一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種b232及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種，其分類命名為解淀粉芽孢桿菌植物亞種B232，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為：CGMCCNo.9279，保藏日期為2014年06月09日。所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種主要用于楊樹大斑潰瘍病的生物防治。本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌植物亞種B232對楊樹大斑潰瘍病菌、鐵皮石斛灰霉病等多種病原真菌具有很好的抑制作用，該拮抗細菌對其他植物病害也有很好的防治效果；具有繁殖速度快；能夠人工培養(yǎng)，易于操作，便于生產(chǎn)應用；抗逆能力強等優(yōu)點，培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應用前景。
【專利說明】一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種B232及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物保護領(lǐng)域，尤其涉及一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B232及其在防治楊樹大斑潰瘍病中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著公眾對環(huán)境中化學農(nóng)藥安全性的普遍關(guān)注，促使人們尋求安全有效的植物病 害控制新途徑，利用自然界有益微生物防治植物病害日趨受到重視。它是向被打破了的植 物微生態(tài)系統(tǒng)中引入對植物有益的外源拮抗菌，通過調(diào)節(jié)微生態(tài)環(huán)境促使自然的有益微生 物群體不斷繁殖、生長，并表現(xiàn)出生防活性，從而達到防止植物病害的目的。
[0003] 自然界潛在的微生物資源種類豐富，在微生物農(nóng)藥的產(chǎn)品開發(fā)方面有明顯優(yōu)勢， 因此世界各國都投入大量的人力和財力，研究、開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型微生物農(nóng)藥， 并以此帶動其他高科技產(chǎn)業(yè)的全面發(fā)展。我國也把微生物農(nóng)藥的研制和開發(fā)列為國家重點 科技攻關(guān)和高新技術(shù)發(fā)展計劃，江蘇省政府也把微生物農(nóng)藥創(chuàng)制作為生物農(nóng)業(yè)的一個重要 組成部分。
[0004] 按照Copping和Menn的定義，生物農(nóng)藥（biopesticides)包含了活體微生物（真 菌、細菌和病毒），植物源農(nóng)藥，微生物次生代謝物（抗生素）等，用于防治各種植物昆蟲和 植物病害；微生物農(nóng)藥的獨特優(yōu)點是對人類健康危害相對較小，對環(huán)境較安全，這正是全社 會最關(guān)心的問題之一。因此，進入21世紀以來，各國政府和植物保護工作者更加重視生物 農(nóng)藥的開發(fā)和應用，已成為研究熱點。
[0005] 楊樹大斑潰瘍病由楊瘍殼孢（Dothichiza populea Sacc. et Br.)引起，是楊樹的 一種毀滅性新病害，也是一種世界性的楊樹病害，主要發(fā)生在楊樹的主要枝干，現(xiàn)已列為我 國森林植物檢疫性病害。隨著楊樹育苗和造林面積的增大，在江蘇地區(qū)等地的楊樹林內(nèi)均 有不同程度發(fā)生，并日趨嚴重，但未見到致使大樹死亡的實例。在句容地區(qū)主要危害NL895 楊。
[0006] 從保護生態(tài)環(huán)境安全的角度出發(fā)，研制對人體較為安全的微生物制劑來控制楊樹 病害，符合生物農(nóng)業(yè)發(fā)展。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一目的在于提供一種對楊樹大 斑潰瘍病菌具有拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B232〇
[0008] 本發(fā)明的第二目的在于提供一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B232在防治楊樹大斑潰瘍病中的應用。
[0009] 技術(shù)方案：為了解決上述第一目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種枯草芽孢 桿菌B232,其分類命名為解淀粉芽孢桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC)保藏，保 藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼為 100101，其保藏編號為：CGMCC9279,保藏日期為2014年06月09日。
[0010] 為了解決上述的第二目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：所述的解淀粉芽孢桿菌 植物亞種B232在防治楊樹大斑潰瘍病中的應用。
[0011] 所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種B232在抑制楊樹大斑潰瘍病菌生長中的應用。
[0012] 具體應用為：將枯解淀粉芽孢桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum) B232接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C _35°C下發(fā)酵培養(yǎng)48-72小時，得到的 發(fā)酵液作為防治楊樹大斑潰瘍病菌的菌劑。
[0013] 本發(fā)明中所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：1000mL蒸餾水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g， 氯化鈉 4-5g，pH6.5-7.5。
[0014] 所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種B232在抑制鐵皮石斛灰霉菌生長中的應用。
[0015] 所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種B232在抑制鐵皮石斛白絹病菌生長中的應用。
[0016] 所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種B232在抑制草莓根腐病病菌生長中的應用。
[0017] 所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種B232在抑制小麥赤霉病菌生長中的應用。
[0018] 本發(fā)明中所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum) B232的生理活性特征如下：
[0019] 所述解淀粉芽抱桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B232在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上菌落較大，乳白色，直徑一般4-6mm, 表面隆起，干燥，有皺褶，邊緣較規(guī)則，菌體桿狀，兩端鈍圓，具周生鞭毛，大小 為1. 58-14. 97X0. 46-0. 62μπι，平均5. 6X0. 55μπι ;芽孢兩端生，橢圓形，大小為 1. 01-1. 41X0. 61-0. 75 μ m，平均 1. 14X0. 67 μ m。
[0020] 革蘭氏染色表現(xiàn)為陽性；酪蛋白水解、淀粉水解、明膠液化為陽性，V. P反應可變， 吲哚反應陰性；糖類產(chǎn)酸發(fā)酵。
[0021] 解淀粉芽孢桿菌的16SrDNA序列如SEQ ID No. 1所示。將所測16SrDNA序列通 過BLAST比對，鑒定為解淀粉芽孢桿菌植物亞種0^(3；[11118 31117101丨9116€3(^6118 81^8卩· plantarum)0
[0022] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是：
[0023] (1)解淀粉芽抱桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum) B232對多種植物病原菌具有抑制作用，在拮抗細菌對植物病害生物防治中起到非常重要的 作用，例如種類和數(shù)量眾多；對病原菌的作用方式多樣化；繁殖速度快；能夠人工培養(yǎng)，易 于操作，便于生產(chǎn)應用；抗逆能力強等優(yōu)點，尤其是對真菌引起的鐵皮石斛根腐病的防治具 有重要意義；也是保證中藥安全重要手段。
[0024] (2)解淀粉芽抱桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum) B232培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025] 圖 la 解淀粉芽抱桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B232 的形態(tài)圖；
[0026] 圖lb為本發(fā)明中解淀粉芽孢桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp.
