紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導的方法
【專利摘要】本發明公開了一種紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導的方法。本發明利用植物細胞的全能性和植物組織培養技術，以苗齡為20-30d的紅腺忍冬無菌組培苗的葉柄作為外植體，經過增加傷口處理后，置于愈傷組織誘導培養基中，在適宜的條件下培養，使其脫分化成愈傷組織，進而在愈傷組織生根誘導培養基中培養，將此愈傷組織誘導出不定根，誘導率達62.50％。本發明簡單方便，在短期內能夠快速有效地將紅腺葉柄誘導出愈傷組織，并將此愈傷組織誘導出不定根，為紅腺忍冬優良種質保存、快速繁育及在研究、生產中的應用提供了新的技術參考。
【專利說明】紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物組織培養領域，具體涉及一種紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導的方法。
【背景技術】
[0002]紅腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq.),為忍冬科忍冬屬(Lonicera)植物，屬多年生半纏繞藤本或者藤狀灌木，又名盤腺忍冬、菰腺忍冬、腺背金銀花等，莖中空，主要產于河南、廣西、山東、云南等地。按照2005年版《中國藥典》的規定，紅腺忍冬Lonicerahypoglauca Miq.與灰租毛忍冬 Lonicera nuwranthoides Hand.Mazz.和華南忍冬Lonicera confuse DC.為山銀花(我國名貴中藥材之一)的三種來源。其社會需求量大，產需供求缺口大，其藥用價值和保健作用足以推動山銀花的種植、加工、銷售等行業的發展及臨床應用研究。
[0003]目前關于山銀花組織培養的報道較少，關于紅腺忍冬組織培養研究的報道不多，而對于紅腺忍冬組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導的研究尚未有報道。
【發明內容】
[0004]本發明設計開發了一種紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導方法。本發明利用植物細胞的全能性和植物組織培養技術，以苗齡為20-30d的紅腺忍冬無菌組培苗的葉柄作為外植體，經過增加傷口處理后，置于愈傷組織誘導培養基中，在適宜的條件下培養，使其脫分化成愈傷組織，進而在愈傷組織生根誘導培養基中培養，將此愈傷組織誘導出不定根，誘導率達62.50%。本發明簡單方便，在短期內能夠快速有效地將紅腺葉柄誘導出愈傷組織，并將此愈傷組織誘導出不定根，為紅腺忍冬優良種質保存、快速繁育及在研究、生產中的應用提供了新的技術參考。
[0005]本發明提供的技術方案為:
[0006]紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導方法，包括:
[0007]I)材料準備:將紅腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.無菌組培苗接種到壯苗培養基中壯苗，得到苗齡為20-30d的無菌組培苗；
[0008]2)材料取樣:取苗齡為20-30d的紅腺忍冬無菌組培苗的帶有1/4葉片的葉柄待用；
[0009]3)愈傷組織不定根的誘導:將選定待用的帶有1/4葉片的葉柄進行增加傷口處理后接種于愈傷組織誘導培養基中培養，誘導出葉柄愈傷組織；再將此葉柄愈傷組織轉接至愈傷組織不定根誘導培養基中，進而誘導出不定根，其中愈傷組織培養與不定根誘導培養的培養溫度為(25±3)°C，相對濕度為50-75%，光照為12h/d，光照強度為2000_3000Lux ；
[0010]優選的是，所述的紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導方法中，所述第I)步，所述的壯苗培養基為每升1/2MS培養基中加入α -萘乙酸(a -NAA)0.2mg所形成的培養基，其中所述的1/2MS培養基是國際通用的MS培養基中大量元素減半，其他成分不變而形成的培養基。
[0011]優選的是，所述的紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導方法中，所述第
3)步，所述的進一步處理是指用滅過菌的手術剪刀在待用的帶有1/4葉片的葉柄上沿著葉柄上凹陷線剪開以增加傷口面積。
[0012]優選的是，所述的紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導方法中，所述第3)步，所述的愈傷組織誘導培養基為每升培養基中含有6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)0.0-2.5mg，2，4- 二氯苯基氧乙酸(2，4_D)0.0-2.5mg、呋喃氨基嘌呤(KT) 0.1-1.0mg, α-萘乙酸(α-ΝΑΑ) 0.0-1.0mg，其余成分為 MS 培養基。
