一種禾本科植物離體培養方法
【專利摘要】本發明涉及一種禾本科植物離體培養方法，該方法是實現禾本科植物從拔節、抽穗、揚花、灌漿、乳熟、臘熟至完熟整個過程的長期離體培養的新方法，利用配置含有禾本科植物生長發育所必須的常量元素、微量元素和有機物的培養液，通過室內培養，實現禾本科植物在離體狀態下正常生長發育，以保證植物生長發育過程中外界條件的一致性，剔除待研究因素外的其他因素對植株生長發育的影響，提高試驗研究的精準性。該方法主要解決在研究田間栽培下禾本科植物成熟過程中生理生化指標的變化及其對某營養元素的響應時極易受到田間眾多的外界環境因素的影響的問題。本發明可用于小麥、大麥、黑麥、燕麥、水稻和玉米等所有禾本科植物的長期離體培養，從而加速對高產、高效、優質禾本科農作物的選育。
【專利說明】一種禾本科植物罔體培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種禾本科植物離體培養的方法。
【背景技術】
[0002]傳統的植物生長發育研究主要是在田間進行，影響因子非常復雜。施入田間的營養元素因土壤質地的不同和土壤微生物的作用，植株對養分的吸收和利用效率也明顯受到影響。因此大田種植或盆栽培養下由于眾多因素的影響，無法控制禾本科植株營養器官同化物向穗的流動，即庫(穗)_源(營養元素)關系無法得到有效控制，營養元素對植物生長發育的研究往往無法精確。因而，采用離體培養技術則可以有效簡化源-庫關系，使得在新的源”(培養基庫(穗)系統中，“源”可以得到有效的控制。這對于研究營養、激素物質和環境因子對禾本科植物生長發育的影響具有重要價值。
[0003]離體培養作為一種實驗方法很早就已被采用。Buttrose和May (1959)在試驗中將離體麥穗于C 一蔗糖溶液中飼喂5小時，然后轉移到蒸餾水中放置9天。Drennan和Krishnamurthy (1964)于抽穗后16天剪下麥穗在滅菌條件下短期培養，研究了粒重的變化。Jenner(1968)報道將離體麥穗在蔗糖溶液中短期培養增加了籽粒淀粉含量。戴云嶺等人(1968)曾將孕穗期的主莖從旗葉環以下20cm處截斷，插于Knop氏溶液中飼喂30分鐘，此后在不同條件(遮光和照光)下靜置24小時，研究了不同處理離體器官的同化效率和同化物分配。
[0004]然而，上述試驗采用離體培養方法均是短期處理。Donovan和Lee (1977)成功地建立了麥穗長期培養方法，在此方法中，將揚花后8天左右的離體麥穗在穗下約14cm處剪斷，放于液體培養基中培養15天，籽粒正常生長。培養液含有蔗糖、各種氨基酸和必要的礦質元素，培養期間需將培養瓶維持在+ 1°C的冷水浴中，這對于普通實驗室來說，操作條件存在很大的難度。這一方法后經Singh和Jenner (1983)改進，可使離體培養在常溫下實現，但是培養時間仍然比較短(12-15天)，無法使小麥孕穗期到完熟期的整個過程得到精準研究。本發明在前人的研究基礎上，經過改進，建立了一種可用于研究從拔節期、孕穗期、揚花期、灌漿期、乳熟期、臘熟期至完熟期的整個生長發育過程中植物對營養元素的吸收、利用的離體培養方法。該方法降低了培養難度，培養條件和方法簡便，在日光燈光源和室溫下即可實現；簡化了培養基成分，不需要氨基酸，只需必要的常量元素和微量元素及簡單的有機物；大大延長了培養時間，植物在還拔節或未開始揚花的孕穗期就可以實現離體培養，室內培養時間可長達60天以上，且培養方法可適用于包括小麥、黑麥、大麥、燕麥、水稻和玉米等所有禾本科植物，從而實現了植物在整個生長發育過程中對營養元素的吸收、利用的精準研究。對于實現禾本科農作物的“高產、高效、優質”發展，促進糧食生產，保證糧食安全和國家安全均具有一定的價值和意義。