[0027] plantarum)B232芽孢形態(tài)圖（在一端或兩端折光體）
[0028] 圖2a為本發(fā)明中解淀粉芽孢桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B232 對楊樹大斑潰瘍病菌（Dothichiza populea Sacc.et Br.)的抑制 作用；
[0029] 圖2b為本發(fā)明中解淀粉芽孢桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B232 對鐵皮石斛灰霉菌（Botrytis cinerea)XC2 的抑制作用；
[0030] 圖2c為本發(fā)明中解淀粉芽孢桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B232對鐵皮石斛白絹病菌（Athelia rolfsii)的抑制作用；
[0031] 圖2d為本發(fā)明中解淀粉芽孢桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B232 對草莓根腐病菌（Fusarium oxsporum)的抑制作用；
[0032] 圖2e為本發(fā)明中解淀粉芽孢桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B232 對小麥赤霉病菌（Fusarium asiaticum)的抑制作用；
[0033] 圖3a為本發(fā)明中解淀粉芽孢桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B232菌液處理接種楊樹大斑潰瘍病菌的病斑；
[0034] 圖3b為本發(fā)明中沒有用解淀粉芽孢桿菌植物亞種([Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B232對楊樹大斑潰瘍病的接種進行處理；
[0035] 圖3c對照處理，傷口已愈合。
【具體實施方式】
[0036] 下面結(jié)合實驗例詳細闡述本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B232 的應用。
[0037] 實驗例1 :解淀粉芽抱桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B232對楊樹大斑潰瘍病菌（Dothichiza populea)、鐵皮石斛灰霉菌（Botrytis cinerea)、鐵皮石斛白絹病（Athelia rolfsii)、草莓根腐病（Fusarium oxsporum)、小麥赤 霉病菌（Fusarium asiaticum)的平板抑菌作用。
[0038] 將用LB斜面活化的解淀粉芽孢桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B232菌株劃線接種于PDA平板一側(cè)，再將楊樹大斑潰瘍病菌、鐵皮石斛 灰霉菌、鐵皮石斛白絹病菌、草莓根腐病和小麥赤霉病菌90mm的PDA平板培養(yǎng)物用直徑5mm 的打孔器打取同質(zhì)同量的菌塊，接種于平板另一側(cè)。30土 1°C培養(yǎng)14天和28天觀察抑菌能 力，并記錄其寬度（如表1)，實驗效果如圖2a至圖2e所示。試驗結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿 菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)B232 對 5 種病原菌均有較 好的拮抗作用，以占據(jù)培養(yǎng)皿的直徑判斷擬制效果，用無菌的PDA圓塊作為對照（表2)。
[0039] 解淀粉芽抱桿菌植物亞種（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum) B232與不同的病原真菌培養(yǎng)28天后，二者之間的抑制帶會變小，拮抗帶的寬窄各異（表 2)。
[0040] 表1 B232對楊樹大斑潰瘍病菌和鐵皮石斛灰霉病原菌14天和28天的抑制作用
[0041]
【權(quán)利要求】
1. 一種解淀粉芽孢桿菌植物亞種B232,其分類命名為解淀粉芽孢桿菌植物亞種 (ZfeciBiAs subsp. 保藏在中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC No. 9279,保藏日期為2014年06月09日。
2. 權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種B232在防治楊樹大斑潰瘍病中的應用。
3. 權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種B232在抑制楊樹大斑潰瘍病菌生長中 的應用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，將枯解淀粉芽孢桿菌植物亞種 subsp. /^/a/?iara?)B232接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C -35°C下發(fā)酵培 養(yǎng)48-72小時，得到的發(fā)酵液作為防治楊樹大斑潰瘍病菌的菌劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：1000 mL蒸餾 水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g，氯化鈉4-5g，ρΗ6· 5-7. 5。
6. 權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種Β232在抑制鐵皮石斛灰霉菌生長中的 應用。
7. 權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種Β232在抑制鐵皮石斛白絹病菌生長中 的應用。
8. 權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種Β232在抑制草莓根腐病病菌生長中的 應用。
9. 權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種Β232在抑制小麥赤霉病菌生長中的應 用。
【文檔編號】A01N63/00GK104195072SQ201410385641
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】趙桂華, 趙楠, 楊鶴同 申請人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院