同源四倍體七葉一枝花植株的培育方法
【專利摘要】本發明公開了一種同源四倍體七葉一枝花植株的培育方法，可以克服七葉一枝花在自然繁殖和人工種植中出現的品種退化問題，步驟如下：(1)繁育組培苗；(2)秋水仙素處理：用以下兩種方法之一處理：①在無菌條件下，選取組培繼代苗，在莖部造成若干創傷，然后用脫脂棉包裹嚴密，再在脫脂棉上滴入秋水仙素溶液浸潤，在分化培養基上培養，用無菌水洗凈，切成單芽后轉接到叢生芽誘導培養基中；②將組培苗轉接至添加秋水仙素的分化培養基中，培養后，切成單芽轉接至叢生芽誘導培養基中；(3)植株分化培養；(4)植株增殖培養；(5)植株染色體檢測；(6)選育同源四倍體植株。本發明的方法，對于擴大特有珍稀藥用植物種植面積有重要意義。
【專利說明】同源四倍體七葉一枝花植株的培育方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及同源四倍體七葉一枝花植株的培育方法，屬于藥用植物育種領域。
【背景技術】
[0002]七葉一枝花為百合科重樓屬多年生草本植物，野生環境下生于海拔1800?3200米的林下，山坡林下蔭處或溝邊的陰濕處，分布于我國云南、四川、貴州、廣東、廣西、江西、福建等省。以干燥根莖入藥，中藥名為重樓、七葉蓮、燈臺七等。根莖含多種留體皂苷、生物堿和氨基酸。中醫認為，其性味苦微寒，有清熱解毒、消腫止痛、息風定驚、平喘止咳等功效，常用來治療流行性乙型腦炎，胃痛，闌尾炎，淋巴結結核，扁桃體炎，腮腺炎，乳腺炎，跌打損傷、蛇蟲咬傷、淋巴結核、骨髓炎等，是云南白藥的主要成分之一。由于該藥藥用價值高，民間采挖嚴重，野生資源已日益枯竭。雖然近幾年來已開展人工種植，但由于引種的野生品種存在生長緩慢，生長周期長，藥材產量低，短時間內還難以滿足市場醫用需求，因此培育出七葉一枝花性狀優良的新品種，才能從根本上解決市場藥材短缺的問題，也是保證七葉一枝花藥材種植業持續健康發展的重要措施。
[0003]誘導植物多倍體的形成，是加大植物遺傳變異，改良植物品性的重要手段。多倍體藥用植物一般具有根、莖、葉和花果的巨型性，抗逆性強，藥用成分含量高等特性。這正是藥材優質、高產育種所期望達到的目標。因此培育七葉一枝花同源四倍體新品種，可以解決藥材品種性狀改良的問題，同時從根本上解決目前藥材產量低、市場需求量短缺的問題。
[0004]單倍體是指體細胞中含有本物種配子染色體數的生物個體。而一倍體是指體細胞含一個染色體組的個體。絕大多數生物為二倍體生物，其單倍體的體細胞中含一個染色體組，如果原物種本身為多倍體，那么它的單倍體的體細胞中含有的染色體組數一定多于一個。如四倍體水稻的單倍體含兩個染色體組，六倍體小麥的單倍體含三個染色體組。多倍體就是指體細胞中含有三個以上染色體組的生物個體。同源多倍體是由原來的染色體組加倍形成的多倍體。鑒于此，在進行同源四倍體七葉一枝花植株的培育過程中，就要確實保證細胞內的染色體數呈整數加倍，而不是單單指染色體數的簡單增多，否則得到的多倍體只是雜合體(染色體數不規律增加)或嵌合體(含有不同倍性的各種細胞)，而且此類多倍體在繼代增殖過程中往往會發生回復突變，且性狀不穩定。為了得到純合同源四倍體七葉一枝花植株，本發明在四倍體植株誘導條件等方面做了細化和改進，并成功實現組培四倍體植株的溫室移栽，通過大量實驗摸索出了一套培育純合同源四倍體七葉一枝花植株的方法。
【發明內容】
[0005]針對上述現有技術，本發明提供了一種同源四倍體七葉一枝花植株的培育方法。通過此方法可快速實現同源四倍體七葉一枝花植株的培育，進而有效提高其活性成分的含量，克服七葉一枝花在自然繁殖和人工種植中出現的品種退化問題。
[0006]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0007]同源四倍體七葉一枝花植株的培育方法，步驟如下:
[0008](I)繁育組培苗:取性狀優良的七葉一枝花植株的葉芽，通過植物組織培養技術，繁育出組培苗(該步所涉及的技術為常規技術)；
[0009](2)秋水仙素處理:用以下兩種方法之一處理:
[0010]①在無菌條件下，選取生長勢強的組培繼代苗，在莖部造成若干(2?5個)創傷(所述創傷是指用器械輕輕劃傷)，然后用脫脂棉包裹嚴密，再在脫脂棉上滴入質量濃度為
0.03%?0.05%的秋水仙素溶液浸潤，在分化培養基上培養10?15天后,用無菌水洗凈，切成單芽后轉接到叢生芽誘導培養基中；
[0011]②將組培苗轉接至添加質量濃度為0.05%?1.0 %的秋水仙素的分化培養基中，培養20?30天后，切成單芽轉接至叢生芽誘導培養基中；
[0012]所述分化培養基的組份組成為:MS+BA 0.5?0.8mg/L+GA3 0.1?0.5mg/L+NAA
0.1?0.3mg/L+CTK (細胞分裂素)0.3?0.5mg/L ( S卩:向MS培養基中加入終濃度為0.5?
