一段特異性調控逆境條件下植物蛋白穩定性的多肽序列及其應用的制作方法
【專利摘要】一段特異性調控逆境條件下植物蛋白穩定性的多肽序列及其應用。本發明為一段含有14個氨基酸的多肽序列，如SEQ ID No.1所示，命名為WX01。研究發現WX01包含獨特的蛋白降解信號，它可以響應發育與環境信號，在轉錄后水平調控與它融合的目的蛋白（如GUS）的穩定性。應用本發明的多肽序列，構建獲得“ WX01 -待表達目的基因”的融合基因，進行植物轉化可獲得僅在衰老或高鹽、高溫和失水等逆境脅迫條件下特異性積累具有逆境抗性等功能的目的蛋白、但在植株正常旺盛生長時限制其積累水平的轉基因植物，從而保證轉基因植物既能正常生長發育又能具有較強逆境抗性等優良性狀，在植物基因工程技術的研究和應用中具有重要的價值。
【專利說明】一段特異性調控逆境條件下植物蛋白穩定性的多肽序列及 其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物基因工程領域，具體說是用分子生物學技術將一段多肽與目的蛋 白融合從而調控目的蛋白在轉基因植株中的表達水平，使其僅在各種逆境脅迫條件下特異 性積累、但在植株正常旺盛生長時被降解，從而保證轉基因植物既能正常生長發育又能具 有較強逆境抗性，以及該肽段在科學研宄與基因工程【技術領域】的應用。
【背景技術】
[0002] 我國是一個以農業為基礎的國家，但是隨著人口的逐年增長、耕地面積的不斷減 少和農業可利用資源的日趨緊張，糧食供給面臨著巨大挑戰。提高和穩定糧食產量已成為 我國當前國家重大戰略發展的需求(周建軍等，2014)。同時，隨著生活水平的提高，人們對 品味、口感、營養價值和欣賞價值等品質性狀也越來越關注，迫使植物育種工作者在提高作 物產量的同時培育富含營養(特別是一些特定蛋白質和氨基酸)、品質優良的作物新品種。 為了解決這些問題，大量生物技術被逐漸應用于農業生產并且發揮越來越重要的作用，如 植物基因工程、組織培養、細胞工程等技術。
[0003] 植物基因工程技術是利用重組DNA技術，有計劃地在體外通過人工"剪切"和"拼 接"等方法，對生物基因進行改造和重新組合，然后再插入、整合到事先準備好的受體植物 基因組中，使重組基因在受體細胞中表達，從而使受體植物獲得新的性狀，培育出高產、多 抗和優質的新品種(候文邦等，2005)。利用植物基因工程技術可以更方便地對更多基因進 行有目的的操作，打破自然界物種間難以交配的天然屏障，將不同物種的基因按人們的意 志重新組合，拓寬了植物可利用的基因庫，為創造新種質資源、培育植物新品種開辟了新的 技術路線。自1983年首次獲得轉基因煙草、馬鈴薯以來，植物基因工程的研宄和開發進展 十分迅速。截止1997年，全球大約進行了 25000次轉基因作物的田間試驗，涉及10個國家、 60種作物、10個性狀(成寶珍等，2014)。目前，已育成了一大批耐除草劑、抗病、抗蟲、抗逆 的高產、優質農作物新品種，并開始在農業生產上大面積推廣應用(候文邦等，2005)。
[0004] 近年來發現的大量具有應用價值的潛力基因，例如擬南芥中關鍵的逆境誘導轉錄 因子 (Kasuga 等，1999)和 ￠37? (Hsieh 等，2002a ;Hsieh 等，2002b)等，它們在轉 基因植物中組成型過表達后可以獲得預期的優良表型，如增強轉基因植株對特定脅迫的抗 逆性、延緩植株的衰老等，但是往往伴隨著影響植株在合適生長條件下的正常生長和發育， 導致植株矮小、生長遲緩或產量下降等。如果可以特異性地表達這些基因，讓它們在特定的 發育階段或脅迫條件下高表達，而在正常的生長過程中維持在較低的基礎水平，可以大大 提高它們在基因工程中的應用性。