一種調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長的myl2基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術領域】，提供了一種調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長的MYL2基因cDNA序列及其克隆方法，該基因的cDNA序列如SEQIDNO.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示?？梢酝ㄟ^對該基因的表達調(diào)控進行操作，為培育生長速度快的綿羊品種奠定基礎，具有重要的現(xiàn)實意義。
【專利說明】-種調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長的MYL2基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種可以調(diào)控小尾寒羊骨骼 肌生長的MYL2基因及其在綿羊育種中的應用。
【背景技術】
[0002] 肌球蛋白輕鏈2 (MYL2)為肌球蛋白輕鏈家族中的一員，為一種調(diào)節(jié)性輕鏈，主要 對肌纖維的活性起調(diào)控作用。研究報道MYL2的磷酸化可使肌球蛋白重鏈上ATP酶的活性 增加，從而使肌球蛋白的類型發(fā)生轉(zhuǎn)變，并且發(fā)現(xiàn)該基因在在成熟肌肉中表達而在培養(yǎng)的 鼠 C2C12成肌細胞分化過程中不表達。說明MYL2基因可能調(diào)控肌細胞的生長和發(fā)育，從而 影響肌肉的生長速度和肌肉品質(zhì)。
[0003] 目前，還未見到有關于小尾寒羊的MYL2基因的序列報道，并且關于該基因?qū)∪?生長和發(fā)育的調(diào)控還不清楚。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 基于上述的原因，本發(fā)明提供了一種可以調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長的MYL2基因， 其cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，除poly (A)外長為776bp ;該序列中的開放讀碼框編碼 166個氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。該基因具有調(diào)控骨骼肌生長的功能，應用 該基因可以通過對該基因的表達調(diào)控進行操作，為實現(xiàn)培育生長速度快的綿羊品種奠定基 礎。
[0005] 本發(fā)明所提供的調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長的MYL2基因，其cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，除poly(A)外長為776bp ;該序列中的開放讀碼框編碼166個氨基酸，氨基酸序 列如SEQ ID NO. 2所示。
[0006] 上述的MYL2基因是通過如下方法獲得的：
[0007] (1)小尾寒羊肌肉總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄：
[0008] 采用TRIzol法提取小尾寒羊肌肉組織總RNA，提取的RNA以Agilent 2100Bioanalyzer進行檢測，要求總RNA含量在10μ g以上且RIN(RNA完整性指標）彡7. 5， 并根據(jù)現(xiàn)有技術經(jīng)Roche公司的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；
[0009] (2)MYL2基因 cDNA序列保守區(qū)的擴增：
[0010] 比對已有物種MYL2基因的cDNA序列，根據(jù)保守區(qū)設計上下游引物，以步驟⑴中 的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增克隆測序得到保守區(qū)序列；
[0011] ⑶應用3'降落巢式PCR法對MYL2基因 cDNA序列的3'端進行擴增：
[0012] 根據(jù)所得保守區(qū)序列設計MYL2基因的3'特異內(nèi)側(cè)和外側(cè)引物；
[0013] 以3'特異外側(cè)引物和3'通用外側(cè)引物采用退火溫度逐漸降落法對上述cDNA第 一鏈進行第一輪PCR擴增；
[0014] 然后以3'特異內(nèi)側(cè)引物和3'通用內(nèi)側(cè)引物采用同樣的退火溫度逐漸降落法對 第一輪PCR擴增產(chǎn)物進行第二輪PCR擴增；
[0015] 對第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測序得到MYL2基因cDNA序列的3'端序列；
[0016] (4)應用Y RACE法對MYL2基因cDNA序列的Y端進行擴增：
[0017] 對小尾寒羊肌肉組織經(jīng)TRIzoI法所提總RNA依次進行常規(guī)的去磷酸化處理、"去 帽子"反應、與接頭序列連接并以TaKaRa公司的Y -Full RACE Kit With TAP試劑盒反 轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈；
[0018] 根據(jù)所得保守區(qū)序列設計MYL2基因的5'特異外側(cè)和特異內(nèi)側(cè)引物；
[0019] 以5'特異外側(cè)和5'通用外側(cè)引物進行第一輪PCR擴增；
