一種小麥幼穗遺傳轉化受體的培養方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種小麥幼穗遺傳轉化受體的培養方法及應用,涉及轉基因【技術領域】。所述方法主要包括以下幾個步驟:1、幼穗的取材。2、幼穗的接種前處理。3、幼穗的接種及培養。4、將獲得胚性愈傷組織轉接到分化培養基中,培養至出苗。5、將所得的2-4cm高的幼苗轉接到生根培養基中培養至獲得健壯的組培苗。6、根據小麥的類型,將獲得冬性小麥組培苗在4℃進行春化處理,春小麥組培苗不進行春化處理,最后將組培苗煉苗后移栽于土中。整個培養過程涉及三種培養基,分別是誘導培養基、分化培養基及生根壯苗培養基。
【專利說明】一種小麥幼穗遺傳轉化受體的培養方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及轉基因【技術領域】,尤其涉及一種小麥幼穗遺傳轉化受體的培養方法及 應用。
【背景技術】
[0002] 小麥是世界上的主要糧食作物之一,培育高產、優質、抗逆新品種對發展國民經濟 至關重要。目前小麥新品種的培育依然主要靠常規育種。由于常規雜交育種費時費力,而 且預見性差,致使小麥育種水平難有突破性提高,育種進展緩慢。近年來,利用現代基因工 程技術,將特定的外源基因導入小麥中定向改良小麥品種,為小麥遺傳育種提供了一條新 途徑。轉基因技術作為雜交育種的主要補充手段,已經在水稻、玉米、大豆、棉花和油菜等作 物中取得了巨大成功,然而小麥轉基因研究進展比較緩慢。影響小麥基因工程育種速度緩 慢的主要原因有,小麥屬于異源六倍體植物,基因組龐大,重復序列多,植株再生能力差,遺 傳轉化比較困難等。
[0003]自1992年以來人們嘗試利用多種轉化方法和多種外植體轉化小麥,轉化 方法包括基因槍、農桿菌、花粉管通道、超聲波法、離子束注入法、激光微束穿刺法和 PEG(Polyethylene glycol)法等,外植體包括幼胚、成熟胚、幼穗、盾片和花藥愈傷組織 等,探討了農桿菌介導的植株水平轉化,取得了一定進展,促進了功能基因向小麥中的轉 化。目前小麥的轉化方法雖然眾多但轉化效率卻并不樂觀,其首要問題在于穩定的小麥再 生體系的建立較困難。雖然通過小麥根、莖、葉、花藥、胚、穗等各種外植體均可實現植株再 生,但實踐證明,相同外植體的誘導分化效果既受外植體類型和基因型的影響,也因培養基 的成分與濃度的不同而有變化。小麥成熟胚由于具有量大、生長一致、取材方便且不受取材 季節和環境條件限制等優點是開展小麥遺傳轉化較為方便的外植體。然而,愈傷組織質量 差、易發芽等問題,其愈傷組織誘導率和植株的再生能力遠不及幼胚和幼穗,限制了成熟胚 在小麥遺傳轉化中的應用。目前幼穗和幼胚是小麥遺傳轉化中使用最多的外植體。盡管幼 胚的植株再生能力很強,但具有很強的基因型依賴性,在很大程度上限制了轉基因技術在 小麥上的應用。
[0004] 一些研究表明,以小麥幼穗為外植體進行離體培養一般比常用的幼胚外植體更理 想,可獲得較高的植株再生頻率。舒理慧等研究表明,在小麥護穎分化期,其幼穗離體培養 誘導率和分化率最高;鄭企成等也指出,用合適時期的幼穗作外植體誘導出的愈傷組織,其 再生能力比常用的幼胚外植體更理想,不僅再生頻率高,而且在長期繼代培養過程中能保 持較高的再生能力;陳梁鴻等在比較幼穗和幼胚為受體的轉化試驗中觀察到,幼穗的轉化 效果優于幼胚,幼穗較幼胚更耐繼代,更形成再生植株;林剛等研究激素對小麥愈傷組織, 誘導和植株再生的影響時發現,幼穗的愈傷組織誘導率和植株再生頻率高于幼胚和成熟 胚;劉錄祥等(2001)統計分析了近90個基因型幼胚及幼穗愈傷組織誘導和植株再生頻率 分布的資料,認為以小麥幼穗為外植體將有可能克服或減輕小麥基因型障礙。
[0005] 小麥幼穗由于取材方便、消毒方法簡便,只需常規的春化技術就能做到周年提供, 并且對小麥幼穗進行離體培養可獲得較高的綠苗分化率,因此是很好的外植體。因此,為了 克服基因型的障礙,促進轉基因小麥的規模化應用,建立適于目的基因轉化的幼穗組織培 養體系是利用幼穗為外植體進行小麥遺傳轉化的關鍵。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種小麥幼穗遺傳轉化受體的培養方法及應用,該方法適用 于進行小麥轉基因,可成功獲得小麥轉基因植株。
[0007] 為達到上述目的,本發明的采用如下技術方案:
[0008] -種小麥幼穗遺傳轉化受體的培養方法,其過程包括以下主要步驟:1、幼穗的取 材:選取溫室或田間種植的生長一致的小麥單莖,麥穗處在小穗分化期(幼穗生長至長度 為1. 0cm?1. 5cm左右時)。2、幼穗的接種前處理:徒手剝取田間采集的幼穗莖桿的外層葉 鞘,僅余內層葉鞘包裹幼穗以防止污染,在超凈工作臺上,噴灑75%乙醇對幼穗進行殺菌, 將處理后的幼穗用經75%乙醇處理的紗布包裹,以確保殺菌效果。3、幼穗的接種及培養: 用已滅菌的鑷子沿著處理后幼穗的內層葉鞘順時針方向剝出幼穗,露出生長錐后,用鑷子 尖將幼穗夾斷為〇. 5cm左右的小段,接入誘導培養基中培養,25°C恒溫暗培養,每15d繼代 一次。4、暗培養30天以后,將獲得胚性愈傷組織轉接到分化培養基中,置于25°C,光照強度 為4000-60001ux、光照時間為16h/d的條件下,培養至出苗。5、將所得的2-4cm高的幼苗轉 接到生根培養基中培養至獲得健壯的組培苗。6、根據小麥的類型,將獲得冬性小麥組培苗 在4°C進行春化處理,春小麥組培苗不進行春化處理;最后將組培苗煉苗后移栽于土中。
