一種菜豆直接再生體系的建立方法
【專利摘要】本發明公開了一種菜豆直接再生體系的建立方法，主要包括菜豆無菌苗的獲得方法、直接再生培養基配方、生根培養基配方、組培苗移栽方法等，針對現有技術中菜豆組織培養體系技術方案不完整、不明確，甚至方法本身重復再現性差的缺陷，本發明通過篩選各種功能培養基中不同激素種類及其配比，最終建立高頻、高效的菜豆直接再生體系，為菜豆組培快繁及轉基因育種的應用奠定基礎。
【專利說明】一種菜豆直接再生體系的建立方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及以菜豆子葉節為外植體，獲得高頻、高效的菜豆直接再生體系的方法。
【背景技術】
[0002] 菜豆L.]又稱蕓豆，四季豆，玉豆、扁豆等，屬豆科菜豆屬菜 豆種植物。菜豆起源于中南美洲的熱帶地區，主要分布于墨西哥南部和中美洲，15世紀經美 洲引入我國。通過不斷的演化和變異，出現了以嫩莢供食用的軟莢菜豆，因此中國被認為是 菜豆的次級起源中心，在中國已有500多年的栽培歷史。菜豆在我國各省市均有栽培，面積 十分廣泛。據聯合國糧農組織統計（FA0,2012年)，中國粒用菜豆總栽培面積為1456. 5萬 畝，食莢菜豆栽培面積為939萬畝。栽培面積僅次于巴西和印度，位居世界第三。
[0003] 菜豆是嚴格閉花授粉作物，繁種過程中種性退化嚴重。加上人工雜交成功率低，知 識產權無法保護，因此菜豆品種更新極為緩慢。種性退化對產量和商品性影響很大，菜農急 需新品種更新。隨著分子生物學和植物基因工程的發展，人們開始借助生物技術手段建立 高頻、高效的菜豆再生體系并對其進行遺傳轉化，可大幅度縮短育種周期，提高育種效率。
【發明內容】
[0004] 本發明公開的一種菜豆直接再生體系的建立方法，針對現有技術中菜豆組織培養 體系技術方案不完整、不明確，甚至方法本身重復再現性差的缺陷，本發明提供了一種以菜 豆子葉節為外植體建立高頻、高效再生體系的方法。
[0005] 本發明目的是在基礎培養基的基礎上，通過篩選培養基中不同激素種類及其用量 的配比（篩選的培養基包括再生培養基和生根培養基，再生培養基激素包括6-BA，用量在 I.Omg/L-6.Omg/L;IAA，0.Img/L-1.Omg/L。生根培養基激素是IBA，用量為 0mg/L-1.Omg/ U最終建立高頻、高效的菜豆直接再生體系的方法，為菜豆組培快繁及轉基因育種的應用 奠定基礎。
[0006] 為實現上述目的，本發明公開了一種菜豆直接再生體系的建立方法，其特征在于 按如下的步驟進行： (1) 菜豆無菌苗的獲得方法： 挑選籽粒均勻、飽滿的菜豆種子，置于玻璃容器內，將濃度為10%_30%的次氯酸鈉溶液 緩緩倒入容器內，使菜豆種子完全浸泡在次氯酸鈉溶液中，整個消毒過程用時l〇_2〇min，并 每隔l-2min攪拌一次，使種子表面與溶液充分接觸，以保證消毒徹底，消毒后的菜豆種子 用無菌水清洗4-5次，整個消毒過程在超凈工作臺內完成；將清洗后的菜豆種子插入萌發 培養基內，種子插入一半即可，種子萌發環境為溫度20°C-25°C，光周期為16h/8h光照/黑 暗； (2) 直接再生培養基培養基配方及操作方法： 將萌發5-6天的菜豆無菌苗在超凈工作臺中取出，放在滅菌后的培養皿里，切除頂 端生長點及胚根，留下子葉節上下各I. 5-3. 5mm的下胚軸，順著下胚軸將外植體縱向平 均分開，得到兩個對稱的帶子葉的子葉節，用刀片對縱切面進行劃傷，傷口長3-4mm，深度 0. 3-0. 