0.8mg/L 的 BA、0.1 ?0.5mg/L 的 GA3'0.1 ?0.3mg/L 的 NAA 以及 0.3 ?0.5mg/L 的 CTK 而成；該表述方式為所屬領域技術人員慣用的表述方式；下同；所述MS培養基為現有技術中常用的培養基)；
[0013]所述在分化培養基中培養的培養條件為:溫度25?30°C，每天日照8?12h，光照強度 60 μ mol.m 2.s 1 ;
[0014]所述叢生芽誘導培養基的組分組成為:MS+BA L 5?2.0mg/L+GA3 0.1?0.5mg/L+NAA0.1 ?0.5mg/L+ 鹿糖 20 ?30g/L ；
[0015](3)誘導植株分化培養:在叢生芽誘導培養基中培養25?35天,誘導產生叢生芽，培養條件為:溫度20?30°C，每天日照8?12h，光照強度120 μ mol.πΓ2.s—1 ；
[0016](4)誘導植株增殖培養:將上述長出的叢生芽轉接入增殖培養基中，在溫度20?30°C,每天日照8?12h,光照強度120 μ mol.πΓ2.s_1的條件下,培養25?35天,將叢生芽分株培養成完整植株；
[0017]所述增殖培養基的組分組成為:MS+BA 2.0?3.0mg/L+NAA 0.2?0.5mg/L+蔗糖20 ?30g/L ；
[0018](5)誘導植株染色體檢測:切取步驟(4)中得到的完整植株，在解剖鏡下剝離莖尖，經過壓片染色，在顯微鏡下進行染色體數目檢測；
[0019](6)選育同源四倍體植株:通過染色體數目檢測，篩選出四倍體植株，轉接至生根培養基中，在溫度25?30°C，每天日照8?12h，光照強度120 μ mol.πΓ2.s—1的條件下，培養25?35天，即培育出同源四倍體完整植株；
[0020]所述生根培養基的組份組成為:1/2MS+NAA 0.1?0.3mg/L+蔗糖20?30g/L(1/2MS是指基礎培養基中各物質的濃度為MS培養基的一半)。
[0021]本發明的同源四倍體七葉一枝花植株的培育方法，選用優良植株的葉芽通過組織培養技術繁育成組培苗，保證了種質來源，在無菌條件下，用秋水仙素對組培苗進行處理，誘導成功率高，同時室內操作不受季節限制，可快速繁殖變異植株，同時有效縮短育種的時間。
[0022]根據秋水仙素誘導多倍體的作用原理，秋水仙素對植物的誘導作用只發生在細胞分裂期，而對于那些處于靜止狀態的細胞沒有作用，需處理的植物組織應該是分裂活躍、旺盛的部位，通常是用萌動的或剛發芽的種子、正在膨大的芽、根尖、幼苗、嫩枝生長點及花蕾等。本申請的課題組前期嘗試過浸種法、涂抹法等途徑處理七葉一枝花種子和種子苗，但效果均不理想，也未獲得純合四倍體。本實驗中，用附加秋水仙素的培養基萌發七葉一枝花種子，容易得到變異苗，但是多為畸形苗，后期存活率低，同時這種新萌發的苗較為脆弱，對秋水仙素的毒害作用敏感。實驗過程中發現，處理生長一段時間后的無菌苗獲得多倍體的效果更好，再生植株形態差異顯著，這可能是由于苗正處于生長旺盛階段，相同時間內處于分裂期的細胞數量多于種子，用相同濃度的秋水仙素處理，可以使更多的細胞獲得加倍的機會。說明采用秋水仙素處理七葉一枝花無菌苗獲得多倍體植株是可行的。
[0023]本發明結合七葉一枝花無菌苗快速誘導叢生芽與增殖技術，利用秋水仙素處理使再生植株染色體加倍，誘導產生四倍體七葉一枝花植株，可以克服七葉一枝花在自然繁殖和人工種植中出現的品種退化問題，對于擴大特有珍稀藥用植物種植面積，提高七葉一枝花種植收入，滿足市場需求以及推廣常用中藥開發利用有重要意義。
【具體實施方式】
[0024]下面結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例中未詳盡描述的試劑、方法均為現有技術中已有的常規試劑、方法。
[0025]實施例1同源四倍體七葉一枝花植株的培育方法
[0026]步驟如下:
[0027](I)繁育組培苗:取七葉一枝花植株的葉芽，通過植物組織培養技術，繁育出組培苗；
