一株殺線蟲氨鞘醇桿菌菌株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一株殺線蟲氨鞘醇桿菌菌株及其應用，屬微生物農藥【技術領域】。殺線蟲氨鞘醇桿菌菌株，該菌株的保藏號為：CGMCC No.9689。殺線蟲氨鞘醇桿菌菌株在制備防治煙草青枯病和三七根腐病菌劑中的應用。本發明的有益效果在于：1、用M-SX103菌株制備的生防菌劑對防治煙草青病，三七根腐病的防治效果在67％以上，適用于種子處理，移栽期和成株期。具有產業化應用前景的生防菌株，為植物靑枯病和三七根腐病的防治提供了新的微生物資源。2、用殺線蟲氨鞘醇桿菌菌株制備的生防菌劑具有成本低、防效高、無殘留、使用方便,對人畜安全的特點，是有機農業種植中防治植物青枯病害的高效生物農藥。
CGMCC No 9689
20140918
【專利說明】一株殺線蟲氨鞘醇桿菌菌株及其應用
【技術領域】
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[0001]本發明涉及一株殺線蟲氨鞘醇桿菌(Sphingobacterium nematocida)M-SX103菌株及其應用，屬微生物農藥【技術領域】。
【背景技術】
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[0002]植物青枯病(Bacterial Wilt)是由青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)弓丨起的一種世界范圍內發生的毀滅性土傳細菌性病害，被稱為植物的"癌癥〃，能使植物減產30-100%，可侵染50個屬的200多種植物，其中危害較重、分布較廣的主要寄主有煙草、番爺、爺子、辣椒等(Hayward, 1991 ;1994)。煙草(Nicotiana tabacum)是我國重要的經濟作物，也是云南省發展地主經濟的主要支柱產業之一。煙草青枯病是熱帶、亞熱帶地區煙草種植區的重要土傳病害，危害嚴重，造成的經濟損失巨大，目前已成為限制煙草種植業發展的嚴重障礙(陳瑞泰等，1997)。三七(Panax notoginseng)是五加科人參屬植物,是我國傳統的名貴的道地藥材。三七主產于云南省文山州，是云南獨具特色的生物資源，也是云南省發展地方特色經濟的重要支柱產業之一(Wei et al.，1996)。由青枯病菌引起的三七根腐病(Root-rot disease)是三七種植中的毀滅性病害,其造成的損失占三七全部病害損失的70-85%，已成為制約三七產業可持續發展的嚴重障礙(董弗兆等，1998)。植物青枯病和三七根腐病均為土傳病害。至今，對這兩種病害的防治主要以施用化學農藥為主。由于化學防治容易造成農藥殘留、污染環境和病原菌產生耐藥性等問題，開發生物農藥已經成為環保、安全、持效的病害防治的主導措施之一。
[0003]殺線蟲氨鞘醇桿菌(Sphingobacteriumnematocida)M_SX103 是 2012 年發表的新物種，M-SX103菌株為煙草內生細菌，在植物根部有很好的定殖能力。該微生物對于煙草黑胚病菌(Phytophthora nicotianae)具有拮抗活性,且對全齒復活線蟲(Panagrellusredivivus)顯示出100%的線蟲致死率(Liu et al.，2012)。該微生物對植物青枯病原菌和三七根腐病的生防特性和防治效果至今未見公開報道。
[0004]參考文獻:
[0005]Hayward AC.1991.B1logy and epidem1logy of bacterial wilt caused byRalstonia solanacearum.Annu Rev Phytopathol 29:65—87.
[0006]Hayward AC.1991.The hosts of Pseudomonas solanacearum.1n:BacterialWilt:The Disease and its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum.(Eds.HaywardAC and Hartman GL.) CAB Internat1nal, Wallingford, UK.pp.9-24.
[0007]Liu J, Yang LL, Xu CK, Xi JQ, Yang FX, Zhou F, Zhou Y, Mo MH, Li WJ.2012.Sphingobacterium nematocida sp.nov., a nematicidal endophytic bacteriumisolated from tobacc0.1nternat1nal Journal of Systematic and Evolut1naryMicrob1logy 62(8):1809-1813.
[0008]Wei JX, Du YC.1996.Modern Science Research and Applicat1n of Panaxnotoginseng.Yunnan Science and Technology Press, Kunming, China.
[0009]陳瑞泰等.1997.全國16個主產煙省(區)煙草侵染性病害調查報告.中國煙草科學，(4): 1-7.