5mm;將處理好的外植體近軸面向上與培養基成45度角斜插入芽誘導培養基中，密 封并置于培養室中培養，培養環境為溫度20°C-25°C，光周期為16h/8h光照/黑暗；培養 基每隔5-10天更換一次，15-20天后可獲得再生植株；所述的芽誘導培養基指的是=MSB5+ 6-BAI. 0-6. 0mg/L+IAA0? 1-1. 0mg/L+ 活性炭 10-50mg/L; (3)再生芽的生根培養基配方及操作方法：將長到4-5cm的不定芽延基部從外植體上 切下，插入1/2MSB5+IBA0. 1-1.0mg/L+活性炭5-30mg/L生根培養基內，密封好后置于培 養室內培養，培養環境為溫度20-25°C，光周期為16h/8h光照/黑暗，7-10天順利生根； (4) 組培苗的移栽方法：生根后的組培苗，在培養室內開蓋煉苗3-5天，然后移栽到裝 有基質的營養缽內，將移栽好的組培苗放在塑料拱棚內生長，保證拱棚內的溫度25-28°C， 相對濕度60%，拱棚內生長5天逐漸給拱棚放風，直至幼苗適應溫室環境，再將拱棚撤去； (5) 成活的組培苗便可移栽入露地進行正常管理。
[0007] 本發明所述的菜豆直接再生體系的建立方法，其中的菜豆品種指的是雙豐3號。
[0008] 本發明更進一步公開了菜豆直接再生體系的建立方法在提高菜豆生芽率、生根 率、植株成苗率方面的應用。實驗結果表明：菜豆直接再生體系的建立方法易于誘導再生 芽， 再生芽率提高、生根率提高，再生植株成苗率提高。直接再生周期短，直接再生易于操 作，重現性好。
[0009] 本發明建立的菜豆直接再生體系其中的關鍵在于： (1)明確了菜豆種子消毒的最佳方法，此方法易操作，效果最好。
[0010] (2)摸索出菜豆子葉節直接再生的最佳培養基配方及操作方法，再生頻率高，重復 性好。
[0011] (3)篩選出再生植株生根的最佳培養基配方及操作方法，使生根速度快，質量好， 有利于再生苗的移栽。
[0012] 本方法更加詳細的描述如下： 主要包括菜豆無菌苗的獲得方法、直接再生培養基配方及操作方法、生根培養基配方 及操作方法、組培苗的移栽方法等，具體步驟如下： 1、菜豆無菌苗的獲得方法 挑選籽粒均勻、飽滿的菜豆種子，置于玻璃容器內。將濃度為10%-30%的次氯酸鈉溶液 緩緩倒入容器內，使菜豆種子完全浸泡在次氯酸鈉溶液中。整個消毒過程用時l〇_2〇min，并 每隔l-2min攪拌一次，使種子表面與溶液充分接觸，以保證消毒徹底。消毒后的菜豆種子 用無菌水清洗4-5次。整個消毒過程在超凈工作臺內完成。將清洗后的菜豆種子插入萌發 培養基內，種子插入一半左右即可。種子萌發環境為溫度20°C_25°C，光周期為16h/8h光 照/黑暗。
[0013] 2、直接再生培養基配方及操作方法 將萌發5-6天的菜豆無菌苗在超凈工作臺中取出，放在滅菌后的培養皿里，切除頂端 生長點及胚根，留下子葉節上下各1. 5-3. 5_左右的下胚軸，順著下胚軸將外植體縱向平 均分開，得到兩個對稱的帶子葉的子葉節，用刀片對縱切面進行劃傷，傷口長3-4mm，深度 0. 3-0. 5mm。將處理好的外植體近軸面向上與培養基成45度角斜插入芽誘導培養基中，密 封并置于培養室中培養，培養環境為溫度20°C-25°C，光周期為16h/8h光照/黑暗。培養 基每隔5-10天更換一次，15-20天后可獲得再生植株。
[0014] 3、生根培養基配方及操作方法 當再生芽長到4_5cm時，將再生植株從外植體上切下，插入到生根培養基內培養，培養 環境為溫度20°C-25°C，光周期為16h/8h光照/黑暗，7-15天左右便可順利生根。
