一種提高百合胚性愈傷組織保存效果的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高百合胚性愈傷組織保存效果的方法，為采用含有碳納米材料的玻璃化溶液處理百合胚性愈傷組織以提高其保存效果，具體包括：預培養、裝載液處理、玻璃化溶液處理和液氮保存步驟，其中所述玻璃化溶液含有0.1~0.5g/L碳納米管。本發明中公開的方法對百合胚性愈傷組織的保存效果優化顯著，通過添加碳納米管作為外源物質對植物玻璃化超低溫保存起到促進作用。
【專利說明】一種提高百合胚性愈傷組織保存效果的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物或其局部的保存領域，具體涉及一種提高百合胚性愈傷組織保存 效果的方法。
【背景技術】
[0002] 超低溫保存是上世紀70年代發展起來的一項現代種質資源離體保存技術。通常 在液氮中保存，被保存材料細胞內的物質代謝和生長活動幾乎完全停止，處在相對穩定的 生物學狀態，達到長期保存種質的目的，超低溫保存是目前唯一不需要連續繼代的中長期 保存方式。玻璃化法超低溫保存是將細胞或組織置于由一定比例的滲透性和非滲透性保護 劑組成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足夠快的降溫速率下固化成非結晶的玻 璃化態，并以這種玻璃態在低溫下保存。玻璃化法因操作簡單快捷，成本低，適宜保存種類 廣泛，保存材料遺傳性穩定，保存效果好等優點，是近十年來用于優良種質資源中長期保存 的首選方法。
[0003] 百合是百合科百合屬的草本植物，為世界著名的球根花卉，具有花色豐富、姿態優 美的特色。百合被廣泛運用在園林布景、切花、鮮花和盆栽觀賞等方面。中國作為百合分布 中心，種質資源豐富，但多數野生種仍屬于瀕危植物。百合作為多年生球莖草本，不能通過 低溫種子庫進行保存，目前主要的保存方式為田間種植保存，易在保存過程中出現褐變、腐 爛，百合的中長期保存問題亟待解決。
[0004] 國外關于百合的超低溫研究開始于上世紀90年代，利用百合莖尖為外植體，通過 超低溫保存的成活率僅為8. 45%，隨著對超低溫體系的不斷改進，在玻璃化溶液PVS2出現 后，成活率顯著提升，開始被應用于不同類型的材料。國內的相關研究起步較晚，已初步摸 索出百合超低溫保存各關鍵步驟的保存條件，豐富了百合超低溫保存體系。但關于百合胚 性愈傷組織作為材料進行超低溫保存的研究還很少，還未建立百合胚性愈傷組織的超低溫 保存體系。因此建立百合胚性愈傷組織超低溫保存體系并加以優化，提高百合胚性愈傷組 織凍后存活率，對百合的研究與產業發展具有很重要的作用。
【發明內容】
[0005] 鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種新的提高百合胚性愈 傷組織保存效果的方法，以克服現有技術中植物及其組織中長期保存難以實現，以及超低 溫保存的植物或其組織恢復生長率低的缺點。
[0006] 為了實現上述目的或者其他目的，本發明是通過以下技術方案實現的。
[0007] 一種提高百合胚性愈傷組織保存效果的方法，采用玻璃化法超低溫保存的方法對 百合胚性愈傷組織進行保存，具體步驟如下：
[0008] 1)預培養：將百合胚性愈傷組織置于預培養基上，在0?KTC下預培養1?4天；
[0009] 2)裝載液處理：室溫下，將百合胚性愈傷組織在裝載液中浸泡處理40?60分鐘 后移除裝載液；
[0010] 3)玻璃化溶液處理：在0?25°C下使用玻璃化溶液浸泡脫水處理百合胚性愈傷組 織40?60分鐘；
[0011] 4)液氮保存：保持百合胚性愈傷組織在玻璃化溶液中浸泡的狀態，并置于液氮中 保存；
[0012] 所述玻璃化溶液為含有0. 1?0. 5g/L碳納米管的玻璃化冷凍保護液。
[0013] 優選地，所述 MS 培養液含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20,440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/LFeS04 ? 7H20, lOOmg/L肌醇，0? 5mg/L煙酸，0? 5mg/L鹽酸批咳醇，0? lmg/L鹽酸硫胺素，2mg/L甘氨 酸，0.83mg/L KI，6. 2mg/L H3B03,22.3mg/L MnSO4.440,8.61^/1^1^04.71120,0.2511^/1 Na2MoO 4 ? 2H20,0? 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0? 025mg/LCoCl2 ? 6H20,余量為水，所述 MS 培養液的 pH 為 5. 8。
[0014] 優選地，所述預培養的培養基為含有0. 4?0. 8mol/L蔗糖的MS固體培養基。
[0015] 優選地，所述預培養的培養基為含有0. 7mol/L蔗糖的MS固體培養基。
