖維素酶的天冬酰胺酸或谷氨酰胺酸的或Y-羧基與金屬如鈉或鉀可以形成鹽。而且，例如，可以與構(gòu)成纖維素酶的堿性氨基酸的側(cè)鏈形成鹽。在本發(fā)明中，纖維素酶的生物學(xué)片段或纖維素酶-相關(guān)肽可以具有鹽的形式。纖維素酶的生物學(xué)片段是多肽或肽，其具有纖維素酶的部分氨基酸序列，并且具有與纖維素酶類(lèi)似的活性和作用。纖維素酶-相關(guān)肽是蛋白、多肽或肽，其具有與纖維素酶類(lèi)似的活性和作用，并且與纖維素酶和纖維素酶的生物學(xué)片段不同。纖維素酶-相關(guān)肽可以源自天然來(lái)源或可以是合成的化合物。通過(guò)技術(shù)如定點(diǎn)誘變法，纖維素酶-相關(guān)肽可以具有與天然纖維素酶不同的氨基酸序列。
高度提純的甘油或纖維素酶不是必需使用的。基材中甘油或纖維素酶的含量可以根據(jù)多種因素，諸如待使用的β_葡萄糖苷酶的種類(lèi)、特征、和量，害蟲(chóng)的種類(lèi)，活性物質(zhì)的種類(lèi)或量，以及期望效果的種類(lèi)或程度而確定。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種用于滅殺害蟲(chóng)的方法，所述方法包括對(duì)害蟲(chóng)提供本發(fā)明的模擬卵。通過(guò)本發(fā)明的方法滅殺或控制的害蟲(chóng)可以是任何害蟲(chóng)，條件是它具有卵運(yùn)送本能并且將β_葡萄糖苷酶、其鹽、其生物學(xué)片段或β_葡萄糖苷酶-相關(guān)肽識(shí)別為卵識(shí)別信息素。將本發(fā)明的模擬卵應(yīng)用于白蟻，能夠誘導(dǎo)卵運(yùn)送和卵保護(hù)行為，并且使白蟻將模擬卵運(yùn)送到其巢中的卵塊中。其不僅使白蟻運(yùn)送模擬卵到巢中的孵育室(breedingroom)，還能夠誘導(dǎo)護(hù)理行為如舔舐模擬卵的表面。通過(guò)使模擬卵含有活性成分如殺蟲(chóng)活性成分或生長(zhǎng)抑制成分，可能極其有效地滅殺害蟲(chóng)。
對(duì)其優(yōu)選應(yīng)用本發(fā)明的滅殺方法的害蟲(chóng)是白蟻。在滅殺白蟻的情況下，可以將本發(fā)明的模擬卵放置在蟻路或巢材料的一部分上。通過(guò)鉆在蟻路上鉆孔，并且可以將本發(fā)明的模擬卵注射到孔中。還可以將本發(fā)明的模擬卵包封在保護(hù)膜如玻璃紙中，以便在野外保持耐久性。在此情況下，可以對(duì)保護(hù)膜添加攝取促進(jìn)物質(zhì)如木材提取液體或腐爛的木材提取液體。為了本發(fā)明的害蟲(chóng)滅殺方法使用監(jiān)控站也是有效的。
由于通過(guò)使用本發(fā)明的模擬卵能夠簡(jiǎn)單地誘導(dǎo)和觀(guān)察昆蟲(chóng)的卵運(yùn)送行為，本發(fā)明的模擬卵也適合作為生物學(xué)研究的工具，用于學(xué)習(xí)和研究昆蟲(chóng)的行為和信息素。因此，在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種用于生物學(xué)研究的工具，所述用于生物學(xué)研究的工具基本包含本發(fā)明的模擬卵。本發(fā)明的工具可以是本發(fā)明的模擬卵本身，所述模擬卵和測(cè)試必需的裝置的組合，例如，測(cè)試試劑盒。使用本發(fā)明的工具，能夠研究昆蟲(chóng)的行為和信息素，或能夠研究昆蟲(chóng)的群居行為諸如卵運(yùn)送行為或梳理行為(grooming behavior)。
將通過(guò)下列實(shí)施例更具體和詳細(xì)地描述本發(fā)明，但是實(shí)施例僅用于示例，并且它們無(wú)意限制本發(fā)明。
實(shí)施例1
實(shí)施例1 :制備模擬卵和驗(yàn)證β -葡萄糖苷酶的卵識(shí)別活性
通過(guò)使用黃胸散白蟻(Reticulitermes speratus)工蟻(工蟻白蟻)，研究白蟻卵提取物、β -葡萄糖苷酶、卵清溶菌酶、纖維素酶、卵清溶菌酶和纖維素酶的混合物、卵清溶菌酶和葡萄糖苷酶的混合物、卵清溶菌酶和葡萄糖苷酶和纖維素酶的混合物、以及作為對(duì)照的50%的甘油水溶液的卵識(shí)別活性。