[0010]董弗兆等.1988.云南三七.云南科技出版社，昆明，pp.103-114.
[0011]繆作清等.2006.三七根腐病病原研究.中國農業科學，39 (7):1371-1378.
【發明內容】
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[0012]本發明的目的在于提供一株殺線蟲氨鞘醇桿菌(Sphingobacterium nematocida)M-SX103菌株及其應用。
[0013]本發明的殺線蟲氨鞘醇桿菌(Sphingobacterium nematocida)M-SX10菌株,是從煙草內生菌中篩選出的具有產業化應用前景的生防菌株，為植物靑枯病和三七根腐病的防治提供了新的微生物資源。
[0014]本發明具體是這樣實現的:
[0015]殺線蟲氨鞘醇桿菌(Sphingobacterium nematocida) M-SX103菌株,分離自云南烤煙品種NC297的健康葉片內，該囷株于2014年9月18日保存于中國微生物囷種保減委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北晨西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號:CGMCC N0.9689。
[0016]殺線蟲氨鞘醇桿菌(Sphingobacterium nematocida)M_SX103菌株,在牛肉膏蛋白胨培養基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g，補水至l，000mL，pH7.2)上，菌落呈黃色，圓形，邊緣凸起，細胞為桿狀，直徑0.4-0.8 μ m，長1.0-1.5 μ m,孢子不游動，革蘭氏陰性。該菌株在10-40°C的溫度范圍內生長，最適生長溫度37°C ;在pH 6.0-9.0的范圍內生長，最適生長pH為7.0 ;在濃度為0-3%的NaCl (w/v)范圍內生長，最適生長濃度為0-1%的 NaCl。利用引物 5’ -GGT TAC CTT GTT ACG ACT T_3，，5，-AGA GTT TGA TCM TGGCTC AG-3’經PCR擴展該菌株的16S rRNA基因，獲得的序列提交到GeneBank公共數據庫，其序列號為JF731241，此序列是鑒定該菌株的主要特征依據。M-SX103菌株的主要脂肪酸是異式十五碳飽和脂肪酸(57.7% ),異式十七碳飽和脂肪酸(7.7% )和summed feature3(9.6% )0是鑒別該菌的次要特征依據。
[0017]本發明的殺線蟲氨鞘醇桿菌(Sphingobacterium nematocida)M-SX103菌株在制備防治煙草青枯病和三七根腐病菌劑中的應用。
[0018]本發明的有益效果在于:
[0019]1、用M-SX103菌株制備的生防菌劑對防治煙草青病，三七根腐病的防治效果在67%以上，適用于種子處理，移栽期和成株期。具有產業化應用前景的生防菌株，為植物靑枯病和三七根腐病的防治提供了新的微生物資源。
[0020]2、用殺線蟲氨鞘醇桿菌(Sphingobacterium nematocida)M-SX103菌株制備的生防菌劑具有成本低、防效高、無殘留、使用方便，對人畜安全的特點，是有機農業種植中防治植物青枯病害的高效生物農藥。
【具體實施方式】
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[0021]實施例所用殺線蟲氨鞘醇桿菌(Sphingobacterium nematocida)M-SX103菌株,分離自云南烤煙品種NC297的健康葉片內，該菌株于2014年9月18日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號=CGMCC N0.9689。
[0022]實施例1:M_SX103菌株的培養及菌劑制備
[0023]M-SX103菌株試管斜面種子的培養:將菌株接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基的斜面上，于15-37°C條件下培養2-3天后獲得M-SX103菌株斜面種子，適宜的培養條件是32°C下培養2天。
[0024]M-SX103菌株液體種子的液體培養:從斜面種子上取一環M-SX103菌株接種到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液體培養基(牛肉膏蛋白胨固體培養基不添加瓊脂以下簡稱NB)中，于37°C下，轉速200rpm，培養2-3天，制得種子液。