[0016] 本發明中所述 MS 固體培養基含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/ LKH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20,440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/ LFeSO4 ? 7H20, lOOmg/L肌醇，0? 5mg/L煙酸，0? 5mg/L鹽酸批卩多醇，0? lmg/L鹽酸硫胺素， 2mg/L 甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3B03,22.3mg/L MnS04*4H20,8.6mg/L ZnS04*7H20， 0? 25mg/L Na2MoO4 ? 2H20,0? 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0? 025mg/L CoCl2 ? 6H20, 30g/L 蔗糖，IOg/ L瓊脂粉，余量為水。所述MS固體培養基的pH為5. 8。
[0017] 優選地，上述步驟1)中在預培養基上培養的方法為：將百合胚性愈傷組織在4°C 下置于預培養基上1?4天。
[0018] 更優選地，上述步驟1)中在預培養基上培養的方法為：將百合胚性愈傷組織在 4°C下置于預培養基上2天。
[0019] 優選地，所述裝載液為含有1?2mol/L丙三醇、0? 3?0? 5mol/L鹿糖和5? IOmmol/L KNO3 的 MS 培養液。
[0020] 優選地，所述裝載液為含有2mol/L丙三醇、0. 4mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS 培養液。
[0021] 優選地，上述步驟2)中，室溫下，將百合胚性愈傷組織在裝載液中浸泡處理60分 鐘后移除裝載液；
[0022] 優選地，上述步驟3)中，在0°C下使用玻璃化溶液浸泡脫水處理百合胚性愈傷組 織60分鐘。
[0023] 優選地，所述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞 砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 5g/L碳納米管的MS培養液。
[0024] 更優選地，所述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基 亞砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 3g/L碳納米管的MS培養液。
[0025] -種百合胚性愈傷組織的解凍及再培養方法，所述百合胚性愈傷組織為采用如上 述所述方法保存的百合胚性愈傷組織，所述百合胚性愈傷組織的解凍及再培養方法為將百 合胚性愈傷組織從液氮中取出，先水浴解凍，然后去除玻璃化溶液后用洗滌液洗滌，最后轉 入恢復培養基中恢復培養。
[0026] 優選地，水浴解凍的條件為在30?40°C的水浴中解凍60?120s。
[0027] 更優選地，水浴解凍的條件為在40°C的水浴中解凍90s。
[0028] 優選地，所述洗滌液為含有I. 0?I. 5mol/L蔗糖和5?lOmmol/L KNO3的MS培 養液。
[0029] 優選地，所述洗滌液為含有I. 2mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS培養液。洗滌 工藝為：用洗滌液在室溫下將百合胚性愈傷組織浸泡10?30分鐘。
[0030] 洗滌工藝為：用洗滌液在室溫下將百合胚性愈傷組織浸泡30分鐘，每10分鐘更換 一次洗漆液。
[0031] 優選地，所述恢復培養基為含有〇? 1?3. Omg/L毒莠定、0? 1?2. Omg/L 6-節基腺 嘌呤和30g/L蔗糖的MS培養基。
[0032] 優選地，所述恢復培養基為含有0. 5mg/L毒莠定、0. 5mg/L 6-芐基腺嘌呤和30g/L 蔗糖的MS培養基。
[0033] 更優選地，室溫下，將百合胚性愈傷組織在裝載液中浸泡處理60分鐘后移除裝載 液。
[0034] 更優選地，在0°C下使用玻璃化溶液浸泡處理百合胚性愈傷組織60分鐘。
[0035] 本發明中公開的方法中適合應用于現有技術中所有的百合胚性愈傷組織。
[0036] 優選地，百合胚性愈傷組織的制備方法參考文獻：Somatic embryogenesis and plant regeneration in Lilium longiflorum Thunb (A.Tribulato, P. C. Remotti, H. J. M. Loffler, Plant Cell Report, 1997)〇
