煙草富鉀篩選和鑒定方法與流程

本發明涉及煙草遺傳性與品種選育領域，特別是涉及煙草富鉀篩選和鑒定方法。

背景技術：

鉀是煙草最重要的品質元素之一，其與煙葉成熟度、燃燒性、香吃味和卷煙制品安全性密切相關。與國外煙葉鉀含量(＞3％)相比，中國大部分地區尤其是北方地區，煙葉平均鉀含量很少超過1.5％，煙葉鉀含量偏低是制約中國煙葉質量提升的關鍵指標之一。生產優質煙葉必須施用形成最適產量需鉀量的2～3倍的鉀肥，才能明顯提高煙葉鉀含量，但我國鉀肥資源匱乏，通過改善農藝操作來提高鉀含量又有一定的限度，因此篩選或選育烤煙鉀高效基因型品種，充分利用土壤以及施用的鉀素，對提高煙葉鉀含量、降低生產成本、節約資源有重要意義。

目前，國際煙草育種領域內無培育富鉀煙草品種的方法，也沒有選育出富鉀煙草品種。為了提高煙葉鉀含量一般采用以下兩種方法：

1、常規雜交篩選法：首先對雜交所用親本進行雜交組合的雜種優勢、配合力和遺傳力分析，然后選用具有不同鉀吸收效率的煙草親本進行雜交，一株一株的測定雜交后代的煙葉鉀含量，從中篩選出煙葉鉀含量較高的變異植株。但是常規雜交篩選法必須在煙葉收獲后進行大量檢測才知結果，因此，盲目性大，工作量大。

2、轉基因法：利用基因工程技術把一些鉀高效基因轉入到其他植株內并誘導其表達，可以快速并高效的獲得鉀高效植物，但現在國際上限制煙草轉基因用于生產，故該技術不能利用。并且，在轉基因法中，鉀積累的遺傳特性受多基因控制，具有數量遺傳特征，且受環境條件影響較大。如果單純地測定與鉀吸收和轉運相關的基因，可能得不到富鉀煙草變異類型，即一些測試結果與大田試驗結果并不一致，這就是目前富鉀煙草培育不出來的主要原因。

技術實現要素：

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種煙草富鉀篩選和鑒定方法，該方法省時省力、操作性強，大大提高富鉀煙草品種的篩選效率。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供一種煙草富鉀篩選和鑒定方法，包括以下步驟：1)將煙草種子播種至低鉀培養基上進行育苗，依據煙苗對低鉀反應的程度，將煙苗劃分等級，篩選出變黃程度高且有活性的植株移植至完全營養液上生長；2)將所選植株移栽至大田，追施鉀肥，于成熟期對所選植株上相同葉位的煙葉殺青、烘干、磨碎、過篩，測定鉀含量，標記鉀含量高的所述植株；3)收獲鉀含量高的所述植株的種子，通過重復所述步驟1)、所述步驟2)種植篩選，直至基因型純合，選育出富鉀煙草品種。

優選地，所述煙草富鉀篩選和鑒定方法還包括對所述煙草種子的選取及消毒的步驟，具體過程為：選取飽滿一致的煙草種子；將所述煙草種子置于45-55℃溫水浸泡2-3h；然后采用質量分數為70-80％的CH₃CH₂OH水溶液處理30-40s，再采用無菌水沖洗4-7次，然后使用質量分數為9-11％次氯酸水溶液處理25-35min，再采用無菌水沖洗4-7次。

優選地，在所述步驟1)中，所述低鉀培養基的鉀濃度為0.10-0.17mmoL/L。一般來講，煙草種子育苗選用的培養基的完全營養液的鉀濃度為5.5-6.5mmoL/L，而本發明中采用低鉀培養基選用的低鉀營養液的鉀濃度控制在0.10-0.17mmoL/L，大大低于完全營養液的鉀濃度。