對此，人們通常習慣使用組織特異性啟動子驅動目的基 因的表達來實現這一目標（Kasuga 等，1999 ;Lee 等，2003 ;Kasuga 等，2004 ;Kovalchuk 等， 2013 ;Li等，2013 ;Wang等，2013)。但是，這一方法也有其局限性。首先，目前為止分離獲 得和應用的組織特異性啟動子還比較少，并且伴隨著活性低、組織特異性不高的缺點。啟動 子活性過低會限制目的基因的表達，導致其無法達到發揮功能所需要的水平；其次，一般來 說，具有育種潛力的基因在整合到受體植物基因組中以后，需要轉錄翻譯為相應的蛋白質 來發揮調控植物生長發育的功能，而基因表達調控需要轉錄和轉錄后兩個層次的控制。轉 錄后/翻譯后水平的調控對多數基因的功能發揮起重要作用，有時僅僅利用特異性啟動子 很難達到滿意的效果。而通過在蛋白水平上調控目的基因的表達能夠很好地彌補這些缺 陷，具有很大的應用潛力。
[0005] 最近，Jang等人發現擬南芥RAD23a蛋白的泛素相關結構域I (UBAl)和UBA2作 為穩定信號可以顯著地增強兩種短命的轉錄因子HFRl和PIF3的穩定性，從而使轉基因植 株表達現出比單純過表達這兩個轉錄因子的植株更強的表型。擬南芥DDIl蛋白的UBA結 構域也可以延長茉莉酸信號路徑上的短命蛋白JAZ10. 1的半衰期。他們指出可以根據UBA 結構域的特性將它與植物中其他短命蛋白融合，增強其穩定性，用于對這些蛋白功能的基 礎性研宄以及作物的改良（Jang等，2012)。由此可見，獲得可以在蛋白水平特異調控基因 表達的多肽，將其與目的蛋白融合，從而促使其在特定的發育階段或特定的環境脅迫條件 下積累，而在其他情況下維持低水平，不僅有助于闡明某些植物蛋白的生物學功能等基礎 理論問題，更可以有目的地控制轉基因植物中育種潛力基因的表達，從而調節轉基因植物 的發育、提高農作物的產量和改善其品質。目前已分離鑒定的這類特殊多肽(或肽段）及其 應用技術還相對較少，但是這一方法勢必將成為農作物性狀改良與新品種培育的新的強有 力工具，具有廣泛的應用價值。
【發明內容】
[0006] 本發明目的是解決現有植物基因工程技術中，因外源基因在植物中的過表達導致 異源蛋白在植株生長發育過程中持續性的大量積累，打破了植物原有的代謝平衡；因一些 蛋白調控的代謝過程并非植物生長一直所需，持續性的激活反而造成營養和能量的浪費， 阻礙了植物的正常生長，甚至導致死亡等問題，提供一段特異性調控逆境條件下植物蛋白 穩定性的多肽序列及其應用。有別于特異性啟動子在轉錄水平調控目的基因表達的方式， 本發明針對蛋白水平調控目的基因的表達，使目的蛋白在高鹽、高溫和失水等多種脅迫或 植株啟動衰老死亡的條件下特異積累，而在植株正常旺盛生長時積累受抑制，從而減輕或 去除目的基因的過表達對植株正常生長的不利影響，保留其有利的功能，如提高作物產量、 增強作物抗逆性等。這在利用基因工程技術獲得具有優良性狀的轉基因植物及作物新品種 培育等過程中具有重大應用價值。
[0007] 本發明技術方案 一段特異性調控逆境條件下植物蛋白穩定性的多肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示，該序列人工截取自擬南芥一個1-氨基環丙烷-1-羧酸合成酶蛋白分子的部分區 段。我們對該蛋白不同結構域進行功能研宄過程中發現，這一區段包含獨特的蛋白降解信 號，它可以響應發育與環境信號，在轉錄后水平調控與它融合的目的蛋白的穩定性，從而使 目的蛋白在光下正常旺盛生長的植株中降解、但在啟動衰老或者高鹽、高溫和失水等多種 逆境脅迫條件下特異積累，我們將該多肽命名為WXOl。