[0005]
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于，提供一種禾本科植物離體培養方法，該方法根據離體植物在適當的環境下仍能生長發育的自我生理調節機制，利用特制培養液，實現禾本科植物從拔節或抽穗、揚花、灌漿、乳孰、臘熟和完熟的整個過程的離體培養，從而為實現禾本科植物營養吸收研究提供精準控制條件，避免田間培養時眾多環境因素影響造成的研究難度和低精準度。該方法培養條件簡單、方法簡便，在日光燈光源和室溫下即可實現；簡化了培養基成分，不需要氨基酸，只需必要的常量元素和微量元素及簡單的有機物；大大延長了培養時間，室內培養時間可長達60天以上,且培養方法不僅適合小麥、而且適合大麥、黑麥、燕麥、水稻和玉米等禾本科植物，提高了植物在整個生長發育過程中對營養元素的吸收、利用的研究精準度。
[0007]本發明所述的一種禾本科植物離體培養方法，按下列步驟進行:
a、按常規方法配制含有常量元素N、P、K、Ca、Mg,微量元素Fe、Μη、B、Mo、Cu、Co、Na和有機物蔗糖、煙酸、肌醇、維生素B6和維生素的培養液；
b、將配制好的培養液置于配有棉塞的廣口瓶中，經1.5KPa高壓滅菌120min，在溫度4°C下保存；
c、于拔節期或孕穗期選擇性狀一致的主植株為旗葉和倒二葉的葉距為8-lOcm的主穗，用剪刀從基部剪去，置于凈水中帶回室內；
d、去掉下部各葉，保留旗葉和各葉葉鞘，用0.l%HgCl消毒15min，并經三次無菌水沖洗后，通過棉塞插入裝有步驟b經過高壓的液體培養基的廣口瓶中，每5穗一瓶，室內培養，光源為日光燈，光照10小時/天，培養溫度為20 - 25°C ；
e、培養過程中，密切關注植株對培養液的吸收,待植株對培養液的吸收量超過所加液體的70%，立即添加培養液，為防止培養基污染，每7-10天更換一次培養液。
[0008]步驟a培養液各組分的濃度含量為:常量元素中7.8 mmol/L NH4N03、1.66mmolLK2S04、2.5mmol/L ΚΗ2Ρ04、0.2mmol/L CaS04.2H20 和 0.3mmol/L MgS04.7H20 ;微量元素中27.8mg/L FeS04.7Η20、37.3 mg/L Na.C10H16N208.2H20、16.9 mg/L MnS04.H20、6.2 mg/L H3B03、0.83 mg/L K1、0.25 mg/L Na2M04.2H20、0.25 mg/L CuS04.5H20 和 0.025 mg/LCoCl.6H20 ;有機物為 4% 蔗糖、lOOmg/L 肌醇、1 mg/L 煙酸、1 mg/L VB6 和 1 mg/L VB10
[0009]該方法適用于小麥、大麥、黑麥、燕麥、玉米和水稻等從拔節或抽穗至完熟整個過程的禾本科植物離體培養。
[0010]本發明所述的一種禾本科植物離體培養方法，該方法用特制培養液作為植物正常生長發育的營養元素來源，在配置特制培養基的同時，可以根據試驗研究的需要，在特制培養液中改變含有某一元素的試劑含量，以達到保證其他元素含量一致的情況下，精確研究變量營養元素對植株生長發育的影響，在改變元素含量時最好按照一定梯度來設計，避免元素濃度變化過劇影響研究目的。
[0011]本發明所述的一種禾本科植物離體培養方法，其特點為:
