專利名稱:三尖杉屬植物殺線蟲生物堿的提取方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物農藥的制備，尤其從三尖杉屬植物提取殺線蟲生物堿的方法。
背景技術：
植物線蟲是一類重要的植物病原物，全世界廣泛分布，寄主范圍廣，給農林業生產帶來嚴重經濟損失。據估計，植物線蟲造成世界主要農作物的年損失率為12.3％(Sasser，1992)。由于農業逐漸向產業化發展，在蔬菜基地、花卉基地長期種植單一作物，使土壤中線蟲數量累積，植物線蟲病害問題日益突出。化學殺線劑長期以來是防治植物線蟲病害的有效措施，但目前應用的殺線劑均具有高毒、殘留時間長、污染環境及地下水源的缺點。因此，研究開發高效低毒的殺線劑非常必要和緊迫。從農業產業化發展和環境保護的角度來說，開發和研究高效、低毒的蔬菜、花卉、中草藥殺線劑更是迫在眉睫。
二十世紀70年代以來，從植物中尋找天然殺線蟲活性物質的研究逐漸受到重視。印度在這方面的研究較多，近幾年來，日本、意大利、美國、英國等西方國家也開始有這方面的研究報道，但至今大多是在初步資源篩選階段，對殺線蟲活性成分及殺線蟲機理研究很少。我國在植物性殺線劑方面的研究工作才剛開始。公開號為CN1105512的中國發明專利申請公開了一種從苦豆草中抽提出的主要成份為苦豆堿的溶液進行殺滅松材線蟲的方法，但該方法只提供殺滅一種線蟲的方法。本發明人在研究中發現三尖杉枝葉提取物對松材線蟲、根結線蟲及水稻潛根線蟲均有強殺線蟲活性。經進一步研究，本發明人發現三尖杉殺滅線蟲的有效成份是橋氧粗榧堿(drupacine，C18H21NO5)(尚未公開)。因此，利用三尖杉的有效成份將可能獲得一種殺滅多種植物線蟲的有效方法。
技術內容本發明提供一種殺線蟲有效物質橋氧粗榧堿(drupacine，C18H21NO5)。這種生物堿對植物寄生線蟲有強毒殺活性，0.1％濃度處理松材線蟲5天的殺線率為98.16％，處理南方根結線蟲54小時的殺線率為100％，處理水稻潛根線蟲72小時的殺線率為89.5％。本發明還提供了從三尖杉屬植物中提取、分離這種生物堿的方法。
利用三尖杉屬植物的根、莖、葉、種籽為原料，原料經晾干后粉碎，過40目篩，收集粉末，用95％工業乙醇浸提48小時以上，原料與95％工業乙醇的重量體積比為1∶2-2.5。浸提液濃縮至漿狀后加2％稀鹽酸溶解，過濾除渣，除去葉綠素、黃酮類及少量油脂等雜質。濾液用碳酸鈉粉末堿化至pH9，堿水液用與水不互溶的有機溶劑萃取，溶劑為氯仿、或苯、或甲苯、或二甲苯、或乙酸乙酯。萃取液水洗，回收有機溶劑，得到總生物堿。將總生物堿分成pH6-7及pH8-9兩部分，兩部分分別過硅膠柱，硅膠細度為200目，按濃縮抽干后的樣品與硅膠之比為1∶30稱取硅膠，濕法上柱。氯仿-甲醇梯度洗脫，氯仿∶甲醇＝98∶2，95∶5，90∶10。以150ml為一個餾分收集，并測定各餾分的殺線蟲活性，將具有殺線蟲活性的餾分再進行硅膠柱層析，即可得到純化的生物堿單體，測定已純化生物堿單體的殺線蟲活性，從而得到具殺線蟲活性的生物堿單體。
本發明的橋氧粗榧堿(drupacine，C18H21NO5)作為殺線蟲的有效成分，添加到農藥用載體或組合物中，應用于防治植物線蟲。或用三尖杉屬植物的提取物、分離部位或總生物堿添加到農藥用載體或組合物中，應用于防治植物線蟲。
本發明具有如下的優點或效果與現有的化學殺線劑相比，三尖杉屬植物生物堿具有高效低毒，低殘留及對作物的藥害更輕的特點。特別適合應用于蔬菜、中草藥、花卉及園林植物的線蟲病害防治。
