本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術領域，尤其是一種鐵皮石斛離體培養(yǎng)再生植株的方法。
背景技術：
鐵皮石斛是蘭科草本植物，生于海拔達1600米的山地半陰濕的巖石上，主要分布于中國安徽、浙江、福建等地；其莖入藥，屬補益藥中的補陰藥；益胃生津，滋陰清熱。
組織培養(yǎng)已在蘭花生產中廣泛使用，并且不斷有改進的技術和新方法推出。直接以組織培養(yǎng)物替代使用原藥材或者生產活性成分也是解決石斛資源短缺的方法之一，但目前涉及到該方面的研究還很少。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的是提供一種鐵皮石斛離體培養(yǎng)再生植株的方法，本發(fā)明解決的技術問題是提供一種鐵皮石斛離體培養(yǎng)再生植株的方法。
為了解決上述問題，本發(fā)明采用的技術方案是：
這種鐵皮石斛離體培養(yǎng)再生植株的方法依次包括外植體前預理、愈傷組織培養(yǎng)、不定芽培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)，壯苗培養(yǎng)之后進行不定根培養(yǎng)；
外植體為新鮮、無病害的鐵皮石斛葉子；
不定根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有5克/升～10克/升吲哚乙酸、80克/升～100克/升肌醇、10克/升～20克/升腺嘌呤、50毫克/升～100毫克/升水解酪蛋白和8克/升～14克/升萘乙酸的ms培養(yǎng)基。
上述鐵皮石斛離體培養(yǎng)再生植株的方法技術方案中，更具體的技術方案還可以是：愈傷組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有1.5mg/l～2mg/l2，4-d、20mg/l～32mg/lga、1.0mg/l～1.2mg/l6-ba和30g/l～50g/l的蔗糖的ms培養(yǎng)基。
進一步的，愈傷組織培養(yǎng)的溫度為23℃～26℃，光照度為1200～1500lx。
進一步的，不定芽培養(yǎng)培養(yǎng)過程中采用的培養(yǎng)基為含有100g/l～150g/l蘋果汁和2mg/l～3mg/l萘乙酸的ms培養(yǎng)基。
進一步的，不定芽培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和不定根培養(yǎng)過程中的溫度為26℃～28℃，光照度為1400～1700lx。
進一步的，壯苗培養(yǎng)過程中的壯苗培養(yǎng)基為含有添加5克/升～15克/升萘乙酸、5克/升～10克/升的硝酸鉀和36克/升～50克/升蛋白胨的ms培養(yǎng)基。
更進一步的，生根培養(yǎng)過程中的生根培養(yǎng)基為含有10克/升～20克/升吲哚乙酸、80克/升～100克/升葡萄糖和8克/升～14克/升萘乙酸的ms培養(yǎng)基。
由于采用了上述技術方案，本發(fā)明與現有技術相比具有如下有益效果：
1、本發(fā)明以鐵皮石斛葉子作為外植體，在不定芽培養(yǎng)和壯苗培養(yǎng)之后進行不定根培養(yǎng)，不定根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有5克/升～10克/升吲哚乙酸、80克/升～100克/升肌醇、10克/升～20克/升腺嘌呤、50毫克/升～100毫克/升水解酪蛋白和8克/升～14克/升萘乙酸的ms培養(yǎng)基，與現有的鐵皮石斛組織培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明出根量大，生根效果好。
2、本發(fā)明壯苗培養(yǎng)基中添加硝酸鉀，鉀元素的加入能夠有效抑制鐵皮石斛植株褐變。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳述：
實施例1