[0028](2)秋水仙素處理:在無菌條件下，選取生長勢強的組培繼代苗，在莖部造成若干(2?5個)創傷，然后用脫脂棉包裹嚴密，再在脫脂棉上滴入質量濃度為0.05%的秋水仙素溶液浸潤，在分化培養基上培養12天后，用無菌水洗凈，切成單芽后轉接到叢生芽誘導培養基中；
[0029]所述分化培養基的組份組成為:MS+BA0.6mg/L+GA3 0.3mg/L+NAA 0.2mg/L+CTK0.4mg/L ；
[0030]所述在分化培養基中培養的培養條件為:溫度28°C，每天日照10h，光照強度60 μ mol.m 2.s 1 ；
[0031]所述叢生芽誘導培養基的組分組成為:MS+BA 1.8mg/L+GA3 0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+ 鹿糖 25g/L ；
[0032](3)誘導植株分化培養:在叢生芽誘導培養基中培養30天，誘導產生叢生芽，培養條件為:溫度28°C,每天日照1h,光照強度120 μ mol.πΓ2.s_1 ；
[0033](4)誘導植株增殖培養:將上述長出的叢生芽轉接入增殖培養基中，在溫度28°C，每天日照10h，光照強度120μπιΟ1.πΓ2.S-1的條件下，培養30天，將叢生芽分株培養成完整植株；
[0034]所述增殖培養基的組分組成為:MS+BA 2.5mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖25g/L ；
[0035](5)誘導植株染色體檢測:切取步驟(4)中得到的完整植株，在解剖鏡下剝離莖尖，經過壓片染色，在顯微鏡下進行染色體數目檢測；結果:得到完整植株197株，四倍體植株94株，誘導率為47.7% (誘導率=多倍體數/增殖的芽數)；
[0036](6)選育同源四倍體植株:通過染色體數目檢測，篩選出四倍體植株，轉接至生根培養基中，在溫度28°C，每天日照10h，光照強度120 μ mo I.πΓ2.s—1的條件下，培養30天，培育出同源四倍體完整植株，經統計，共培育出77株同源四倍體完整植株，成活率81.9% ；
[0037]所述生根培養基的組份組成為:1/2MS+NAA 0.2mg/L+蔗糖25g/L。
[0038]實施例2同源四倍體七葉一枝花植株的培育方法
[0039]步驟如下:(I)繁育組培苗:取七葉一枝花植株的葉芽，通過植物組織培養技術，繁育出組培苗；
[0040](2)秋水仙素處理:將組培苗轉接至添加質量濃度為0.08%的秋水仙素的分化培養基中，培養25天后，切成單芽轉接至叢生芽誘導培養基中；
[0041 ]所述分化培養基的組份組成為:MS+BA 0.6mg/L+GA3 0.3mg/L+NAA 0.2mg/L+CTK0.4mg/L ；
[0042]所述在分化培養基中培養的培養條件為:溫度28°C，每天日照10h，光照強度60 μ mol.m 2.s 1 ；
[0043]所述叢生芽誘導培養基的組分組成為:MS+BA 1.8mg/L+GA3 0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+ 鹿糖 25g/L ；
[0044](3)誘導植株分化培養:在叢生芽誘導培養基中培養30天，誘導產生叢生芽，培養條件為:溫度28°C,每天日照1h,光照強度120 μ mol.πΓ2.s_1 ；
[0045](4)誘導植株增殖培養:將上述長出的叢生芽轉接入增殖培養基中，在溫度28°C，每天日照10h，光照強度120μπιΟ1.πΓ2.S-1的條件下，培養30天，將叢生芽分株培養成完整植株；
[0046]所述增殖培養基的組分組成為:MS+BA 2.5mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖25g/L ；
[0047](5)誘導植株染色體檢測:切取步驟(4)中得到的完整植株，在解剖鏡下剝離莖尖，經過壓片染色，在顯微鏡下進行染色體數目檢測；結果:得到完整植株205株，四倍體植株107株，誘導率為52.2% (誘導率=多倍體數/增殖的芽數)；