優選地，在所述步驟1)中，所述完全營養液的鉀濃度為5.5-6.5mmoL/L。

優選地，在所述步驟1)中，在所述步驟1)中，依據煙苗對低鉀反應的程度，將煙苗劃分以下四個等級：

一級：煙葉嚴重變黃，變黃率可達到80-100％，植株極度矮化，發育嚴重受阻；

二級：煙葉中度變黃，變黃率可達到60-80％，植株中度矮化，發育嚴重延遲；

三級：煙葉輕度變黃，變黃率可達到40-60％，植株稍微矮縮，發育延遲；

四級：煙葉略帶黃色，變黃率可達到10-40％，生長率仍較正常；

其中，所述植株的煙葉的鉀含量為：一級＞二級＞三級＞四級。

優選地，在所述步驟1)中，需將所述低鉀培養基放入人工氣候室中進行育苗，人工氣候室的條件設置為：白天光照為260-350μmol photons·m^-2·s^-1，夜間光照為0μmol photons·m^-2·s^-1，光暗周期為(14-16)/(10-8)h，晝夜溫度為(27-29)/(24-26)℃，空氣相對濕度為60％～70％。

在所述步驟2)中，所述追施鉀肥的具體過程為：在所述步驟2)中，所述追施鉀肥的具體過程為：于植株移栽至大田后25-55d內間隔追施鉀肥三次，每次每株植株各追施的鉀肥以鉀元素重量計為1.0-1.2g。

優選地，所述追施鉀肥的方式為：將所述鉀肥配置成溶液，將溶液穴施于距離所述植株的主莖19-21cm處。

優選地，在所述步驟2)中，所述選取各個植株上相同葉位的煙葉具體過程為：于植株移栽至大田后80d選取植株的第12葉位的煙葉。

優選地，在所述步驟2)中，所述選取各個植株上相同葉位的煙葉具體過程為：于植株移栽至大田后110d選取植株的第18葉位的煙葉。

優選地，在所述步驟2)中，采用鹽酸浸提-火焰光度法測定鉀含量。

本發明還公開另一種煙草富鉀篩選和鑒定方法，包括以下步驟：使用低鉀培養基培養煙苗，挑選變黃且有活性的幼苗植株，根據植株的煙葉變黃程度和植株大小判斷煙草的富鉀基因，其中，煙葉變黃程度最嚴重和植株大小最矮小的植株為富鉀煙草品種。

優選地，根據植株的煙葉變黃程度和植株大小將植株劃分以下四個等級：

一級：煙葉嚴重變黃，變黃率可達到80-100％，植株極度矮化，發育嚴重受阻；

二級：煙葉中度變黃，變黃率可達到60-80％，植株中度矮化，發育嚴重延遲；

三級：煙葉中度變黃，變黃率可達到40-60％，植株稍微矮縮，發育延遲；

四級：煙葉略帶黃色，變黃率可達到10-40％，生長率仍較正常；

其中，所述植株的煙葉的鉀含量為：一級＞二級＞三級＞四級。

如上所述，本發明的煙草富鉀篩選和鑒定方法，具有以下有益效果：本發明通過溶液培養、盆栽及田間試驗比較現有煙草種質資源鉀素營養特性差異，通過發現不耐低鉀煙草突變體比耐低鉀煙草突變體煙葉鉀含量顯著提高，選出鉀高效基因型，本發明鑒定與鉀吸收和轉運相關的基因在煙葉中的表達情況，選育和鑒定鉀高效烤煙品種；本發明利用低鉀培養基篩選富鉀基因型煙草變異體材料的方法，該方法中煙苗植株的生長環境一致，決定其表現型的主要是基因型，后期結合大田試驗對結果進一步驗證，實驗結果更準確、穩定。本發明比傳統方法更加省時省力、操作性強，大大提高富鉀煙草品種的篩選效率。

附圖說明

圖1顯示為實施例1中煙草富鉀篩選和鑒定方法的流程示意圖。

圖2顯示為實施例1中對煙草種子的選取及消毒的流程示意圖。

圖3顯示為實施例2中轉NHX1煙草株系N7、N9、N10和K326在大田試驗中煙葉鉀含量隨葉齡的變化。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發明的精神下進行各種修飾或改變。

實施例1利用低鉀培養基篩選出的篩選出的不耐低鉀植株的不同等級及其在大田的表現

選擇“中煙100”的500個突變體材料為研究對象。“中煙100”是一個產量高、耐氮肥的基因型煙草品種，利用低鉀培養基篩選不耐低鉀的植株，移栽入大田試驗后，即可得到富鉀煙草變異體，進而培育富鉀煙草基因型品種。如圖1所示，“中煙100”煙草富鉀篩選和鑒定的方法具體包括以下步驟：