本實施例采用新鮮、無病害的鐵皮石斛葉子作為外植體，采用75%的酒精消毒；然后轉入愈傷組織培養(yǎng)基中，設置溫度為愈傷組織培養(yǎng)的溫度為23℃～26℃，光照度為1200～1500lx，培養(yǎng)15天；然后轉入生根培養(yǎng)基中，設置溫度為26℃～28℃，光照度為1400～1700lx，培養(yǎng)10天；再轉入壯苗培養(yǎng)基中，設置溫度為26℃～28℃，光照度為1400～1700lx，培養(yǎng)13天；最后轉入生根培養(yǎng)基中，設置溫度為26℃～28℃，光照度為1400～1700lx，培養(yǎng)10天。
本實施例愈傷組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有1.5mg/l2，4-d、20mg/lga、1.0mg/l6-ba和40g/l的蔗糖的ms培養(yǎng)基。
本實施例不定根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有7克/升吲哚乙酸、80克/升肌醇、17克/升腺嘌呤、100毫克/升水解酪蛋白和8克/升萘乙酸的ms培養(yǎng)基。
本實施例壯苗培養(yǎng)過程中的壯苗培養(yǎng)基為含有添加5克/升萘乙酸、10克/升的硝酸鉀和50克/升蛋白胨的ms培養(yǎng)基
本實施例不定芽培養(yǎng)培養(yǎng)過程中采用的培養(yǎng)基為含有150g/l蘋果汁和2mg/l萘乙酸的ms培養(yǎng)基。
實施例2
本實施例采用新鮮、無病害的鐵皮石斛葉子作為外植體，采用75%的酒精消毒；然后轉入愈傷組織培養(yǎng)基中，設置溫度為愈傷組織培養(yǎng)的溫度為23℃～26℃，光照度為1200～1500lx，培養(yǎng)17天；然后轉入生根培養(yǎng)基中，設置溫度為26℃～28℃，光照度為1400～1700lx，培養(yǎng)13天；再轉入壯苗培養(yǎng)基中，設置溫度為26℃～28℃，光照度為1400～1700lx，培養(yǎng)18天；最后轉入生根培養(yǎng)基中，設置溫度為26℃～28℃，光照度為1400～1700lx，培養(yǎng)15天。
本實施例愈傷組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有1.65mg/l2，4-d、27mg/lga、1.1mg/l6-ba和30g/l的蔗糖的ms培養(yǎng)基。
本實施例不定根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有10克/升吲哚乙酸、90克/升肌醇、20克/升腺嘌呤、80毫克/升水解酪蛋白和11克/升萘乙酸的ms培養(yǎng)基。
本實施例壯苗培養(yǎng)過程中的壯苗培養(yǎng)基為含有添加8克/升萘乙酸、5克/升的硝酸鉀和42克/升蛋白胨的ms培養(yǎng)基
本實施例不定芽培養(yǎng)培養(yǎng)過程中采用的培養(yǎng)基為含有120g/l蘋果汁和2.4mg/l萘乙酸的ms培養(yǎng)基。
實施例3
本實施例采用新鮮、無病害的鐵皮石斛葉子作為外植體，采用75%的酒精消毒；然后轉入愈傷組織培養(yǎng)基中，設置溫度為愈傷組織培養(yǎng)的溫度為23℃～26℃，光照度為1200～1500lx，培養(yǎng)20天；然后轉入生根培養(yǎng)基中，設置溫度為26℃～28℃，光照度為1400～1700lx，培養(yǎng)16天；再轉入壯苗培養(yǎng)基中，設置溫度為26℃～28℃，光照度為1400～1700lx，培養(yǎng)15天；最后轉入生根培養(yǎng)基中，設置溫度為26℃～28℃，光照度為1400～1700lx，培養(yǎng)13天。
本實施例愈傷組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有2mg/l2，4-d、32mg/lga、1.2mg/l6-ba和50g/l的蔗糖的ms培養(yǎng)基。
本實施例不定根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有5克/升吲哚乙酸、100克/升肌醇、10克/升腺嘌呤、50毫克/升水解酪蛋白和14克/升萘乙酸的ms培養(yǎng)基。
本實施例壯苗培養(yǎng)過程中的壯苗培養(yǎng)基為含有添加15克/升萘乙酸、8克/升的硝酸鉀和36克/升蛋白胨的ms培養(yǎng)基
本實施例不定芽培養(yǎng)培養(yǎng)過程中采用的培養(yǎng)基為含有100g/l蘋果汁和3mg/l萘乙酸的ms培養(yǎng)基。