(1)本發明采用特制培養液對禾本科植物進行離體培養，通過嚴格控制培養液的組成成份和保證外界條件一致情況下，來研究禾本科植物成熟過程中的生理生化指標變化或對某元素的響應。與田間培養技術相比，本發明可以有效避免田間培養下因外界環境因素不一致所造成的誤差，從而為研究植物生長發育過程對營養元素改變的生理生化指標變化提聞精度。
[0012](2)與現有的小麥離體培養技術相比，本發明可以顯著延長植株離體培養的時間，實現對植株從拔節或抽穗到晚熟的整個生長發育過程的室內培養和觀察，且適用于小麥、大麥、黑麥、燕麥、水稻和玉米等所有禾本科植物。
【具體實施方式】
實施例
[0013]培養液配制:
按常規方法配制常量元素:按濃度1.66mmol L K2S04、2.5mmol/L KH2P04、0.2mmol/LCaS04.2H20和0.3mmol/L MgS04.7H20計算各化學試劑每升所需質量，將其先后溶于1/2L重蒸餾水中，為了使試劑充分溶解，可以先溶解完全一種試劑后再溶解另一種試劑，備用；按常規方法配制不同濃度含量的氮素營養液:取5份配好的常量元素營養液，分別按0mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20 mmol/L 濃度梯度添加溶解 ΝΗ4Ν03，備用；
按常規方法配制微量元素:按濃度16.9 mg/L MnS04.Η20、6.2 mg/L Η3Β03、0.83 mg/LΚΙ、0.25 mg/L Na2M04.2Η20、0.25 mg/L CuS04.5Η20 和 0.025 mg/L CoCl.6Η20 計算每升所需質量，將其先后加入溶有常量元素的溶液中溶解，待完全溶解后備用；由于微量元素中的FeS04.7H20和Na.C10H16N208.2H20兩種試劑容易產生沉淀，需單獨配置這兩種試劑，取待配制溶液的1/50的重蒸水，加熱至沸騰，稍冷卻后，按濃度27.8mg/L FeS04.7Η20計算每升所需質量，將其溶于沸騰后重蒸水中，待完全溶解后，再加熱至沸騰lOmin，稍冷卻后，按濃度37.3 mg/L Na.C1(lH16N208.2H20.2H20計算每升所需質量，將其溶解于配好的FeS04.7Η20的溶液中，待完全溶解后再加熱至沸騰lOmin，待溶液冷卻后，再將該溶液轉移至溶有常量元素和微量元素的混合液中；
再按質量濃度4%鹿糖、100mg/L肌醇、1 mg/L煙酸、1 mg/L VB6和1 mg/L VBi計算每升所需質量，將其先后溶于溶有常量元素及微量元素的混合液中，待所有試劑都充分溶解完后，進行定容，定溶過程中用CH3C00H和NaHC03調節溶液pH值5.0 — 5.5范圍內，即得到不同氮素濃度含量的培養液；
培養液高壓
將配制好的培養液分裝在配有棉塞的250ml廣口瓶中，每瓶溶液為200ml，經1.5KPa高壓滅菌120min，在溫度4°C下保存，為保證高壓鍋內為真空狀態以達到培養液的滅菌效果，當氣壓上升到0.5KPa時需慢慢打開放氣閥放氣，直至氣壓指針指向0，然后關閉放氣閥，等到氣壓指示表達到設定氣壓后，開始計時；瓶口上棉塞的松緊對于后期植株的放置有較大影響，棉塞太緊，在放置植株時會將莖桿壓破；棉塞太松，會讓空氣進入培養液內，引起培養液污染，制作棉塞時，以放置在廣口瓶的棉塞能插入食指而沒有壓迫感和松弛感為標準；麥穗選擇和預處理
選擇拔節或孕穗期性狀一致的主穗，即旗葉和倒二葉的葉距為8-lOcm的麥穗，用剪刀從植株基部剪下，將剪下的主穗置于凈水中帶回室內，然后剪去下部各葉，保留旗葉和各葉葉鞘，用質量0.l%HgCl消毒植株莖桿15min并用無菌水沖洗三次；
麥穗的離體培養
將消毒后的麥穗通過棉塞插入裝有經過高壓滅菌的培養液的廣口瓶中，每5穗一瓶，置于培養室內培養，光源為日光燈，光照10小時/天，溫度為20-25°C，室內用空調保證恒溫和空氣流暢；