(1)對煙草種子的選取及消毒

如圖2所示，對煙草種子的選取及消毒的流程為：首先選擇飽滿一致的“中煙100”烤煙種子，然后采用50℃溫水浸泡3h；經質量分數75％的CH₃CH₂OH水溶液處理30s，然后無菌水反復沖洗5次；再使用質量分數為10％次氯酸水溶液處理30min，最后采用無菌水沖洗5次，進行催芽露白。

其中，采用質量分數為75％CH₃CH₂OH水溶液處理30s的具體操作方法為：將煙草種子裝入容積為2mL的離心管中，向其中加入質量分數為75％的CH₃CH₂OH水溶液1mL，搖勻，浸泡30s。

再使用質量分數為10％的次氯酸水溶液處理30min的具體操作方法為：將煙草種子裝入容積為2mL的離心管中，向離心管中加入次氯酸水溶液，搖勻，浸泡25-35min。由于浸泡時間較長，因此在浸泡處理過程中需數次搖勻。

(2)低鉀培養基配置及播種培養

(2.1)低鉀培養基的配置所需的原料配比如表1所示。

表1低鉀培養基和完全Hoagland培養液的配置所需的原料配比

注：定容前用0.01mol/L的NaOH溶液調節營養液pH為5.5～6.0。

其中，表1中EDTA-Fe溶液由以下方法配置而成：用精度為0.0001g的分析天平，分別稱取3.73g的EDTA-2Na和2.78g的FeSO4·7H2O，依次溶解；用蒸餾水定容到500mL(定容前用0.01mol/L的HCl調節pH到5.5)。

表1中微量元素溶液所需的原料配比如表1.1所示。

表1.1微量元素溶液所需的原料配比

(2.2)將經過嚴格消毒的種子播種于低鉀培養基上，放入人工氣候室中培養，白天光照為350μmol photons·m^-2·s^-1，夜間光照為0，光暗周期為14/10h，晝夜溫度為28/25℃，空氣相對濕度為60％～70％。

(3)不耐低鉀煙苗的篩選

培養30天后，挑選變黃且具有活性的幼苗植株，并根據煙葉變黃程度和植株大小分為以下四個等級：

一級：煙葉嚴重變黃，變黃率可達到80-100％，植株極度矮化，發育嚴重受阻；

二級：煙葉中度變黃，變黃率可達到60-80％，植株中度矮化，發育嚴重延遲

三級：煙葉中度變黃，變黃率可達到40-60％，植株稍微矮縮，發育延遲；

四級：煙葉略帶黃色，變黃率可達到10-40％，生長率仍較正常。

測定這四個等級的色素含量結果見表2，從表2可以看出，四個等級的植株的葉綠素a和葉綠素b含量表現一致，均為四級＞三級＞二級＞一級，差異達到顯著水平；四個等級的植株的類胡蘿卜素含量表現為三級＞四級＞一級＞二級，差異顯著。

表2不同等級煙草突變體色素含量

將四個等級的植株移栽完全Hoagland營養液進行生長；其中，完全Hoagland營養液的配置所需的原料的配比請參閱表1。

待所選植株有6～8片真葉時將植株移栽入大田。

(4)大田試驗

大田常規管理，于植株移栽至大田30d、40d和50d后分別追施硫酸鉀肥，每株5g(為常規施鉀量的2倍)，將硫酸鉀肥配置成溶液穴施于距離主莖20cm處，在植株的圓頂期測定農藝性狀，不同等級煙草植株的農藝性狀如表3所示；在植株的旺長期測定根系生理特性，不同等級煙草植株的根系特性如表4所示；于植株移栽至大田80天后取第12葉位煙葉110℃殺青，80℃烘干，稱重磨碎過60目篩，采用鹽酸浸提-火焰光度法測定鉀含量，不同等級煙草植株的煙葉鉀含量測試結果如表5所示，同時標記每個等級中鉀含量高的植株。

