一種溫度誘導皺紋盤鮑三倍體的方法

本發明涉及海洋農業中貝類遺傳育種領域，特別涉及一種人工誘導皺紋盤鮑三倍體的方法。

背景技術：

1、皺紋盤鮑(haliotisdiscushannai)是我國一種重要的海水養殖經濟貝類，近年來已逐步成為我國南方海區鮑類養殖的主要品種。

2、由于三倍體鮑的配子為非整倍體，其用于性腺發育的代謝能全部用于生長，因此，三倍體鮑有個體大、生長快、肉質好等優點，且由于其不育性和雜合性而表現出更好的生長和抗逆性。因此，三倍體鮑具有巨大的市場潛力和商業價值，能夠大大加快產品上市時間且得到質量更高的個體。

3、鮑三倍體誘導常用的方法主要是物理法和化學法，包括冷休克法、靜水壓法、藥物誘導法，均可通過阻斷減數分裂誘導出最具商業價值的同源和異源三倍體鮑。或者也可通過交配四倍體鮑和二倍體鮑來產生三倍體個體，但目前四倍體成體存活率并不高，很難進行推廣。化學法誘導存在藥物殘留及毒性問題，且幼蟲致畸率較高。

4、為了解決上述技術難題，本申請提出利用溫度休克法人工誘導皺紋盤鮑三倍體。相較于現有技術而言，溫度休克法設備簡便、價格低廉，更適合大規模生產。此法選育出的皺紋盤鮑三倍體具有耐熱性，可減少漁戶因鮑度夏難而導致的經濟損失。因此，開展皺紋盤鮑三倍體誘導技術研究，生產皺紋盤鮑三倍體苗種，對推動我國皺紋盤鮑產業技術升級具有重要意義。

技術實現思路

1、有鑒于此，本發明提供了一種人工誘導皺紋盤鮑三倍體的方法，通過該方法可高效獲得皺紋盤鮑三倍體。

2、為了實現上述的技術目的，本發明所采用的技術方案為：

3、本發明提供了一種人工誘導皺紋盤鮑三倍體的方法，包括如下步驟：

4、將精子和卵子混合，進行人工受精；受精15min后，將受精卵置于預熱的海水中進行熱休克處理，以抑制受精卵第二極體的排出；熱休克處理的溫度為26～31℃，時間為10～15min。

5、作為優選，精子與卵子的體積比為(9～11)：1。

6、在本發明提供的具體實施例中，精子與卵子的體積比為10：1。

7、作為優選，受精15min后，對受精卵進行熱休克處理。

8、作為優選，熱休克處理的溫度為28～30℃，時間為10～15min。

9、更優選地，熱休克處理的溫度為28～30℃，時間為12～15min。

10、本發明提供了一種人工誘導皺紋盤鮑三倍體的方法。該方法包括如下步驟：

11、1)種鮑的促熟及選擇：取殼長為65mm～80mm，個體活力良好且無外部損傷的皺紋盤鮑作為種鮑，按雌雄分別放置于種鮑培育池中促熟，從中選擇出性腺發育良好且飽滿的二倍體鮑；按雌雄分別放置于種鮑培育池中促熟，從中選擇出性腺發育良好且飽滿的二倍體鮑；所述種鮑為3齡皺紋盤鮑；所述性腺發育良好的雌性個體的性腺接近墨綠色，性腺飽滿；所述倍性確定的方法是剪取鮑部分上足觸手用于流式細胞儀檢測。所述種鮑培育池內性別特征必須單一。

12、2)人工催產：將種鮑陰干2h～2.5h后，將雌雄個體嚴格區分置于不同水箱中，注入照射強度為800～1200mwh/l紫外線處理海水，每隔1h更換一次海水直至配子排放，期間注意防止意外受精并及時查看種鮑情況；

13、3)配子的選擇和混合受精：使用300目的篩絹濾除步驟2)配子中的雜質，鏡檢選擇質量高的卵子和活力強的精子。將活力好的精子和質量高的卵子以質量比為(9～11)︰1進行混合，分為處理組和對照組，此時受精溫度可為18～22℃，鹽度為30～35；

14、4)熱休克誘導：配子受精15min后觀察到受精卵出現第一極體比例為60％～80％時，將受精卵收集至溫度為26～31℃海水中處理10～15min；

15、5)孵育：熱休克結束后立即將受精卵收集至18～22℃孵育水箱中，按照常規孵化及后期培育方法進行孵育，后續使用流式細胞儀確定擔輪幼蟲三倍體率。

16、本發明具有的技術效果為：

17、本發明制備人工誘導皺紋盤鮑三倍體的方法，實現了熱休克誘導可培育出人工三倍體鮑苗，提高了多倍體育苗效率。與已有鮑三倍體制備方法相比，本發明通過改良親鮑催產方式、優化誘導條件(熱休克處理溫度及時間)，從而實現皺紋盤鮑三倍體的高效穩定獲得。本技術操作方便、高效實用，便于大量推廣。此法選育出的皺紋盤鮑三倍體具有耐熱性，可減少漁戶因鮑度夏難而導致的經濟損失。在皺紋盤鮑生產和多倍體選育優良品種上具有重大應用價值和廣闊的應用前景。