[0025]M-SX103菌株發酵罐大量培養:將所述種子液按3_5 % (V/V)的比例接入含有NB培養基的發酵罐中培養，在20-1，000升發酵罐中的培養條件控制在:溫度32-37°C，攪拌速度150 — 250rpm，發酵時間48-72小時。
[0026]M-SX103可濕性菌劑的制備:經發酵罐培養獲得的微生物菌體及其代謝無作為原藥與農藥常規吸附載體和助劑按常規方法制成M-SX103可濕性粉劑生防菌劑。菌劑需保證M-SX103的活菌數含量在I XlOici個/克以上。
[0027]實施例2:M-SX103菌劑對煙草青枯病的防效試驗
[0028]煙草青枯病病原菌(Ralstonia solanacearum)的培養:在TTC培養基(蛋白胨10.0g，酪朊水解物1.0g，2，3，5-氯化三苯基四氮哇0.05g，葡萄糖10.0g，瓊脂20.0g,蒸餾水1，OOOmL, pH 6.8-7.2)固體平板上接種煙草青枯病病原菌，32°C下培養3天后挑取單菌落接種于NB液體培養基中，37°C下，200rpm下搖床培養2天，將煙草青枯病菌配成2.0X108cfu/mL濃度的菌懸液備用。
[0029]供試藥劑:a.活菌數含量為2.5\101(1個/克的13乂103可濕性菌劑；b.25%青枯凈可濕性粉劑(廣東省農科院作物所煙草室研制)。
[0030]防效試驗方法:烤煙常規漂浮育苗時，將60g的M-SX103可濕性菌劑用400mL水稀釋后與Ikg育基質混勻；陽性對照處理為25%青枯凈可濕性粉劑Ig用400mL水稀釋后與Ikg育基質混勻；空白對照為400ml水與Ikg育基質混勻。待煙苗長至5_6片葉子時，在直徑為20cm的、裝有500g 土壤(質量比為:沙土:腐殖土 = 1:1)的每一花缽移栽一株煙苗，在煙根接種煙草青枯病病原菌6ml，每處理三個重復，每重復5盆。肥水管理按常規方法進行，在室溫溫室內生長90天后統計各處理的煙草青枯病的發病率，按以下公式計算發病率，病情指數和防病效果:
[0031]病情指數=[Σ (各級癥狀代表值相應的級數)]X 100/最高級癥狀代表值X調查總株數)X 100
[0032]防病效果)=(空白對照病指-藥劑處理病指/對照病指)X 100
[0033]病情分級:0級為無癥狀；1級為1-2片葉萎蔫；2級為1/3-1/2葉片萎蔫或莖桿基部變黑；3級為2/3-3/4葉片萎蔫、壞死且莖桿變黑壞死；4級為整株死亡。
[0034]試驗結果表明:空白對照的病情指數為77.4 ;25%青枯凈可濕性菌劑處理的病情指數為25.4，防效為67.1 % ;M-SX103可濕性菌劑處理的病情指數為23.7%，防效為69.4%，與化學農藥25%青枯凈可濕性粉劑的防治效果相當。
[0035]實施例3:M-SX103菌劑防治三七根腐病的田間試驗
[0036]本試驗在云南省文山州三七研究院的大棚試驗地進行，該試驗地已經連作三七20年，三七根腐病的發病率在80%以上。在三七育苗時，將10g菌體含量為2.5X101(I個/g的M-SX103可濕性菌劑用IL水溶化，加入Ikg三七種子混勻，使菌劑粘附在種子上，然后按常規育種方法管理。移栽時每畝三七苗的用1kg菌劑兌水200kg均勻灌根，移栽一年后用相同劑量的菌劑和方式再施用一次。對照藥劑為50%的農利靈可濕性粉劑(德國巴斯夫公司)，用量為每畝2kg，施用方法同M-SX103粉劑。空白對照不施用任何藥劑，每處理三個重復，每重復100株苗。三七移栽后的肥水管理按常規進行，移栽兩年后統計各處理的發病率，按以下公式計算發病率和防效:
[0037]發病率)=發病株數/調查株數X 100
[0038]防治效果)=空白對照的發病率-藥劑處理的發病率
[0039]試驗結果表明:空白對照的發病率為100% ;農利靈處理的發病率為30.6%，防效為69.4% ；M-SX103可濕性粉劑處理的發病率為28.2%，防效為71.8%，與50%的農利靈可濕性粉劑防效相當。
【權利要求】
1.殺線蟲氨鞘醇桿菌(Sphingobacteriumnematocida)M-SX103菌株，該菌株的保藏號為:CGMCC N0.9689。
2.權利要求1所述的殺線蟲氨鞘醇桿菌(Sphingobacteriumnematocida)M-SX103菌株在制備防治煙草青枯病和三七根腐病菌劑中的應用。
【文檔編號】A01N63/00GK104450560SQ201410629500
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月11日 優先權日:2014年11月11日
【發明者】馬莉, 莫明和 申請人:云南大學