[0013]優選的是，所述的紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導方法中，所述第3)步，所述的愈傷組織生根誘導培養基為每升培養基中含有6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) 0.5-2.5mg、呋喃氨基嘌呤(KT) 0.5-2.5mg、α -萘乙酸(α -NAA) 0.1-1.0mg，其余成分為MS培養基。
[0014]優選的是，所述的紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導的方法中，所述愈傷組織培養與不定根誘導培養均是在培養室的培養架上光照培養。
[0015]本發明的有益效果在于:
[0016]本發明能利用苗齡為20-30d的紅腺忍冬無菌組培苗的葉柄作為外植體誘導愈傷組織，進而促進愈傷組織分化出根，從葉柄愈傷組織誘導到愈傷組織不定根誘導過程只需50天，可以在短期內使紅腺忍冬無菌試管苗的葉柄脫分化成愈傷組織，并誘導此愈傷組織生根，為紅腺忍冬種質資源的保存和藥材的來源提供新的參考途徑，為更進一步利用該物種提供了技術參考。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1紅腺忍冬葉柄愈傷組織誘導效果圖
[0018]圖2紅腺忍冬葉柄愈傷組織生根誘導效果圖
【具體實施方式】
[0019]下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
[0020]實施例1
[0021]以本課題組培育的苗齡為20-30d的紅腺忍冬無菌組培苗的葉柄作為外植體，在超凈工作臺上剪取附帶有1/4葉片的葉柄，并沿此葉柄上的凹陷線剪開以增加傷口面積。之后將此經過處理的葉柄轉接入愈傷組織誘導培養基中，置于培養室的培養架上光照培養，培養10天即可長出米白色愈傷組織；待此愈傷組織生長健壯之后(一個月)(圖1A)，將其轉接入愈傷組織根誘導培養基中培養，培養20天之后即可長出不定根。愈傷組織與愈傷組織不定根誘導的培養條件為:培養溫度:(25±3) °C，相對濕度:50-75%，光照12h/d，光照強度2000-3000Lux;培養30天之后(圖2A)，根據公式:不定根誘導率(％)=(誘導出不定根的葉柄愈傷組織總個數/接種的葉柄愈傷組織總個數)X 100%，計算出不定根誘導率達62.50%。
[0022]所述的愈傷組織誘導培養基為每升培養基中含有2，4_ 二氯苯基氧乙酸(2，4-D) 2.0mg、呋喃氨基嘌呤(KT)0.5mg，其余成分為MS培養基；所述的愈傷組織根誘導培養為每升培養基中含有含有6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) 2.0mg、呋喃氨基嘌呤(KT) 2.0mg, α -萘乙酸(α -ΝΑΑ) 0.5mg,其余成分為MS培養基。
[0023]實施例2
[0024]以本課題組培育的苗齡為20-30d的紅腺忍冬無菌組培苗的葉柄作為外植體，在超凈工作臺上剪取附帶有1/4葉片的葉柄，并沿此葉柄上的凹陷線剪開以增加傷口面積。之后將此經過處理的葉柄轉接入愈傷組織誘導培養基中，置于培養室的培養架上光照培養，培養10天即可長出米白色愈傷組織；待此愈傷組織生長健壯之后(一個月)(圖1B)，將之轉接入愈傷組織根誘導培養基中培養，培養20天之后即可長出健壯的根，其中愈傷組織與愈傷組織不定根誘導的培養條件為:培養溫度:(25±3) °C，相對濕度:50-75%，光照12h/d，光照強度2000-3000Lux ;培養30天之后(圖2B)，根據實施例1中所示不定根誘導率計算公式計算出愈傷組織不定根誘導率為14.29%。
[0025]所述的愈傷組織誘導培養基為每升培養基中含有2，4_ 二氯苯基氧乙酸(2，4-D) 2.0mg、呋喃氨基嘌呤(KT)0.5mg, α -萘乙酸(α-ΝΑΑ)Ο.2mg，其余成分為MS培養基；所述的愈傷組織根誘導培養為每升培養基中含有6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) 2.0mg、呋喃氨基嘌呤(KT) 2.0mg，α -萘乙酸(α -ΝΑΑ) 0.5mg,其余成分為MS培養基。
[0026]實施例3
[0027]以本課題組培育的苗齡為20-30d的紅腺忍冬無菌組培苗的葉柄作為外植體，在超凈工作臺上剪取附帶有1/4葉片的葉柄，并沿此葉柄上的凹陷線剪開以增加傷口面積。之后將此經過處理的葉柄轉接入愈傷組織誘導培養基中，置于培養室的培養架上光照培養，培養10天即可長出淡綠色愈傷組織；待此愈傷組織生長健壯之后(一個月)(圖1C)，將之轉接入根誘導培養基中培養，其中愈傷組織與愈傷組織不定根誘導的培養條件為:培養溫度:(25±3) °C，相對濕度:50-75%，光照12h/d，光照強度2000_3000Lux ;培養30天之后，愈傷組織褐化死亡，根據實施例1中所示不定根誘導率計算公式計算出愈傷根誘導率為O。
[0028]所述的愈傷組織誘導培養基為每升培養基中含有6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) 2.0mg、呋喃氨基嘌呤(KT)0.5mg，其余成分為MS培養基；所述的愈傷組織根誘導培養為每升培養基中含有含有6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)2.0mg、呋喃氨基嘌呤(KT) 2.0mg、α-萘乙酸(α -NAA) 0.5mg,其余成分為MS培養基。