[0020] 以Y特異內(nèi)側(cè)和Y通用內(nèi)側(cè)引物進行第二輪PCR擴增；
[0021] 內(nèi)側(cè)PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測序得到MYL2基因cDNA序列的Y端序列；
[0022] (5)全長序列拼接及克隆測序驗證：
[0023] 根據(jù)重疊區(qū)域?qū)ι鲜霾襟E獲得的cDNA的保守區(qū)、5'和3'所得序列進行拼接，獲 得MYL2基因的全長cDNA序列；設計兩端序列為上下游引物，PCR擴增并克隆測序得到MYL2 基因的全長cDNA序列，具有如SEQ ID NO. 1的核苷酸序列。
[0024] 對該cDNA序列進行生物信息學分析，得到該基因編碼產(chǎn)生含有166個氨基酸的蛋 白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0025] 之后發(fā)明人利用qRT-PCR法測定MYL2基因在小尾寒羊心、肝、肌肉等組織中的表 達量，發(fā)現(xiàn)該基因主要在小尾寒羊的心肌和背最長肌中表達，表明該基因具有調(diào)控骨骼肌 生長的功能。
[0026] 綜上所述，本發(fā)明提供了一種可以調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長的MYL2基因，該基因 具有調(diào)控骨骼肌生長的功能，應用該基因可以通過對該基因的表達調(diào)控進行操作，為實現(xiàn) 培育生長速度快的綿羊品種奠定基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明中小尾寒羊MYL2基因cDNA保守區(qū)擴增圖，
[0028] 圖中M為DL2000分子量標準；另一條為MYL2基因cDNA保守區(qū)序列；
[0029] 圖2為本發(fā)明中小尾寒羊MYL2基因3'端擴增圖，
[0030] 圖中M為DL2000分子量標準；另一條為MYL2基因cDNA的3'端序列；
[0031] 圖3為本發(fā)明中小尾寒羊MYL2基因Y RACE擴增圖，
[0032] 圖中M為DL2000分子量標準；另一條為MYL2基因cDNA的5'端序列；
[0033] 圖4為本發(fā)明中小尾寒羊MYL2基因cDNA全長序列擴增圖，
[0034] 圖中M為DL2000分子量標準；另一條為MYL2的全長cDNA序列；
[0035] 圖5為本發(fā)明中MYL2在小尾寒羊不同組織中的表達水平柱狀圖，
[0036] 圖中a、b、c表示小尾寒羊各組織間的差異顯著性（p〈0. 05) ;MYL2主要在心肌和 背最長肌中表達。
【具體實施方式】
[0037] 以下結合附圖對本發(fā)明的上述
【發(fā)明內(nèi)容】
作進一步的詳細描述。應理解，這些實施 例僅為了說明本發(fā)明而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。
[0038] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照制造廠商所建議的實驗條 件或常規(guī)方法，如Sambrook等編著的分子克隆實驗手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件。
[0039] 實施例I :小尾寒羊背最長肌組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 [0040] 取小尾寒羊背最長肌約20g，使用康為世紀公司的總RNA提取試劑盒（No. CW0580)提取肌肉組織的總RNA ;將提取的RNA采用Roche公司的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (No. 05081955001)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0041] 實施例2 :cDNA保守區(qū)序列的克隆與測序
[0042] (1)引物的設計：從NCBI上下載人、豬、牛、鼠等各物種MYL2基因的cDNA序列， 以DNAMN 6. 0軟件進行比對獲得保守區(qū)序列，設計該基因 cDNA的保守區(qū)引物為：Fl : GGACTGTGGGATTCTTCTGjnSEQIDN0.3K*jPF2:TTTGCTCGACCTCCTTmnSEQIDN0.4 所示；
[0043] (2) PCR擴增：以實施例1獲得的cDNA第一鏈為模板，采用TIANGEN的PCR MasterMix試劑盒（KT201)進行PCR擴增；50μ 1擴增體系中包含：PCR MasterMix 25μ 1 ; Fl(10X)2y I ;F2(10X)2y I ;cDNA 第一鏈 2μ 1。擴增條件為：94°C，5min ;(94°C 30s， 52°C 30s，72°C lmin)35cycles ;72°C，10min。擴增結果見附圖 I ;
[0044] (3)擴增條帶的回收：PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖的TAE凝膠進行電泳凝，切取相 應條帶；采用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒（#0691)對PCR產(chǎn)物進行純化回收；
[0045] (4)回收產(chǎn)物與載體連接：載體與片段的摩爾比控制在1:3-1:8 ;根據(jù)擴增產(chǎn)物回 收后凝膠電泳情況將回收產(chǎn)物稀釋至標準濃度，依PMD18-T載體試劑盒說明書（No. 6011) 進行連接反應。