[0037] 更優選地，所述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基 亞砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 3g/L碳納米管的MS培養液。
[0038] 更優選地，為了證明本發明中方法的保存效果，采用相對成活率來統計，具體地， 在恢復培養30天后利用氯化三苯四氮唑（縮寫為TTC)法統計百合胚性愈傷組織相對成活 率，并輔以熒光素二乙酸酯（縮寫為FDA)染色法觀察。
[0039] 根據納米科學原理，向冷凍保護劑中添加納米材料能夠有效提高冷凍保護劑的粘 度和熱導率，改變冰晶的形成狀況、減少對細胞的傷害。本發明對百合胚性愈傷組織在玻璃 化超低溫條件下保存，先進行預培養，然后依次用裝載液、玻璃化溶液處理，最后在液氮中 超低溫保存，其中玻璃化溶液又為添加了碳納米管的玻璃化溶液，這種外源物質的添加配 合方法中的其他工藝，能夠有效的提高百合胚性愈傷組織的保存效果。按照本發明公開的 保存方法，采用濃度為〇. 1?〇. 5g/L的碳納米管作為外源物質使用時，百合胚性愈傷組織 玻璃化超低溫保存后的恢復生長率顯著提高，本發明中公開的方法對百合胚性愈傷組織的 保存效果優化顯著，通過添加碳納米管作為外源物質對植物玻璃化超低溫保存起到促進作 用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040] 圖1為實驗組和對照組中百合胚性愈傷組織超低溫保存恢復生長的FDA染色照 片。FDA能夠進入活細胞原生質體內產生熒光，可以作為判斷細胞死活的標志。
[0041] 圖1中從左到右分別為對照組超低溫保存后的百合胚性愈傷組織、實驗組組1中 超低溫保存后的百合胚性愈傷組織、實驗組組2中超低溫保存后的百合胚性愈傷組織、實 驗組組3中超低溫保存后的百合胚性愈傷組織。如圖1所示，亮度越大表示熒光強度越強， 細胞活力越高。
【具體實施方式】
[0042] 以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書 所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實 施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離 本發明的精神下進行各種修飾或改變。
[0043] 本發明實施例中所用的百合胚性愈傷組織參照Somatic embryogenesis and plant regeneration in Lilium longiflorum Thunb (A.Tribulato, P. C. Remotti, H. J.M.Loffler, Plant Cell Report, 1997)中記載方法，獲得百合胚性愈傷組織。
[0044] 本發明實施例中實驗試劑的配方如下：
[0045] I) MS 培養液為：MS 培養液含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20,440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/L FeSO4 ? 7H20， lOOmg/L肌醇，0? 5mg/L煙酸，0? 5mg/L鹽酸批咳醇，0? lmg/L鹽酸硫胺素，2mg/L甘氨 酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3B03,22.3mg/L MnSO4 ?fflWJ.emg/L ZnSO4 .71120,0.2511^/ LNa2MoO4 ? 2H20,0? 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0? 025mg/L CoCl2 ? 6H20,余量為水，所述 MS 培養液 的pH為5. 8。
[0046] 2)MS 固體培養基為：MS 固體培養基含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3, 170mg/LKH2P04,370mg/L MgSO4 ? 7H20,440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/L FeSO4 *7H20, lOOmg/L 肌醇，0. 5mg/L 煙酸，0. 5mg/L 鹽酸批咳醇，0. lmg/L 鹽酸硫胺素，2mg/L 甘氨酸，〇.83mg/L KI，6.2mg/L H3B03,22.3mg/L MnSO4 .440,8. 6mg/L ZnSO4 *71120,0.2511^/ L Na2MoO4 ? 2H20,0. 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0. 025mg/L CoCl2 ? 6H20,30g/L 蔗糖，lOg/L 瓊脂 粉，余量為水，所述MS固體培養基的pH為5. 8。
