一種吸煙引起樹鼩多器官纖維化模型的建立方法與流程

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種吸煙引起樹鼩多器官纖維化模型的建立方法。

背景技術(shù)：

煙草流行是世界迄今所面臨的最大公共健康威脅之一。尼古丁是煙草中含量最多，毒性最大的化學成分。尼古丁能通過改變纖維母細胞的功能調(diào)節(jié)纖維化。香煙煙霧通過呼吸道到達小氣道和肺泡時被迅速吸收進入體內(nèi)血液循環(huán)，然后通過循環(huán)系統(tǒng)分散到全身各個器官，作用于尼古丁受體細胞，改變其生理過程。每個組織器官的纖維化形成與自身器官功能和器官特異性上皮細胞的微環(huán)境有關(guān)，具有自身獨特的特征。纖維化發(fā)生是一個漸進性的過程：煙草中的有害物質(zhì)刺激組織器官使其上皮細胞或內(nèi)皮屏障損傷，促使成纖維細胞的細胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞活化；活化的細胞外基質(zhì)產(chǎn)生細胞發(fā)生結(jié)構(gòu)和表型的改變，產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)。同時胞內(nèi)的促分裂素原活化蛋白激酶和核轉(zhuǎn)錄因子通路被激活，促進產(chǎn)生大量的細胞因子。通過旁分泌，介導包括巨噬細胞在內(nèi)的炎癥細胞向受刺激部位移動。t細胞被激活，分泌促纖維化生長因子，如白細胞介素和腫瘤壞死因子α等。巨噬細胞促進纖維原細胞增殖與分化，同時分泌包括轉(zhuǎn)化生長因子β和il-1在內(nèi)的多種細胞因子。損傷因素持續(xù)存在，造成反復損傷。成纖維細胞繼續(xù)被激活，產(chǎn)生更多的細胞外基質(zhì)。細胞因子持續(xù)不斷的引起組織炎癥和膠原過度表達，細胞外基質(zhì)不斷沉積，組織器官纖維化逐漸形成，最終造成臟器功能喪失。在損傷-炎癥-修復的三期過程中，任何一項或多項過程的失調(diào)，均可造成纖維化的發(fā)生。炎癥能導致各種細胞因子分泌失調(diào)，生理性愈合轉(zhuǎn)變?yōu)椴±硇岳w維化。

目前的研究強調(diào)用小鼠模型來定義香煙煙霧暴露的由細胞，分子和病理學結(jié)果，且運用吸煙動物模型來預測治療吸煙疾病新療法的療效。雖然嚙齒類動物有以下優(yōu)點：(1)研究者對鼠類生物習性相對熟悉；(2)價格相對低廉、體積小和繁殖周期快；(3)可使用許多近交系及其突變體并應用相關(guān)酶抗體和基因探針；(4)其基因序列和人類基因同源性很高，且在免疫相關(guān)實驗中可以操縱它們的基因表達。但是，嚙齒類動物和人類必然存在解剖和生理上的差異。豚鼠也作為吸煙模型動物被使用，但是研究其的研究通路所需的試劑很難找到。而非靈長類動物吸煙動物模型有以下優(yōu)點：(1)在遺傳、解剖、組織學和生理學上與人類有更大的相似性；(2)在吸煙條件下，非靈長類動物呼吸道的病理學變化與嚙齒類動物相比更明顯；(3)與嚙齒類動物相比，可對非靈長類動物使用支氣管鏡和肺功能檢查；(4)非靈長類吸煙模型的肺組織樣本的生物指標可用于人類吸煙者疾病的早期檢查。但非靈長類動物吸煙動物模型其研究成本昂貴。目前有必要尋找更好的能概括人類吸煙器官生理和病理變化的動物模型。因此迫切需要探尋更可靠更有效的新物種來構(gòu)建吸煙動物模型，幫助我們更好的進行研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種吸煙引起樹鼩多器官纖維化模型的建立方法。本發(fā)明通過對樹鼩進行香煙煙霧處理，誘導樹鼩多器官纖維化。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種吸煙引起樹鼩多器官纖維化模型的建立方法，包括以下步驟：

(1)將野生樹鼩馴化三個月后，在不通風的房間內(nèi)，讓樹鼩在自然呼吸狀態(tài)下吸收香煙煙霧，每天兩次，每次30分鐘，每周6天，暴露時間為9個月；所述香煙煙霧是燃燒煙葉產(chǎn)生的煙霧，煙葉的使用量為每立方米空間使用100g煙葉；

(2)用masson染色評價樹鼩吸煙引起多器官肺纖維化動物模型。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下突出的優(yōu)點及有益效果：