18、1、高效催產方式：采用陰干結合紫外線照射海水刺激的方法，確保種鮑能順利排出高質量配子，便于后續受精及誘導。

19、2、優化誘導條件：精卵混合5min后，不段使用普通光學顯微鏡連續觀察受精卵情況。受精約15min后，當第一極體出現60％～80％時進行誘導處理，確保實驗穩定性，提高三倍體率。

20、3、簡單無害的誘導方式：熱休克誘導皺紋盤鮑三倍體的方法，設備簡便、價格低廉，更適合大規模生產。

技術特征：

1.一種人工誘導皺紋盤鮑三倍體的方法，其特征在于，將精子和卵子混合，進行人工受精；受精15min后，觀察到受精卵出現第一極體比例為60％～80％時，將受精卵置于預熱的海水中進行熱休克處理，以抑制受精卵第二極體的排出；熱休克處理的溫度為26～31℃，時間為10～15min。

2.根據權利要求1所述的人工誘導皺紋盤鮑三倍體的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

3.根據權利要求2所述人工誘導皺紋盤鮑三倍體的方法，其特征在于，在步驟1)中，所述種鮑的促熟及選擇的具體方法為：取殼長為65mm～80mm，個體活力良好且無外部損傷的皺紋盤鮑作為種鮑，按雌雄分別放置于種鮑培育池中促熟，從中選擇出性腺發育良好且飽滿的二倍體鮑；所述種鮑為3齡皺紋盤鮑。

4.根據權利要求2所述人工誘導皺紋盤鮑三倍體的方法，其特征在于在步驟2)中，所述人工催產的具體方法為：采用陰干結合紫外線照射海水刺激的方法對性腺發育成熟的個體進行催產，直至雌雄種鮑產卵和排精為止；所述陰干結合紫外線照射海水刺激的方法為：種鮑陰干2h～2.5h后，將雌雄個體嚴格區分置于不同水箱中，注入照射強度為800～1200mwh/l紫外線處理海水，每隔1h更換一次海水直至配子排放，期間注意防止意外受精并及時查看種鮑情況。

5.根據權利要求2所述人工誘導皺紋盤鮑三倍體的方法，其特征在于在步驟3)中，所述配子的選擇的具體方法為：使用300目的篩絹濾除步驟2)配子中的雜質，鏡檢選擇質量高的卵子和活力強的精子；所述質量高的卵子是指新鮮卵液中的卵子應卵膜完整、形狀規則且不存在意外受精；所述活力好的精子是指活動性和分散度良好的新鮮精子。

6.根據權利要求2所述人工誘導皺紋盤鮑三倍體的方法，其特征在于在步驟3)中，所述混合受精的具體方法為：將確定的活力好和質量高的精子和卵子混合，分為處理組和對照組，所述精子與卵子的質量比為(9～11)︰1；所述受精溫度為18～22℃，鹽度為30～35。

7.根據權利要求2所述人工誘導皺紋盤鮑三倍體的方法，其特征在于，在步驟4)中，熱休克誘導過程中持續監控海水溫度的穩定性，并使用顯微鏡不斷觀察受精卵的發育情況。

8.根據權利要求2所述人工誘導皺紋盤鮑三倍體的方法，其特征在于，在步驟5)中，所述孵育的具體方法為：熱休克結束后立即將受精卵收集至18～22℃孵育水箱中；按照常規孵化及后期培育方法進行，后續使用流式細胞儀確定擔輪幼蟲三倍體率。

技術總結
本發明涉及貝類遺傳育種領域，特別涉及一種人工誘導皺紋盤鮑三倍體的方法。該方法包括以下步驟：1)種鮑的促熟及選擇：選取無病害種鮑置于種鮑培育池中同步促熟，從中選擇性腺發育良好的二倍體鮑；2)人工催產：將挑選的種鮑進行催產，至雌雄種鮑產卵和排精為止；3)配子的選擇和混合受精：分別濾除精卵中的雜質，將精子與卵子混合進行人工受精，得受精卵；4)熱休克誘導：受精15min后，將受精卵置于預熱溫度為26～31℃的海水中處理10～15min，以抑制受精卵第二極體的排出；5)孵育：熱休克結束后立即將受精卵收集至孵育水箱中進行孵化培育。此法選育出的皺紋盤鮑三倍體具有耐熱性，可減少漁戶因鮑度夏難而導致的經濟損失。通過改良種鮑催產方式，優化誘導條件，可實現皺紋盤鮑三倍體的高效穩定獲得。

技術研發人員：狄桂蘭,陳新華,蔣明媚,張宇,楊威龍,武云龍,馬澤淵
受保護的技術使用者：福建農林大學
技術研發日：
技術公布日：2024/10/21