[0048](6)選育同源四倍體植株:通過染色體數目檢測，篩選出四倍體植株，轉接至生根培養基中，在溫度28°C，每天日照10h，光照強度120 μ mol.πΓ2.s—1的條件下，培養30天，培育出同源四倍體完整植株，經統計，共培育出92株同源四倍體完整植株，成活率86.0% ;
[0049]所述生根培養基的組份組成為:1/2MS+NAA 0.2mg/L+蔗糖25g/L。
【權利要求】
1.一種同源四倍體七葉一枝花植株的培育方法，其特征在于:步驟如下: (1)繁育組培苗:取七葉一枝花植株的葉芽，通過植物組織培養技術，繁育出組培苗； (2)秋水仙素處理:用以下兩種方法之一處理: ①在無菌條件下，選取組培繼代苗，在莖部造成若干創傷，然后用脫脂棉包裹嚴密，再在脫脂棉上滴入質量濃度為0.03%?0.05%的秋水仙素溶液浸潤，在分化培養基上培養10?15天后，用無菌水洗凈，切成單芽后轉接到叢生芽誘導培養基中； ②將組培苗轉接至添加質量濃度為0.05%?1.0 %的秋水仙素的分化培養基中，培養20?30天后，切成單芽轉接至叢生芽誘導培養基中； 所述分化培養基的組份組成為:MS+BA 0.5?0.8mg/L+GA3 0.1?0.5mg/L+NAA 0.1?0.3mg/L+CTK 0.3 ?0.5mg/L ； 所述在分化培養基中培養的培養條件為:溫度25?30°C，每天日照8?12h，光照強度60 μ mol.m 2.s 1 ； 所述叢生芽誘導培養基的組分組成為:MS+BA 1.5?2.0mg/L+GA3 0.1?0.5mg/L+NAA0.1 ?0.5mg/L+ 鹿糖 20 ?30g/L ； (3)誘導植株分化培養:在叢生芽誘導培養基中培養25?35天，誘導產生叢生芽，培養條件為:溫度20?30°C,每天日照8?12h,光照強度120 μ mol.πΓ2.s_1 ； (4)誘導植株增殖培養:將上述長出的叢生芽轉接入增殖培養基中，在溫度20?30°C，每天日照8?12h，光照強度120 μ mol.πΓ2.s—1的條件下，培養25?35天，將叢生芽分株培養成完整植株； 所述增殖培養基的組分組成為:MS+BA 2.0?3.0mg/L+NAA 0.2?0.5mg/L+蔗糖20?30g/L ； (5)誘導植株染色體檢測:切取步驟(4)中得到的完整植株，在解剖鏡下剝離莖尖，經過壓片染色，在顯微鏡下進行染色體數目檢測； (6)選育同源四倍體植株:通過染色體數目檢測，篩選出四倍體植株，轉接至生根培養基中，在溫度25?30°C，每天日照8?12h，光照強度120μπιΟ1.πΓ2.s—1的條件下，培養25?35天，即培育出同源四倍體完整植株； 所述生根培養基的組份組成為:1/2MS+NAA 0.1?0.3mg/L+蔗糖20?30g/L。
2.根據權利要求1所述的同源四倍體七葉一枝花植株的培育方法，其特征在于:所述分化培養基的組份組成為:MS+BA 0.6mg/L+GA3 0.3mg/L+NAA 0.2mg/L+CTK 0.4mg/L。
3.根據權利要求1所述的同源四倍體七葉一枝花植株的培育方法，其特征在于:所述叢生芽誘導培養基的組分組成為:MS+BA 1.8mg/L+GA3 0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖25g/L。
4.根據權利要求1所述的同源四倍體七葉一枝花植株的培育方法，其特征在于:所述增殖培養基的組分組成為:MS+BA 2.5mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖25g/L。
5.根據權利要求1所述的同源四倍體七葉一枝花植株的培育方法，其特征在于:所述生根培養基的組份組成為:1/2MS+NAA 0.2mg/L+蔗糖25g/L。
【文檔編號】A01H4/00GK104160962SQ201410445856
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年9月3日 優先權日:2014年9月3日
【發明者】王曉娟 申請人:無錫中農科生物育種技術研究院有限公司