[0047] 3)預培養基為含有0. 7mol/L蔗糖的MS培養基。
[0048] 4)裝載液為：含有2mol/L丙三醇、0. 4mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS培養液。
[0049] 5)玻璃化溶液為：含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞砜、 0. 4mol/L蔗糖和0. lg/L碳納米管的MS培養液。
[0050] 6)洗滌液為含有I. 2mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS培養液。
[0051] 7)恢復培養基為含有I. 5mg/L毒莠定、0. 5mg/L 6-芐基腺嘌呤和30g/L蔗糖的MS 培養基。
[0052] 實施例
[0053] 1)將繼代培養20天的百合胚性愈傷組織在含有0. 7mol/L蔗糖的MS固體培養基 上在4°C下低溫預培養2天；
[0054] 2)轉至裝載液中室溫浸泡處理60分鐘；
[0055] 3)轉入玻璃化溶液中在0°C條件下脫水處理60分鐘；
[0056] 4)最后置于液氮中超低溫保存。
[0057] 步驟3)結束后，無需除去玻璃化溶液，直接將浸泡于玻璃化溶液中的百合胚性愈 傷組織置于液氮中超低溫保存。
[0058] 按照上述步驟將百合胚性愈傷組織分為實驗組和對照組。
[0059] 實驗組的玻璃化溶液中分別含有0. Ig/L、0. 3g/L、0. 5g/L的碳納米管。
[0060] 實驗組組1的玻璃化溶液中含有0. lg/L的碳納米管；實驗組組2的玻璃化溶液中 含有0. 3g/L的碳納米管；實驗組組3的玻璃化溶液中含有0. 5g/L的碳納米管；
[0061] 對照組中不同之處在于玻璃化溶液不含有碳納米管，其他與實驗組相同。
[0062] 在液氮中保存Ih后，取出，快速放入40°C水浴鍋中，解凍90s，并不時輕輕搖動；將 玻璃化溶液吸除，加入洗滌液，室溫處理30min，每隔IOmin換一次洗滌液；洗滌后的百合胚 性愈傷組織移到恢復培養基培養30天后，計算并比較實驗組和對照組內百合胚性愈傷組 織的相對成活率。
[0063] 實驗組與對照組的百合胚性愈傷組織的相對成活率見表1。
[0064]表 1
【權利要求】
1. 一種提高百合胚性愈傷組織保存效果的方法，其特征在于，采用玻璃化法超低溫保 存的方法對百合胚性愈傷組織進行保存，具體步驟如下： 1) 預培養：將百合胚性愈傷組織置于預培養基上，在〇?10°C下預培養1?4天； 2) 裝載液處理：室溫下，將百合胚性愈傷組織在裝載液中浸泡處理40?60分鐘后移 除裝載液； 3) 玻璃化溶液處理：在0?25°C下使用玻璃化溶液浸泡脫水處理百合胚性愈傷組織 40?60分鐘； 4) 液氮保存：保持百合胚性愈傷組織在玻璃化溶液中浸泡的狀態，并置于液氮中保 存； 所述玻璃化溶液為含有〇. 1?〇. 5g/L碳納米管的玻璃化冷凍保護液。
2. 如權利要求1所述提高百合胚性愈傷組織保存效果的方法，其特征在于，所述百合 胚性愈傷組織預培養基為含有〇. 4?0. 8mol/L蔗糖的MS固體培養基。
3. 如權利要求1所述提高百合胚性愈傷組織保存效果的方法，其特征在于，所述裝載 液為含有1?2mol/L丙三醇、0. 3?0. 5mol/L蔗糖和5?10mmol/L ΚΝ03的MS培養液。
4. 如權利要求1所述提高百合胚性愈傷組織保存效果的方法，其特征在于，所述玻璃 化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 1? 0. 5g/L碳納米管的MS培養液。
5. -種百合胚性愈傷組織的解凍及再培養方法，所述百合胚性愈傷組織為采用如權利 要求1?4任一權利要求所述方法保存的百合胚性愈傷組織，所述百合胚性愈傷組織的解 凍及再培養方法為將百合胚性愈傷組織從液氮中取出，先水浴解凍，然后去除玻璃化溶液 后用洗滌液洗滌，最后轉入恢復培養基中恢復培養。
6. 如權利要求5所述解凍及再培養方法，其特征在于，水浴解凍的條件為在30?40°C 的水浴中解凍60?120s。
7. 如權利要求5所述解凍及再培養方法，其特征在于，所述洗滌液為含有1. 0? 1. 5mol/L蔗糖和5?10mm〇l/L ΚΝ03的MS培養液洗漆，洗滌工藝為：用洗滌液在室溫下將 百合胚性愈傷組織浸泡10?30分鐘。
8. 如權利要求5所述解凍及再培養方法，其特征在于，所述恢復培養基為含有0. 1? 3. Omg/L毒莠定、0. 1?2mg/L 6-芐基腺嘌呤和30g/L蔗糖的MS培養基。
【文檔編號】A01N3/00GK104255711SQ201410468249
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月15日 優先權日:2014年9月15日
【發明者】申曉輝, 陳冠群, 任麗, 張荻 申請人:上海交通大學