[0015] 4、組培苗的移栽方法 生根后，將瓶蓋打開在培養室內煉苗3-10天，移苗至裝有基質的營養缽中，將移栽好 的組培苗放在塑料拱棚內生長，保證拱棚內的溫度25-28 °C，相對濕度60%左右。拱棚內生 長5-10天，逐漸給拱棚放風，直至幼苗適應溫室環境，再將拱棚撤去。
[0016] 該方法菜豆種子消毒效果達100%，不定芽再生頻率為11. 2個/外植體，不定芽生 根率達到95. 3%，生根數量為13. 6根/植株，組培苗移栽成活率達97%。
[0017] 本發明公開的菜豆直接再生體系的建立方法與現有技術相比所具有的積極效果 在于： (1)種子消毒方法更規范，消毒效果更好，且易于操作。
[0018] (2)直接再生更易于得到再生植株，重復性好。
[0019] (3)提高了再生植株生根率，進而提高成苗率。
【具體實施方式】
[0020] 本發明實施例公開了菜豆直接再生體系的建立方法。本領域技術人員可以借鑒本 文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術 人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的產品、方法和應用已經通過 較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述 的產品、方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0021] 其中所述的MS培養基以及縮寫的MSB5培養基指的是（MS和B5培養基是組培上常 用的培養基，配方及用量都是已知的。另外MSB5、6-BA、IAA、活性炭、雙豐3號菜豆品種 均由市售。
[0022] 實施例1 雙豐3號菜豆品種直接再生體系的建立，包括以下步驟： (1)種子的消毒：在超凈工作臺內，將整齊一致的雙豐3號種子放入玻璃容器內，倒入 10%次氯酸鈉溶液浸泡l〇min，每隔2min攪拌一次。將消毒的種子用滅菌水沖洗4次，倒干 容器內的滅菌水后備用。
[0023] (2)無菌苗的獲得：在超凈工作臺內，用鑷子取出消毒后的菜豆種子，將種臍朝下 插入萌發培養基內，密封好后置于培養室內培養，培養環境為溫度20°C，光周期為16h/8h 光照/黑暗。
[0024] (3)再生芽的獲得：無菌苗培養5天后，在超凈工作臺內取出無菌苗，置于滅菌后 的培養皿內，切除植株的生長點及胚根，留下子葉節上下各I. 5_左右的下胚軸，順著下胚 軸將外植體縱向平均分開，得到兩個對稱的帶子葉的子葉節，用刀片對縱切面進行劃傷，傷 口長3mm，深度0. 3mm。將處理好的外植體近軸面向上與培養基成45度角斜插入1/2MMSB5+ 6-BA1.0mg/L+IAA0.Img/L+活性炭10mg/L芽誘導培養基中，密封好后置于培養室中培 養，培養環境為溫度20°C，光周期為16h/8h光照/黑暗。培養基每隔5天更換一次，15天 可獲得再生芽。
[0025] (4)再生芽的生根：將長到4-5cm的不定芽延基部從外植體上切下，插入1/2MSB5+ IBA0.lmg/L+活性炭5mg/L生根培養基內，密封好后置于培養室內培養，培養環境為溫度 20°C，光周期為16h/8h光照/黑暗，7天左右便可順利生根。
[0026] (5)組培苗的移栽：生根后的組培苗，在培養室內開蓋煉苗3天左右，然后移栽到 裝有基質的營養缽內，將移栽好的組培苗放在塑料拱棚內生長，保證拱棚內的溫度28°C，相 對濕度60%左右。拱棚內生長6天逐漸給拱棚放風，直至幼苗適應溫室環境，再將拱棚撤去。