[0029]實施例4
[0030]以本課題組培育的苗齡為20-30d的紅腺忍冬無菌組培苗的葉柄作為外植體，在超凈工作臺上剪取附帶有1/4葉片的葉柄，并沿此葉柄上的凹陷線剪開以增加傷口面積。之后將此經過處理的葉柄轉接入愈傷組織誘導培養基中，置于培養室的培養架上光照培養，培養10天即可長出淡綠色愈傷組織；待此愈傷組織生長健壯之后(一個月)(圖1D)，將之轉接入根誘導培養基中培養，其中愈傷組織與愈傷組織不定根誘導的培養條件為:培養溫度:(25±3)°C，相對濕度:50-75%，光照12h/d，光照強度2000_3000Lux ;培養30天之后，愈傷組織褐化死亡，根據實施例1中所示不定根誘導率計算公式計算出愈傷根誘導率為O。
[0031]所述的愈傷組織誘導培養基為每升培養基中含有6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) 2.0mg、呋喃氨基嘌呤(KT) 0.5mg, α -萘乙酸(α -NAA) 0.2mg,其余成分為MS培養基；所述的根誘導培養為每升培養基中含有含有6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)2.0mg、呋喃氨基嘌呤(KT) 2.0mg,α -萘乙酸(α -ΝΑΑ) 0.5mg,其余成分為MS培養基。
[0032]本發明能利用苗齡為20-30d的紅腺忍冬無菌組培苗的葉柄作為外植體誘導愈傷組織，進而促進愈傷組織分化出根，從葉柄愈傷組織誘導到愈傷組織不定根誘導過程只需50天，當愈傷組織誘導培養基為每升培養基中含有2，4- 二氯苯基氧乙酸(2，4-D) 2.0mg、呋喃氨基嘌呤(KT)0.5mg，其余成分為MS培養基時，可以在短期內使紅腺忍冬無菌組培苗的葉柄脫分化成愈傷組織，利用愈傷組織根誘導培養為每升培養基中含有含有6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) 2.0mg、呋喃氨基嘌呤(KT) 2.0mg, α -萘乙酸(α -ΝΑΑ) 0.5mg,其余成分為MS培養基誘導此愈傷組織生根，培養30天之后根誘導率達62.50 %，其為紅腺忍冬種質資源的保存和藥材的來源提供新的參考途徑，為更進一步利用該物種提供了技術參考。
[0033]盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的圖例。
【權利要求】
1.一種紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)材料準備:將紅腺忍冬Lonicerahypoglauca Miq.無菌組培苗接種到壯苗培養基中壯苗，得到苗齡為20-30d的無菌組培苗； 2)材料取樣:取苗齡為20-30d的紅腺忍冬無菌組培苗的帶有1/4葉片的葉柄待用； 3)愈傷組織不定根的誘導:將選定待用的帶有1/4葉片的葉柄進行增加傷口處理后接種于愈傷組織誘導培養基中培養，誘導出葉柄愈傷組織；再將此葉柄愈傷組織轉接至愈傷組織不定根誘導培養基中，進而誘導出不定根，其中愈傷組織培養與不定根誘導培養的培養溫度為(25±3)°C，相對濕度為50-75%，光照為12h/d，光照強度為2000-3000Lux。
2.根據權利要求1所述的紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導的方法，其特征在于，所述第I)步，所述的壯苗培養基為于每升1/2MS培養基中加入α-萘乙酸0.2mg所形成的培養基，其中所述的1/2MS培養基是國際通用的MS培養基中大量元素減半，其他成分不變而形成的培養基。
3.根據權利要求1所述的紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導的方法，其特征在于，所述第3)步，所述的進行增加傷口處理是指用滅過菌的手術剪刀在待用的帶有1/4葉片的葉柄上沿著葉柄上凹陷線剪開以增加傷口面積。
4.根據權利要求1所述的紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導的方法，其特征在于，所述第3)步，所述的愈傷組織誘導培養基為每升培養基中含有6-芐氨基腺嘌呤0.0-2.5mg, 2,4- 二氯苯基氧乙酸0.0-2.5mg、呋喃氨基嘌呤0.1-1.0mg, α -萘乙酸0.0-1.0mg，其余成分為MS培養基。
5.根據權利要求1所述的紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導的方法，其特征在于，所述第3)步，所述的愈傷組織生根誘導培養基為每升培養基中含有6-芐氨基腺嘌呤0.5-2.5mg、呋喃氨基嘌呤0.5-2.5mg、α -萘乙酸0.1-1.0mg，其余成分為MS培養基。
6.根據權利要求1所述的紅腺忍冬無菌組培苗葉柄愈傷組織不定根誘導的方法，其特征在于，所述愈傷組織的培養與不定根誘導的培養均在培養室的培養架上光照培養。
【文檔編號】A01H4/00GK104170733SQ201410436524
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月29日 優先權日:2014年8月29日
【發明者】繆劍華, 譚木秀, 莫喬程, 蒲祖寧, 師鳳華 申請人:廣西壯族自治區藥用植物園