[0008] 本發明同時提供了一種WXOl多肽的應用，S卩：利用WXOl的編碼序列，構建獲得 "r恐7-待表達目的基因"的融合基因，進行植物轉化，從而獲得基因組中含有融合了 WXOi 編碼序列的目的基因、并且僅在各種逆境脅迫條件下特異性積累目的蛋白、但在植株正常 旺盛生長時限制其積累水平的轉基因植物。其中所述的融合基因中的目的基因可以是任何 針對基礎研宄、轉化技術或者農作物性狀改良所需要的目的基因。
[0009] 作為具體應用的實例，本發明提供了一種報告基因"融合基因的構建以 及"WX01-GUS"融合蛋白在轉基因植物中特異積累的分析。操作過程如下： 所述應用中的融合基因報告基因"的構建方法，包括如下步驟： 第一、以pCAMBIA 1301 (購自CAMBIA公司)質粒作為模板，在利用PCR方法擴增報 告基因時，在上游引物中引入WXOl的編碼序列（在引物序列中以小寫字母顯示)，從而獲得 " 融合基因片段； 第二、回收PCR擴增產物； 第三、將上述第二步回收的擴增產物，與PMD18-T載體(購自Takara公司）在連接酶催 化下進行連接反應； 第四、將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞； 第五、通過抗性篩選，獲得該啟動子的陽性TA克隆。
[0010] 第六、用Afco IMsiE II雙酶切含有"/QW-仍y'融合基因的TA克隆質粒，回收 " 融合基因片段； 第七、用Afco I/fciE II雙酶切雙元表達載體質粒，回收大的載體片段； 第八、混合上述第六步得到的融合基因片段和第七步得到的雙元表達載體 片段，在連接酶催化下進行連接反應，完成以pCAMBIA 1301為基本載體、包含 融合基因的雙元表達載體的構建。
[0011] 其中所設計的融合基因的PCR擴增引物如下。上游引物1中依次引入 了 Afco I酶切位點以及WXOl的編碼序列（如小寫字母所示)，上游引物2中包含了部分WXOl 的編碼序列，而下游引物中引入了 feiE II酶切位點。操作時先利用上游引物2和下游引 物擴增，然后以該擴增產物為模板、用上游引物1和下游引物擴增獲得融合基 因片段。
[0012] 上游引物 I: 5?-C^￡7K&tgggtcttcctctaatgatggagagatcatcaaacaacaacATGG-3 ? 上游引物 2: 5 ' -ggagagatcatcaaacaacaacATGGTAGATCTGAGGGTAAATTTCTAG-3 ' 下游引物：5 ' -巡M^TCACACGTGGTGGTGGTGG-3 '。
[0013] 所述應用中的對"WX01-GUS"融合蛋白在轉基因植物中特異積累的分析，操作過程 如下： 擬南芥轉化的具體方法，采用農桿菌介導的花苞浸泡法（Clough與Bent，1998)，獲得 的種子經過30 mg/L潮霉素抗性篩選，生長正常的抗性植株轉土培養；利用組織化學染色 (Blume和Grierson，1997)和免疫印跡的方法（Bolt和Mahoney，1997)檢測轉基因擬南芥 中"WXOI-GUS"融合蛋白的特異積累。
[0014] 本發明的優點和積極效果： 本發明利用能夠有效調控目的蛋白積累水平的多肽序列，將其與待表達目的基因融 合，通過遺傳轉化技術將該融合基因轉入植物基因組中，可以實現對目的蛋白穩定性的特 異調控，獲得在多種逆境脅迫或啟動衰老死亡條件下特異性積累目的蛋白、但在正常旺盛 生長時限制其水平的轉基因植物。