各個(gè)測(cè)試樣品制備如下。
將800 μ L的超純水加入到在Eppendorf管中的400mg的黃胸散白蟻卵中，攪勻，并且進(jìn)行超聲處理5分鐘，并且在15，OOOrpm進(jìn)行離心30分鐘。將上清液凍干，并且將5. Omg凍干的粉末溶解在IOOyL的30%的甘油水溶液中(白蟻卵提取物)。杏樹(shù)來(lái)源的β -葡萄糖苷酶(產(chǎn)品# G0395-5KU,批# 047K4037, SIGMA_ALDRICH(西格瑪奧德里奇))(1.Omg)溶解在IOyL的50%的甘油水溶液中(β-葡萄糖苷酶)。使用透析膜SnakeSkin (7000MWC0，產(chǎn)品 # :68700, PIERCE)使雞卵清溶菌酶(產(chǎn)品 # :L7651_10G，批 # 056K16901，SIGMA-ALDRICH (西格瑪奧德里奇))脫鹽，然后將2. Omg的脫鹽的雞卵清溶菌酶溶解在10μ L的50%的甘油水溶液中(卵清溶菌酶)。綠色木霉(trichoderma viridae)來(lái)源的纖維素酶(產(chǎn)品# :(1794-51^，批# 074K1304,SIGMA-ALDRICH(西格瑪奧德里奇))(1. Omg)溶解在10 μ L的50%的甘油水溶液中(纖維素酶)。卵清溶菌酶(2. Omg)和1. Omg的纖維素酶溶解在10μ L的50%的甘油水溶液中(卵清溶菌酶和纖維素酶的混合物溶液)。卵清溶菌酶(2. Omg)和1. Omg的β -葡萄糖苷酶溶解在10 μ L的50%的甘油水溶液中(卵清溶菌酶和β -葡萄糖苷酶的混合物)。卵清溶菌酶(2. Omg)、1. Omg的β -葡萄糖苷酶和1. Omg的纖維素酶溶解在10 μ L的50%的甘油水溶液中(卵清溶菌酶、β -葡萄糖苷酶和纖維素酶的混合物)。
將2. O μ L各種測(cè)試樣品添加到相等量的100個(gè)具有O. 5mm的直徑的玻璃珠，并且充分混合，由此，將測(cè)試樣品涂敷在玻璃珠的表面上。將僅涂敷有50%的甘油水溶液的玻璃珠用作對(duì)照。
將10個(gè)白蟻卵和20個(gè)通過(guò)以上方法得到的模擬卵隨機(jī)放置在直徑為30mm的培養(yǎng)皿上，并且將10只黃胸散白蟻的工蟻白蟻(工蟻)放置于其中，并且容許培養(yǎng)血在25°C恒溫室中靜置。測(cè)試開(kāi)始24小時(shí)和48小時(shí)后，研究模擬卵進(jìn)入到卵塊中的運(yùn)送率(對(duì)于每一份測(cè)試樣品，以相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn))。對(duì)于每一種測(cè)試重復(fù)8次實(shí)驗(yàn)。將運(yùn)送率轉(zhuǎn)化成反正弦根(arcsine root),并且通過(guò)雙側(cè)T檢驗(yàn)與對(duì)照進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。工蟻白蟻將分散在培養(yǎng)皿上的卵聚攏以形成卵塊，并且顯示了保育行為。涂敷有測(cè)試樣品中每一種的模擬卵進(jìn)入到卵塊中的運(yùn)送率(24小時(shí)后)顯示在圖1中。模擬卵進(jìn)入到卵塊中的運(yùn)送率(48小時(shí)后)顯不在圖2中。
由于β -葡萄糖苷酶的添加，卵識(shí)別活性顯著增加了。經(jīng)24小時(shí)和48小時(shí)的觀(guān)察，與僅有溶菌酶和纖維素酶的實(shí)驗(yàn)(其中未添加葡萄糖苷酶)相比，添加了葡萄糖苷酶的實(shí)驗(yàn)顯示了顯著高的卵識(shí)別活性(ρ<0. 001，雙側(cè)T-檢驗(yàn))。特別地，含有β-葡萄糖苷酶、溶菌酶和纖維素酶的模擬卵顯示了高運(yùn)送活性。
工業(yè)適用性