(1)樹鼩有許多有價值的特性，具有作為生物醫(yī)學研究實驗動物的潛能，在遺傳、解剖、生物學上與人類有相似之處。

(2)本發(fā)明方法成功地建立了樹鼩多器官纖維化模型，操作過程簡單，易重復，可以有效解決嚙齒類動物模型在組織解剖結(jié)構(gòu)上與人類差異顯著的問題，同時也可以避免使用非靈長類動物模型的高成本投入；這將對今后研究吸煙引起器官纖維化發(fā)病機制和治療藥物提供良好的模型基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為肺組織masson染色量化圖。

圖2為心組織masson染色量化圖。

圖3為肝組織masson染色量化圖。

圖4為腎組織masson染色量化圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明實施方式不限于此。

實施例1：

具體造模流程和檢測方法如下：

(1)動物分組：將24只野生樹鼩馴化三個月后隨機分成兩組，實驗組18只，對照組6只。

(2)香煙煙霧造模：實驗組暴露于燃燒煙葉不通風的房間30分鐘，讓樹鼩在自然呼吸狀態(tài)下吸收香煙煙霧，一天兩次，每周6天，暴露時間長達9個月；所述香煙煙霧是燃燒煙葉產(chǎn)生的煙霧，煙葉的使用量為每立方米空間使用100g煙葉；對照組暴露于空氣。分別于3月、6月、9月處死樹鼩，觀察肺、心、肝、腎組織變化。

(3)飼養(yǎng)條件：成年的中國樹鼩從中國科學院昆明動物研究所獲得。所有動物飼養(yǎng)在籠子里(320厘米×180厘米×160厘米)，在實驗開始前飼養(yǎng)三個月以適應環(huán)境。飼養(yǎng)環(huán)境保持在恒定的溫度(20-25℃)、濕度(40-60％)、12h光照和12h黑暗、充足的水和食物。

(4)動物處死及標本制作：腹腔注射戊巴比妥鈉處死樹鼩，開胸取肺、心、肝、腎組織，置于福爾馬林中浸泡，進行組織病理檢測。

實施例2：

對樹鼩肺、心、肝、腎組織進行纖維化程度檢測：

(1)肺纖維化程度：采用masson染色方法觀察肺組織纖維化程度。

(2)心纖維化程度：采用masson染色方法觀察心組織纖維化程度。

(3)肝纖維化程度：采用masson染色方法觀察肝組織纖維化程度。

(4)腎纖維化程度：采用masson染色方法觀察腎組織纖維化程度。

實施例3：

造模結(jié)果評定：

(1)肺纖維程度變化：masson染色顯示實驗組氣管、血管周圍、肺泡間隔纖維蛋白的數(shù)量增加，如圖1所示。

(2)心纖維程度變化：masson染色顯示實驗組心肌細胞間隙和血管周圍纖維蛋白的數(shù)量增加，如圖2所示。

(3)肝纖維程度變化：masson染色顯示實驗組竇周和血管周圍纖維蛋白的數(shù)量增加，如圖3所示。

(4)腎纖維程度變化：masson染色顯示實驗組腎小球周圍纖維蛋白的數(shù)量增加，如圖4所示。

18只樹鼩按本發(fā)明方法建立肺纖維化模型，全部成功，說明本方法可以有效建立樹鼩肺纖維化模型，可重復性高。

綜上，本發(fā)明方法可成功建立樹鼩纖維化模型，操作過程簡單，易重復，可以用于嚙齒類動物模型無法完成的生物技術(shù)新藥的評價，同時也可以避免使用非靈長類動物模型的高成本投入。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種吸煙引起樹鼩多器官纖維化模型的建立方法。該方法是將野生樹鼩馴化三個月后，在不通風的房間內(nèi)，讓樹鼩在自然呼吸狀態(tài)下吸收香煙煙霧，每天兩次，每次30分鐘，每周6天，暴露時間為9個月；所述香煙煙霧是燃燒100g煙葉產(chǎn)生的煙霧；用Masson染色評價樹鼩吸煙引起多器官肺纖維化動物模型。本發(fā)明方法成功地建立了樹鼩多器官纖維化模型，操作過程簡單，易重復，可以有效解決嚙齒類動物模型在組織解剖結(jié)構(gòu)上與人類差異顯著的問題。這將對今后研究吸煙引起器官纖維化發(fā)病機制和治療藥物提供良好的模型基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：楊世華;吳綺琪;黃群山
受保護的技術(shù)使用者：華南農(nóng)業(yè)大學
技術(shù)研發(fā)日：2017.03.30
技術(shù)公布日：2017.08.04