表3不同等級煙草植株的農藝性狀

表4不同等級煙草植株的根系特性

表5不同等級煙草植株的煙葉鉀含量

從表3、表4、表5的結果可看出，煙草煙葉的鉀含量為：一級＞二級＞三級＞四級＞中煙100，差異達到顯著水平。與對照“中煙100”相比，鉀含量較高的煙草植株在根體積、根干重、根系活力和陽離子交換量等根系生理特性上具有明顯的優勢，但是鉀含量較高的煙草植株呈現更明顯的不耐鉀表征。而不同等級的煙草植株之間農藝性狀有顯著差異，但沒有統一的趨勢。

(5)基因純化

按照上述方法所獲得的植株即為富鉀煙草變異體材料，收獲種子后翌年通過相同的方法種植再選，直至基因型純合，可選育富鉀煙草基因型品種。

實施例2轉NHX1煙草的鉀吸收動力學特性及對低鉀的響應

黑龍江省煙草科學研究所郭兆奎將酵母NHX1基因轉化煙草，結果發現轉NHX1煙草與未轉化材料煙葉相比，轉NHX1煙草的煙葉鉀含量平均增加27.4％，鉀含量最高材料比對照煙草的鉀含量增加42.3％。

將轉NHX1煙草株系N7、N9、N10和K326進行對比測試，轉NHX1煙草株系N7、N9、N10和K326在大田試驗中煙葉鉀含量隨葉齡的變化的表現如圖3所示，鉀吸收動力學參數如表6所示；后期將轉NHX1煙草株系N7、N9、N10和K326移至低鉀的水培條件下進行培養，在水培條件下轉NHX1煙草對低鉀的響應情況如表7所示。

表6轉NHX1煙草鉀吸收動力學參數

表7水培條件下轉NHX1煙草對低鉀的響應情況

由圖3可以看出，煙葉鉀含量：N7＞N9＞N10＞K326，并且在移栽至大田10d至50d時間段，隨著葉齡的增長，每個品種煙草的煙葉的鉀含量均呈一定的下降趨勢，并在移栽至大田50d時達到最低峰，但是隨著葉齡的繼續增長，每個品種的煙葉的鉀含量逐漸增加，因此在大田試驗中，應該選擇移栽至大田大于70d的煙葉進行測試，這樣保證測試結果的穩定性。

由表6可以看出，鉀吸收動力學參數中最大吸收效率Vmax：N7＞N9＞N10＞K326，鉀的親和力Km：N7＜N9＜N10＜K326，鉀最低吸收濃度Cmin：N7＞N9＞N10＞K326；結果表明，煙葉的鉀含量越高，鉀吸收能力越強。

由表7中看出，在低鉀水培條件下煙葉變黃程度：N7＞N9＞N10＞K326，植株大小：N7≈N9＞K326＞N10。結果表明，煙葉的鉀含量越高，能吸收鉀素的最低濃度也隨之提高，即煙葉的鉀含量越高煙草表現出越不耐低鉀的表征。當鉀素供應充足時，煙草植株大小與煙葉鉀含量沒有直接的關系，更不是成正比的關系。但缺鉀時則會顯著影響煙株生長，進而影響植株大小。

實施例3農大202與轉NHX1煙草對低鉀的響應

在同一大田栽培和管理條件下，將農大202與轉NHX1煙草成熟期的中部煙葉進行鉀含量比較，比較結果如表8所示；將兩個型號的煙草的種子分別在常鉀和低鉀條件進行培養，培養30d后測試兩個型號煙草對常鉀和低鉀的響應情況，響應結果如表9所示。

表8農大202與轉NHX1中部煙葉的鉀含量比較結果

表9農大202與轉NHX1煙草對常鉀和低鉀的響應結果

從表8可看出，與農大202相比，轉NHX1煙草的鉀含量更高。從表9可看出，與農大202相比，轉NHX1煙草在低鉀條件下變黃率更高，植株大小呈極度矮縮，其表現出更不耐低鉀的表征。

綜上所述，本發明利用低鉀培養基篩選富鉀基因型煙草變異體材料，該篩選過程中煙草植株的生長環境一致，決定其表現型的主要是基因型，后期結合大田試驗對結果進一步驗證，實驗結果更準確、穩定，比傳統方法更加省時省力、操作性強，同時大大提高篩選效率。所以，本發明有效克服了現有技術中的種種缺點而具高度產業利用價值。

上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。