這段多肽通過與具有提高作物逆境抗性、改善作物產量 和品質性狀等潛力的基因融合，能夠有效地減輕超表達這些基因對正常生長發育過程的不 利影響，保留其有利的性狀，從而增強作物抗逆能力、提高作物的產量和/或品質，在利用 植物基因工程技術進行新品種培育過程中具有重大應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖1 " /QW-GW轉基因擬南芥植株的PCR鑒定。泳道M :plus2000 Marker ;泳 道1 :包含-GW融合基因的雙元表達載體質粒為模板的PCR的正對照；泳道2~9 : "/QW-仍y'轉基因擬南芥植株的基因組DNA為模板的PCR產物；泳道10 :用野生型擬南芥 的基因組DNA為模板的負對照；泳道11 :H20為模板的PCR的負對照。
[0016] 圖2 "轉基因擬南芥不同發育階段植株的⑶S染色結果。A，11天苗齡 (左）和26天苗齡(右）光下苗的染色結果，其中以相同啟動子驅動表達"基因的轉基因 擬南芥作為對照出，"/0^7-^^轉基因擬南芥28天苗齡光下苗不同蓮座葉的染色結果，圖 中數字1~12表示蓮座葉出現的順序，數字越大葉片越幼嫩。
[0017] 圖3不同非生物脅迫處理的轉基因幼苗中"WX01-GUS"融合蛋白積累水平分析。 A，⑶S組織化學染色分析結果；B，免疫印跡法分析的結果，其中β-actin作為標識蛋白上 樣量的內參。
【具體實施方式】
[0018] 實施例1:將WXOl多肽的編碼序列與報告基因融合，以pCAMBIA 1301為基本 載體構建包含" 融合基因的植物雙元表達載體 第一、以pCAMBIA 1301質粒為模板利用PCR方法擴增2108 bp的" 融合基 因，回收擴增產物并進行TA克隆。
[0019] (I)PCR擴增目的片段 根據已知的PCAMBIA 1301載體上報告基因的序列設計特異引物，在上游引物1中 依次引入Afc0 I酶切位點以及WXOl的編碼序列(如小寫字母所示)，上游引物2中包含部分 WXOl的編碼序列，而下游引物中引入了 fciE II酶切位點。
[0020] 上游引物 I: 5?-C^￡7K&tgggtcttcctctaatgatggagagatcatcaaacaacaacATGG-3 ? (引入Afco I切點） 上游引物 2: 5 ' -ggagagatcatcaaacaacaacATGGTAGATCTGAGGGTAAATTTCTAG-3 ' 下游引物：5' -巡M^TCACACGTGGTGGTGGTGG-3'（引入 仿 II 切點）。
[0021] 用質粒提取試劑盒(購自Axygen公司）提取pCAMBIA 1301基本載體的質粒，具體 操作步驟見商品說明書。然后以該質粒為模板，先利用上游引物2和下游引物擴增，再以該 擴增產物為模板、利用上游引物1和下游引物擴增獲得" r恐7融合基因片段（目的片 段)。
[0022] PCR反應體系：
【權利要求】
1. 一段特異性調控逆境條件下植物蛋白穩定性的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1 所示。
2. -段權利要求1所述的特異性調控逆境條件下植物蛋白穩定性的多肽序列的應用， 其特征在于，利用該多肽序列構建獲得" r恐7-待表達目的基因"的融合基因，將其轉化植 物，從而獲得基因組中含有融合了權利要求1所述多肽編碼序列的目的基因、并且僅在各 種逆境脅迫條件下特異性積累目的蛋白、但在植株正常旺盛生長時限制其積累水平的轉基 因植物。
【文檔編號】A01H5/00GK104498467SQ201510010018
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月9日 優先權日:2015年1月9日
【發明者】王寧寧, 熊莉, 孫立方, 王丹 申請人:南開大學