本發(fā)明提供害蟲(chóng)，特別 是白蟻的有效滅殺和控制，并且可應(yīng)用于殺蟲(chóng)劑生產(chǎn)、害蟲(chóng)驅(qū)除工業(yè)、建筑工業(yè)和園藝工業(yè)領(lǐng)域。另外，本發(fā)明還可應(yīng)用于生物學(xué)研究領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種模擬卵，所述模擬卵在其模擬白蟻的卵的基材中包含β-葡萄糖苷酶、其鹽、 其生物學(xué)片段或β -葡萄糖苷酶-相關(guān)肽作為卵識(shí)別信息素，其中所述鹽、生物學(xué)片段或 β-葡萄糖苷酶-相關(guān)肽具有與β-葡萄糖苷酶類(lèi)似的卵識(shí)別活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的模擬卵，其中所述基材包含溶菌酶、其鹽、其生物學(xué)片段或溶菌酶-相關(guān)肽，其中所述鹽、生物學(xué)片段或溶菌酶-相關(guān)肽具有與溶菌酶類(lèi)似的卵識(shí)別活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的模擬卵，其中所述基材包含纖維素酶、其鹽、其生物學(xué)片段或纖維素酶-相關(guān)肽，其中所述鹽、生物學(xué)片段或纖維素酶-相關(guān)肽具有與纖維素酶類(lèi)似的卵識(shí)別活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1至3中任一項(xiàng)的模擬卵，其中所述基材包含甘油。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1的模擬卵，其中所述基材包含溶菌酶、其鹽、其生物學(xué)片段或溶菌酶-相關(guān)肽，和纖維素酶、其鹽、其生物學(xué)片段或纖維素酶-相關(guān)肽，其中所述鹽、生物學(xué)片段或溶菌酶-相關(guān)肽具有與溶菌酶類(lèi)似的卵識(shí)別活性，并且其中所述鹽、生物學(xué)片段或纖維素酶-相關(guān)肽具有與纖維素酶類(lèi)似的卵識(shí)別活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1至3中任一項(xiàng)的模擬卵，包含選自由殺蟲(chóng)活性成分、孵化抑制物質(zhì)、 繁殖抑制物質(zhì)、生長(zhǎng)抑制活性成分、或昆蟲(chóng)病原微生物組成的組中的一種或多種成分。
7.一種用于滅殺白蟻的方法，所述方法包括對(duì)白蟻提供根據(jù)權(quán)利要求
6的模擬卵；和利用卵運(yùn)送行為使所述白蟻將所述模擬卵運(yùn)送到它的巢中。
8.一種用于生物學(xué)研究的工具，所述工具包括根據(jù)權(quán)利要求
1至6中任一項(xiàng)的模擬卵。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明提供一種模擬卵，所述模擬卵在其模擬害蟲(chóng)，特別是白蟻的卵的基材中包含β-葡萄糖苷酶、其鹽、其生物學(xué)片段或β-葡萄糖苷酶-相關(guān)肽作為卵識(shí)別信息素，一種使用所述模擬卵滅殺和控制害蟲(chóng)的方法，以及一種使用所述模擬卵進(jìn)行生物學(xué)研究的工具。
文檔編號(hào)A01M1/02GKCN102105051 B發(fā)布類(lèi)型授權(quán) 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N 200980128893
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2009年6月1日
發(fā)明者松浦健二 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人岡山大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專(zhuān)利引用 (2), 非專(zhuān)利引用 (3),