[0009] 所述誘導培養基成分及配比如下:MS基本培養基+2,4_二氯苯氧乙酸丁酯(2, 4-D)2mg ?L_1+鹿糖(Sucrose) 30g噸―1-瓊脂粉(Agar) 7g ?L-1 ;用蒸饋水將上述培養基定容 至1L ;滅菌前調該培養基的pH至5. 8 ;在121°C,即0. 1?0. 15MPa高壓蒸汽下滅菌20分 鐘;
[0010] 所述分化培養基成分及配比如下:MS基本培養基+萘乙酸(NAA)O. 2mg? 1^+激 動素(KT)lmg? 1^+6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)lmg? 1^+ 硝酸銀(AgN03) 10mg? 1^+ 蔗糖 (Sucrose) 30g?I71-瓊脂粉(Agar) 7g?I71 ;用蒸饋水將上述培養基定容至IL;滅菌前調該 培養基的pH至5. 8 ;在121 °C,即0. 1?0. 15MPa高壓蒸汽下滅菌20分鐘;
[0011] 所述生根培養基成分及配比如下:1/2MS培養基+萘乙酸(NAA)O. 2mg?1^+多效 唑0? 3mg ? 1^+鹿糖(Sucrose) 30g ? 1^+瓊脂粉(Agar) 7g ? I71 ;用蒸饋水將上述培養基定 容至IL;滅菌前調該培養基的pH至5.8 ;在121°C,即0. 1?0. 15MPa高壓蒸汽下滅菌20 分鐘。
[0012] 所述MS基本培養基成分如表1所示:
[0013] 表1 MS基本培養基成分附表
[0014]
【權利要求】
1. 一種小麥幼穗遺傳轉化受體的培養方法及應用,其特征在于:幼穗的取材時期選在 麥穗處于小穗分化期(幼穗生長至長度為1. Ocm?1. 5cm左右時)。
2. 根據權利要求1所陳述的一種小麥幼穗遺傳轉化受體的培養方法及應用,其特征在 于:幼穗在接種前要進行消毒處理,具體過程是:徒手剝取田間采集的幼穗莖桿的外層葉 鞘,僅余內層葉鞘包裹幼穗以防止污染,在超凈工作臺上,噴灑75%乙醇對幼穗進行殺菌, 將處理后的幼穗用經75%乙醇處理的紗布包裹,以確保殺菌效果。
3. 根據權利要求1和2所陳述的一種小麥幼穗遺傳轉化受體的培養方法及應用,其特 征在于:用已滅菌的鑷子沿著處理后幼穗的內層葉鞘順時針方向剝出幼穗,露出生長錐后, 用鑷子尖將幼穗夾斷為0. 5cm左右的小段,接入誘導培養基中培養。
4. 根據權利要求1、2和3所陳述的一種小麥幼穗遺傳轉化受體的培養方法及應用,其 特征在于:幼穗的培養基分為誘導培養基、分化培養基及生根壯苗培養基。
5. 根據權利要求4所陳述的誘導培養基,其特征在于:誘導培養基的成分是:MS基 本培養基+2,4-二氯苯氧乙酸丁酯(2,4-D)2mg 蔗糖(Sucrose) 瓊脂粉 (Agar)7g ? I71 ;用蒸餾水將上述培養基定容至IL ;滅菌前調該培養基的pH至5. 8 ;在 121°C,即0. 1?0. 15MPa高壓蒸汽下滅菌15分鐘。
6. 根據權利要求4所陳述的分化培養基,其特征在于:分化培養基的成分是:MS基本 培養基+萘乙酸(NAA)O. 2mg七1-激動素(KT) lmg .1^+6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) lmg噸-1+ 硝酸銀(AgN03) 10mg ? 1^+鹿糖(Sucrose) 30g ? 1^+瓊脂粉(Agar) 7g ? I71 ;用蒸饋水將上 述培養基定容至IL;滅菌前調該培養基的pH至5.8 ;在121°C,即0. 1?0. 15MPa高壓蒸汽 下滅菌20分鐘。
7. 根據權利要求4所陳述的生根培養基,其特征在于:生根培養基的成分是:1/2MS 培養基 + 萘乙酸(NAA) 0? 2mg ? 1^+ 多效唑 0? 3mg ? 1^+ 蔗糖(Sucrose) 30g ? 1^+ 瓊脂 粉(Agar) 7g ? I71 ;用蒸餾水將上述培養基定容至IL ;滅菌前調該培養基的pH至5. 8 ;在 121°C,即0. 1?0. 15MPa高壓蒸汽下滅菌15分鐘。
【文檔編號】A01H4/00GK104429957SQ201410692788
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月26日 優先權日:2014年11月26日
【發明者】吉萬全, 劉新倫, 田增榮, 栗聰, 李偉艷, 張磊 申請人:西北農林科技大學