[0027] (6)成活的組培苗便可移栽入露地進行正常管理。
[0028] 實施例2 雙豐3號菜豆品種直接再生體系的建立，包括以下步驟： (1)種子的消毒：菜豆種子消毒相關文獻未見報道，試驗對比了大豆等一些豆類種子消 毒方法，明確了菜豆種子最佳的消毒方法，具體操作如下：在超凈工作臺內，將整齊一致的 雙豐3號種子放入玻璃容器內，倒入30%次氯酸鈉溶液浸泡16min，每隔2min攪拌一次。將 消毒的種子用滅菌水沖洗5次，倒干容器內的滅菌水后備用。
[0029] (2)無菌苗的獲得：在超凈工作臺內，用鑷子取出消毒后的菜豆種子，將種臍朝下 插入萌發培養基內，密封好后置于培養室內培養，培養環境為溫度20°C，光周期為16h/8h 光照/黑暗。
[0030] (3)再生芽的獲得：采用愈傷組織誘導再生芽率最高僅為90%，再生頻率低。采用 直接再生方法再生芽誘導率達100%，再生頻率高達11. 2個/外植體。直接再生是將無菌苗 培養6天后，在超凈工作臺內取出無菌苗，置于滅菌后的培養皿內，切除植株的生長點及胚 根，留下子葉節上下各3. 5_左右的下胚軸，順著下胚軸將外植體縱向平均分開，得到兩個 對稱的帶子葉的子葉節，用刀片對縱切面進行劃傷，傷口長4mm，深度0. 5mm。將處理好的外 植體近軸面向上與培養基成45度角斜插入芽誘導培養基中，密封好后置于培養室中培養， 培養環境為溫度25°C，光周期為16h/8h光照/黑暗。培養基每隔10天更換一次，20天可 獲得再生芽。
[0031] (4)再生芽的生根：前人報道，再生植株生根率為90%，而通過調整培養基配方， 1/2MSB5+IBA1.0mg/L+活性炭30mg/L，生根率可達到95. 3%，效率大大提高。具體方法如 下：將長到5cm的不定芽延基部從外植體上切下，插入生根培養基內，密封好后置于培養室 內培養，培養環境為溫度23°C，光周期為16h/8h光照/黑暗，15天左右便可順利生根。
[0032] (5)組培苗的移栽：生根后的組培苗，在培養室內開蓋煉苗10天左右，然后移栽到 裝有基質的營養缽內，將移栽好的組培苗放在塑料拱棚內生長，保證拱棚內的溫度28°C，相 對濕度60%左右。拱棚內生長10天逐漸給拱棚放風，直至幼苗適應溫室環境，再將拱棚撤 去。
[0033] (6)成活的組培苗便可移栽入露地進行正常管理。
[0034] 實施例3 (1)菜豆無菌苗的獲得： 挑選籽粒均勻、飽滿的菜豆種子，置于玻璃容器內，將濃度為25%的次氯酸鈉溶液緩 緩倒入容器內，使菜豆種子完全浸泡在次氯酸鈉溶液中，整個消毒過程用時14min，并每隔 2min攪拌一次，使種子表面與溶液充分接觸，以保證消毒徹底，消毒后的菜豆種子用無菌水 清洗5次，整個消毒過程在超凈工作臺內完成；將清洗后的菜豆種子插入萌發培養基內，種 子插入一半即可，種子萌發環境為溫度25°C，光周期為16h/8h光照/黑暗； (2) 直接再生培養基的篩選： 將萌發5天的菜豆無菌苗在超凈工作臺中取出，放在滅菌后的培養皿里，切除頂端生 長點及胚根，留下子葉節上下各2. 5_的下胚軸，順著下胚軸將外植體縱向平均分開，得到 兩個對稱的帶子葉的子葉節，用刀片對縱切面進行劃傷，傷口長3. 5mm，深度0. 4mm;將處理 好的外植體近軸面向上與培養基成45度角斜插入芽誘導培養基中，密封并置于培養室中 培養，培養環境為溫度28°C，光周期為16h/8h光照/黑暗；培養基每隔8天更換一次，15天 后可獲得再生植株；所述的芽誘導培養基指的是=MSB5+ 6-BA5.Img/L+IAA0. 