[0046] (5)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：取適量連接產(chǎn)物，依TIANGEN公司的大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5a (CB101)使用說明進行轉(zhuǎn)化及細菌的培養(yǎng)操作；
[0047] (6)菌液PCR鑒定：吸取1?2 μ 1菌液作模板，依據(jù)⑵中PCR擴增體系和條件 進行擴增，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶；
[0048] (7)克隆產(chǎn)物的測序分析：如果凝膠檢測含有目的條帶且較純，則吸取Iml菌液測 序分析，得到長為675bp的一條保守區(qū)目標序列。
[0049] 實施例3 :cDNA 3'端序列的克隆與測序
[0050] 采用降落巢式PCR法克隆cDNA序列的3'端，具體步驟如下：
[0051] (1)引物的設計與合成：根據(jù)實施例2所得MYL2基因 cDNA保守區(qū)的測序結果， 設計兩條上游嵌套式引物,3 ^ GSP :GGCTGATTATGTCAAGGAGATGC，如SEQ ID NO. 5所示，和 3' NGSP:CTTTGGGTGGGCAGATGGGGGCA，如SEQ IDN0. 6所示；并合成兩條下游:V 通用引物， 3，-UP :GACTCGAGTCGATCGA，如 SEQ ID NO. 7所示，和 OligodT-AP :GACTCGAGTCGATCGA (T) 18， 如 SEQ ID NO. 8 所示。
[0052] (2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈：取IOOpg?1μ g實施例1中提取的RNA，加入 OligodT-AP為反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；
[0053] (3)夕卜側(cè)PCR擴增：以3 ' GSP和OligodT-AP為上下游引物，依實施例2中PCR 反應試劑盒體系進行，擴增程序為：98°C，30s ;(98°C，10s ;70°C，30s ;72°C，30s)3cycles ; (98 °C, IOs ；68 °C, 30s ；72 °C, 30s) 4cycles ； (98 °C, 10s ；66 °C, 30s ；72 °C, 30s) 5cycles ； (98 °C, 10s ；64 °C, 30s ；72 °C, 30s) 6cycles ； (98 °C, 10s ；62 °C, 30s ；72 °C, 30s) 8cycles ； (98〇C, IOs ；60°C, 30s ；72〇C, 30s) IOcycles ；72〇C, IOmin ；4°C ；
[0054] (4)內(nèi)側(cè)PCR擴增：以3' NGSP和3' -UP為上下游引物，步驟⑶的擴增產(chǎn)物稀 釋30倍為模板，依上述步驟（3)中反應條件和擴增程序進行目的條帶的擴增，擴增結果見 附圖2;
[0055] (5)PCR產(chǎn)物的克隆測序：擴增條帶的回收、與載體連接、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及測序 同實施例2,得到長為212bp的一條序列。
[0056] 實施例4 :cDNA 5'端序列的克隆與測序
[0057] 采用5' RACE法克隆5'端序列，步驟如下：
[0058] (1)引物的設計與合成：根據(jù)實施例3所得MYL2基因 cDNA保守區(qū)的測序結果， 設計兩條下游嵌套式引物，5 ^ GSP :CCACTCCCTTAGTCCTTCTCTTC，如SEQ ID NO. 9所示， 和Y NGSP :GAATGCGTTGAGAATGGTC，如SEQ ID NO. 10所示；并合成兩條上游Y通用引 *，5,-0uterPrimer:CATGGCTACATGCTGACAGCCTAjnSEQIDN0.1lK*jP5，-Inner Primer :CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG，如 SEQ ID NO. 12 所示。
[0059] (2)mRNA的去磷酸化處理
[0060] ①配制去磷酸反應液：
【權利要求】
1. 一種調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長的MYL2基因，其特征在于：具有如SEQ ID NO. 1所示 的cDNA序列，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 根據(jù)權利要求1所述的MYL2基因，其特征在于：其來源于小尾寒羊骨骼肌的肌球蛋 白輕鏈2。
3. 權利要求1所述的調(diào)控骨骼肌生長的MYL2基因，在綿羊育種中的應用。
4. 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于：通過對MYL2基因的表達進行調(diào)控，為培 育生長速度快的綿羊品種奠定基礎。
【文檔編號】A01K67/027GK104212809SQ201410472119
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月17日 優(yōu)先權日:2014年9月17日
【發(fā)明者】王建民, 張春蘭, 紀志賓, 王桂芝, 秦孜娟, 候嘉 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學