具體實例實例1三尖杉小枝條4.5kg，晾干粉碎(過40目篩)得到粉末，用6600ml95％工業乙醇浸沒粉末，浸提一星期，濾出浸提液，濾渣再用4400ml95％工業乙醇浸提2天，濾出浸提液，濾渣再用4000ml95％工業乙醇浸提3天，濾出浸提液，濾渣再用2000ml95％工業乙醇洗，合并濾液。將濾液濃縮至漿狀，加2％稀鹽酸750ml并充分攪拌，過濾除渣，除去葉綠素、黃酮類及少量油脂等雜質。濾液加石油醚萃取，1000ml濾液加450ml石油醚，過濾，濾液用碳酸鈉堿化至pH9，再用氯仿萃取4次，氯仿液經水洗后加無水硫酸鈉除去氯仿液中的水，800ml氯仿液加水200ml，回收氯仿，得到總生物堿20.7g。
在總生物堿中加2％稀鹽酸700ml，濾紙過濾，濾液用飽和碳酸鈉堿化，先調至pH6，然后在濾液中加等體積的氯仿萃取。在萃取后剩余的濾液中再加飽和碳酸鈉調至pH7，然后在濾液中加等體積的氯仿萃取。將pH6及pH7萃取的氯仿液合并，濃縮去除氯仿，在低壓旋轉蒸發儀上進一步抽干，得到pH6-7部位棕色粉末10.4g。同樣，在萃取后剩余的濾液中再加飽和碳酸鈉調至pH8，加等體積的氯仿萃取；在萃取后剩余的濾液中再加飽和碳酸鈉調至pH9，加等體積的氯仿萃取，將pH8及pH9萃取的氯仿液合并，濃縮去除氯仿，在低壓旋轉蒸發儀上進一步抽干，得到pH8-9部位棕色粉末8.8g。
將分成的pH6-7及pH8-9兩部分，分別過硅膠柱，硅膠細度為200目，按樣品與硅膠之比為1∶30稱取硅膠，開始以氯仿洗柱，以后逐漸加大極性，氯仿∶甲醇＝98∶2，95∶5，90∶10。以150ml作為一個樣收集，蒸干溶劑，得到一個餾分。將各餾分做薄板層析，合并成分相同的餾分，將得到的各個餾分做殺線蟲活性生測，從而得到具有殺線蟲活性的生物堿餾分。將生測有活性的餾分進一步過小柱，收集餾分，同時將各餾分做薄層層析，層析顯色為單斑的餾分蒸干溶劑，即可得到純化的生物堿單體，測定已純化生物堿單體的殺線蟲活性，從而得到具殺線蟲活性的生物堿單體。測定該生物堿單體的氫譜、碳譜及核磁共振譜，將測得的數據與已知三尖杉生物堿作比較，從而確定該生物堿單體為橋氧粗榧堿drupacine，化學結構式為C18H21NO5。
實例2將上述具殺線蟲活性的生物堿，用少量丙酮助溶，加蒸餾水配成供試濃度(如0.1克總堿加蒸餾水至100毫升，濃度即為0.1％)，對松材線蟲，采用直徑為6cm的培養皿，用PDA培養基接種培養盤多毛孢菌，在25℃恒溫培養箱培養5天，菌絲長滿平皿。在長滿菌絲的培養皿中間放置一小塊長1cm，厚約0.5cm的小正方形脫脂棉塊。用微量注射器吸取0.5毫升配成供試濃度的生物堿溶液，注入棉塊中，再吸取0.1毫升線蟲液加入棉塊中央，每處理設4次重復，以2％丙酮溶液作對照。在25℃恒溫培養箱培養線蟲6天。將平皿內的培養基全部倒出，用改良貝曼漏斗法分離收集線蟲并計數，對線蟲的校正死亡率計算方法如下校正死亡率(％)＝(處理組線蟲死亡率-對照組線蟲死亡率/1-對照組線蟲死亡率)×100對松材線蟲的毒殺活性見表1。將配成的藥液浸泡線蟲后，對南方根結線蟲及水稻潛根線蟲的毒殺活性見表1，表2。
表1.