7mg/L+活 性炭35mg/L; (3) 再生芽的生根：將長到4cm的不定芽延基部從外植體上切下，插入1/2MSB5+IBA 0. 7mg/L+活性炭25mg/L生根培養基內，密封好后置于培養室內培養，培養環境為溫度 25°C，光周期為16h/8h光照/黑暗，10天順利生根； (4) 組培苗的移栽：生根后的組培苗，在培養室內開蓋煉苗5天，然后移栽到裝有基質 的營養缽內，將移栽好的組培苗放在塑料拱棚內生長，保證拱棚內的溫度28°C，相對濕度 60%，拱棚內生長5天逐漸給拱棚放風，直至幼苗適應溫室環境，再將拱棚撤去； (5) 成活的組培苗便可移栽入露地進行正常管理。
[0035] 實施例4 對比試驗
【權利要求】
1. 一種菜豆直接再生體系的建立方法，其特征在于按如下的步驟進行： (1) 菜豆無菌苗的獲得： 挑選籽粒均勻、飽滿的菜豆種子，置于玻璃容器內，將濃度為10%-30%的次氯酸鈉溶液 緩緩倒入容器內，使菜豆種子完全浸泡在次氯酸鈉溶液中，整個消毒過程用時l〇_2〇min，并 每隔l-2min攪拌一次，使種子表面與溶液充分接觸，以保證消毒徹底，消毒后的菜豆種子 用無菌水清洗4-5次，整個消毒過程在超凈工作臺內完成；將清洗后的菜豆種子插入萌發 培養基內，種子插入一半即可，種子萌發環境為溫度20°C-25°C，光周期為16h/8h光照/黑 暗； (2) 直接再生培養基配方及操作方法： 將萌發5-6天的菜豆無菌苗在超凈工作臺中取出，放在滅菌后的培養皿里，切除頂 端生長點及胚根，留下子葉節上下各1. 5-3. 5mm的下胚軸，順著下胚軸將外植體縱向平 均分開，得到兩個對稱的帶子葉的子葉節，用刀片對縱切面進行劃傷，傷口長3-4mm，深度 0. 3-0. 5mm ;將處理好的外植體近軸面向上與培養基成45度角斜插入芽誘導培養基中，密 封并置于培養室中培養，培養環境為溫度20°C -25°C，光周期為16h/8h光照/黑暗；培養 基每隔5-10天更換一次，15-20天后可獲得再生植株；所述的芽誘導培養基指的是：MSB5+ 6-BA 1. 0-6. 0 mg/L+IAA 0? 1-1. 0 mg/L+ 活性炭 10-50mg/L ; (3) 再生芽的生根培養基配方及操作方法：將長到4-5cm的不定芽延基部從外植體上 切下，插入1/2MSB5+ IBA 0. 1-1.0 mg/L+活性炭5-30mg/L生根培養基內，密封好后置于培 養室內培養，培養環境為溫度20-25°C，光周期為16h/8h光照/黑暗，7-10天順利生根； (4) 組培苗的移栽方法：生根后的組培苗，在培養室內開蓋煉苗3-5天，然后移栽到裝 有基質的營養缽內，將移栽好的組培苗放在塑料拱棚內生長，保證拱棚內的溫度25-28°C， 相對濕度60%，拱棚內生長5天逐漸給拱棚放風，直至幼苗適應溫室環境，再將拱棚撤去； (5) 成活的組培苗便可移栽入露地進行正常管理。
2. 權利要求1所述的菜豆直接再生體系的建立方法，其中的菜豆品種指的是雙豐3號。
3. 權利要求所述菜豆直接再生體系的建立方法在提高菜豆生芽率、生根率、植株成苗 率方面的應用。
【文檔編號】A01H4/00GK104472352SQ201410661867
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月19日 優先權日:2014年11月19日
【發明者】古瑜, 韓啟厚, 于海龍 申請人:天津科潤農業科技股份有限公司