培養過程中，尤其是在灌漿前，植株對培養液的吸收量很大，需密切關注植株對培養液的吸收，植株對培養液的吸收量超過所加液體的70%，即培養瓶中的液體下降至1/3位置時，立即添加培養液；因為培養液中含有有機物，為防止培養液污染，每7-10天更換一次培養液，添加或更換培養液時，需在無菌操作臺進行，保證整個過程的無菌操作，防止污染培養液，同時，須剪去麥穗莖桿基部l-2cm，用質量0.l%HgCl消毒和高壓后的無菌水將莖桿沖洗干凈，重新置入添加培養液的廣口瓶中，減少培養液的污染幾率。
[0014]研究分析結果:
氮素營養對于小麥麥穗的生長發育具有重要作用，在0-15mmol/L之間，當氮素濃度增加時，小麥的粒數和粒重明顯增加，但當氮素濃度超過15mmol/L后，隨著氮素濃度增加，小麥麥穗粒數和粒重變化不顯著。
[0015]按實施例所述的方法，該方法中的小麥可替換成大麥、黑麥、燕麥、玉米或水稻從拔節或抽穗至完熟整個過程的禾本科植物離體培養。
【權利要求】
1.一種禾本科植物離體培養方法，其特征在于按下列步驟進行: a、按常規方法配制含有常量元素N、P、K、Ca、Mg，微量元素Fe、Mn、B、Mo、Cu、Co、Na和有機物蔗糖、煙酸、肌醇、維生素B6和維生素B1的培養液； b、將配制好的培養液置于配有棉塞的廣口瓶中，經1.5KPa高壓滅菌120min，在溫度4°C下保存； C、于拔節期或孕穗期選擇性狀一致的主植株為旗葉和倒二葉的葉距為8-lOcm的主穗，用剪刀從基部剪去，置于凈水中帶回室內； d、去掉下部各葉，保留旗葉和各葉葉鞘，用0.l%HgCl消毒15min，并經三次無菌水沖洗后，通過棉塞插入裝有步驟b經過高壓的液體培養基的廣口瓶中，每5穗一瓶，室內培養，光源為日光燈，光照10小時/天，培養溫度為20 - 250C ； e、培養過程中，密切關注植株對培養液的吸收,待植株對培養液的吸收量超過所加液體的70%，立即添加培養液，為防止培養基污染，每7-10天更換一次培養液。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟a培養液各組分的濃度含量為:常量元素中 7.8 mmol/L NH4NO3U.66mmol LK2SO4,2.5mmol/L ΚΗ2Ρ04、0.2mmol/L CaSO4.2Η20 和0.3mmol/L MgSO4.7Η20 ;微量元素中 27.8mg/L FeSO4.7Η20、37.3 mg/L Na.C10H16N2O8.2Η20、16.9 mg/L MnSO4.Η20、6.2 mg/L H3BO3>0.83 mg/L ΚΙ、0.25 mg/L Na2MO4.2Η20、0.25 mg/L CuSO4.5H20 和 0.025 mg/L CoCl.6H20 ;有機物為 4% 蔗糖、lOOmg/L 肌醇、I mg/L 煙酸、Img/L VB6和 I mg/L VB10
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于該方法適用于小麥、大麥、黑麥、燕麥、玉米和水稻從拔節或抽穗至完熟整個過程的禾本科植物離體培養。
【文檔編號】A01H4/00GK104273035SQ201410572124
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月24日 優先權日:2014年10月24日
【發明者】周洪華, 李衛紅 申請人:中國科學院新疆生態與地理研究所