橋氧粗榧堿(drupacine)及殺線劑益舒寶對線蟲的毒力回歸方程處理 毒力回歸方程 LC50(％) LC5095％置信限 LC95(％) 相關系數1 Y＝9.3445+1.6927x 0.00271 0.00266～0.00276 0.02541 0.99862 Y＝11.3746+2.4201x 0.002323 0.00229～0.00235 0.01111 0.93343 Y＝10.8411+2.7583x 0.00763 0.00627～0.00928 0.03011 0.9527注1 橋氧粗榧堿(drupacine)對松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)的毒力回歸方程(5天)2 殺線劑10％益舒寶顆粒劑對松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)的毒力回歸方程(5天)3 橋氧粗榧堿(drupacine)對南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)J2的毒力回歸方程(54h)表2.橋氧粗榧堿(drupacine)對水稻潛根線蟲(Hirschmanniella oryzae)的毒力測定(72h)
實例3將含有殺線蟲活性成分的三尖杉小枝條干燥后粉碎成粉末，過40目篩，收集粉末，以2公斤土拌粉末10-15克，然后裝盆，再種植非洲菊或其它花卉，可以有效防治土壤中根結線蟲的危害，促進植物健康生長。在大田應用時，每畝溝施粉末10公斤，對花生根結線蟲病的防治效果可達80％-90％，明顯優于目前常用化學殺線劑10％益舒寶顆粒劑的防效(77％)，且對花生的藥害更輕。
權利要求
1.從三尖杉屬植物中提取分離得到具有殺線蟲活性的生物堿單體為橋氧粗榧堿drupacine，化學結構式為C18H21NO5。
2.三尖杉屬植物殺線蟲生物堿的提取方法，其特征在于利用三尖杉屬植物的根、莖、葉、種籽為原料，原料經晾干后粉碎，過40目篩，收集粉末，用95％工業乙醇浸提48小時以上，原料與95％工業乙醇的重量體積比為1∶2-2.5，浸提液濃縮后加2％稀鹽酸溶解，過濾除渣，濾液用碳酸鈉粉末堿化至pH9，堿水液用與水不互溶的有機溶劑氯仿，或苯，或甲苯，或二甲苯，或乙酸乙酯萃取，萃取液水洗，得到總生物堿，將總生物堿分成pH6-7及pH8-9兩部分，兩部分分別過硅膠柱，硅膠細度為200目，按濃縮抽干后的樣品與硅膠之比為1∶30稱取硅膠，濕法上柱，氯仿-甲醇梯度洗脫，氯仿∶甲醇＝98∶2，95∶5，90∶10，以150ml為一個餾分收集，并測定各餾分的殺線蟲活性，將具有殺線蟲活性的餾分再進行硅膠柱層析，即可得到純化的生物堿單體，測定已純化生物堿單體的殺線蟲活性，從而得到具有殺線蟲活性的生物堿單體。
3.三尖杉屬植物殺線蟲生物堿的應用，其特征在于(1)將生物堿單體橋氧粗榧堿(drupacine，C18H21NO5)作為殺線蟲的有效成分，添加到農藥用載體或組合物中，應用于防治植物線蟲，或將生物堿單體橋氧粗榧堿配成不同濃度的藥液噴施或澆灌或浸泡處理，以防治植物線蟲。(2)將三尖杉植株的小枝條或莖、或根、或種籽干燥后粉碎成粉末，盆栽應用時，以2公斤土拌粉末10-15克，可有效防治土壤中根結線蟲的危害，促進植物健康生長，在大田應用時，每畝溝施粉末10公斤，對植物根結線蟲病的防治效果可達80％-90％，明顯優于目前常用化學殺線劑10％益舒寶顆粒劑的防效(77％)，且對植物的藥害更輕。
專利摘要
本發明涉及生物農藥，尤其是殺線蟲生物農藥的制備方法。本發明提供一種天然殺線蟲有效物質橋氧粗榧堿(drupacine，C
文檔編號A01N33/00GKCN1545888SQ200310112424
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月3日
發明者文艷華, 張鳳仙, 王小菁, 劉梅芳, 葉萬輝, 馮志新 申請人:華南農業大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan