一種StP5CS耐鹽轉基因大豆的培育方法

一種StP5CS耐鹽轉基因大豆的培育方法
【專利摘要】本發明屬于分子生物學與生物【技術領域】，涉及基因StP5CS及其在耐鹽轉基因大豆培育中應用，提供利用該基因培育耐鹽轉基因大豆方法、培育過程中使用的StP5CS過表達載體和工程菌、轉基因大豆StP5CS基因熒光定量方法和檢測試劑盒。本發明提供的StP5CS耐鹽轉基因大豆方法為：1)在植物表達載體pCAMBIA3301-StP5CS構建基礎上，獲得StP5CS耐鹽轉基因大豆轉化體；2)篩選純合體轉基因大豆。本發明解決現有技術中StP5CS在耐鹽轉基因育種中空白，該基因在轉基因植株中超量表達，提高目標作物耐鹽性。本發明的載體還含有廣譜除草劑抗性基因，既方便檢測又賦予轉基因大豆抗除草劑特性，便于生產應用。
【專利說明】-種StP5CS耐鹽轉基因大s_的培育方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學與生物【技術領域】，涉及野生茄子Λ L吡咯啉-5-羧酸合成 酶基因 StP5CS及該基因在耐鹽轉基因大豆培育中的應用，提供利用該基因培育耐鹽轉基 因大豆的方法、在培育過程中使用的StP5CS過表達載體和工程菌、以及轉基因大豆StP5CS 基因熒光定量方法和檢測試劑盒。 技術背景
[0002] 大豆是我國重要的糧食作物和油料作物。然而，由于受國外進口轉基因大豆的影 響，我國大豆生產面積和產量逐年下降，截止2012年大豆總產量為1449萬噸，僅占世界大 豆總產量的 5 % (國家統計局：http://data, stats, gov. cn/ 和 SoyStats :http://www. soystats. com)。目前，我國已經成為是世界上主要的大豆消費國和進口國，每年消費的大 豆約有80%依賴于國外進口，其中2012年進口大豆5838萬噸，占世界大豆總產量的20% (國家統計局：http://data, stats, gov. cn/)。隨著經濟的持續發展和人口數量的增加，我 國對大豆的需求量將日益增大，擴大大豆種植面積，提高大豆產量已是當務之急。東北地區 是大豆的主產區，同時也是土地鹽堿化最嚴重的地區之一，鹽堿土面積384萬hm 2,約占全區 總面積的3.1% (姚榮江，楊勁松，劉廣明.東北地區鹽堿土特征及其農業生物治理.土 壤，2006, 38:256-262.)。大豆屬鹽敏感作物，在鹽脅迫條件下栽培大豆的株高、莖節數、分 枝數、百粒重、單株莢數、粒數和粒重等顯著下降，品質降低，東北地區的土壤鹽堿化嚴重限 制了大豆的生產（Phang T H，Shao G H, Lam Η M. Salt tolerance in soybean. Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50 (10): 1196-1212·)。因此，培育大豆耐鹽新品種對 減少鹽害對大豆生產的影響，擴大大豆種植面積具有重要意義。
[0003] 隨著對大豆耐鹽機制的研究不斷深入和對耐鹽相關基因的挖掘，借助轉基因手 段培育耐鹽新種質將是一種有效的途徑。目前，抗除草劑、抗蟲、低反式脂肪酸和高油酸 轉基因大豆已經在國外大面積種植，并取得較好的經濟效益，然而關于耐鹽轉基因大豆 的培育及商業化種植報道較少。有研究表明在大豆中過量表達擬南芥AtMYB44轉錄因 子能顯著提高200mM NaCl脅迫條件下轉基因植株的耐鹽性，并且在田間試驗中轉基因大 豆產量顯著高于對照（Seo J S，Sohn H B，Noh K, Jung C, An J H, Donovan C M, Somers D A, Kim D I,Jeong S C, Kim C G.Expression of the Arabidopsis AtMYB44gene confers drought/salt-stress tolerance in transgenic soybean.Molecular Breeding, 2012, 29:601-608.)。此外，在大豆中過量表達一個來源于水稻的0sDREB2A轉錄 因子，可以促進轉基因大豆中可溶性糖和脯氨酸的積累，以及誘導脅迫響應相關轉錄因子 和基因的表達，進而提高轉基因大豆的耐鹽性（Zhang X X，Tang Y J，Ma Q B, Yang C Y, Mu Y H, Suo H C, Luo L H, Nian H. 0sDREB2A, a rice transcription factor, significantly affects salt tolerance in transgenic soybean. PloS One, 2013, 8:e83011. )〇 以 上報道說明，通過轉基因手段在大豆植株中過表達耐鹽相關基因培育耐鹽新種質具有 可行性。目前，除了已經報道的耐鹽相關轉錄因子之外，已經證實在轉基因植物中超量 表達小分子量化合物（如脯氨酸、甜菜堿、甘露醇、糖類、多胺類等）合成途徑的相關基 因，促進這些滲透調節物質在植物體內的累積，能夠提高轉基因植物的耐鹽性（Ashraf M，Akram N A. Improving salinity tolerance of plants through conventional breeding and genetic engineering:an analytical comparison. Biotechnology Advances，2009, 27(6) :744-752.)。
[0004] 脯氨酸是一種小分子的滲透調節物質，是水溶性最大的氨基酸。植物體內通 常大量積累脯氨酸以提高自身的抗滲透脅迫能力（Szabados L，Savour6A.Proline:a multifunctional amino acid. Trends in Plant Science, 2010, 15(2):89-97. )〇 鹽 脅迫條件下，植物主要通過谷氨酸途徑合成脯氨酸（Kiran Kumar Ghanti S，Sujata K G, Vijay Kumar B M，Nataraja Karba N，Janardhan Reddy K，Srinath Rao M, Kavi Kishor P B. Heterologous expression of P5CS gene in chickpea enhances salt tolerance without affecting yield. Biologia Plantarum，2011，55 (4):634-640.)〇 Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 P5CS是谷氨酸途徑的關鍵基因，編碼脯氨酸生物合 成的關鍵酶，在植物對鹽脅迫的響應中發揮重要作用（Rai A N，Penna S.Molecular evolution of plant P5CS gene involved in proline biosynthesis. Molecular Biology R印orts，2013, 40:6429-6435.)。通過基因工程手段在植物體內過量表達P5CS，可促進脯 氨酸的積累，提高植物的耐鹽性。目前，已經報道了多種耐鹽性增強的轉P5CS基因植物， 如煙草、水稻、小麥、馬鈴薯、鷹嘴豆和鴻豆等（Ashraf M, Akram N A. Improving salinity tolerance of plants through conventional breeding and genetic engineering:an analytical comparison. Biotechnology Advances, 2009, 27 (6): 744-752·)。但未見有將 P5CS基因轉入大豆培育P5CS耐鹽轉基因大豆的報道。
[0005] 野生爺子（Solanum torvum Swartz)是爺子的近緣野生種，耐鹽性強，在設施栽培 中常用作嫁接砧木以緩解設施土壤中次生鹽漬化的危害（Wei G P，Yang L F，Zhu Y L，Chen G. Changes in oxidative damage, antioxidant enzyme activities and polyamine contents in leaves of grafted and non-grafted eggplant seedlings under stress by excess of calcium nitrate. Scientia Horticulturae, 2009, 120:443-451.) 〇 目前關 于野生茄子中耐鹽基因的發掘報道較少，利用基因工程手段將野生茄子耐鹽基因特別是脯 氨酸合成積累相關基因導入作物中培育耐鹽新種質尚未見報道。


【發明內容】

[0006] 本發明目的是解決現有技術中StP5CS基因在耐鹽轉基因大豆育種中的空白，培 育大豆耐鹽新種質，提高大豆的耐鹽性，從而降低鹽害對大豆生產中的影響，促進大豆生 產。
[0007] 本發明的目的通過以下技術手段獲得
[0008] 本發明提供一種野生茄子Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS，該基因序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0009] 一種重組載體，該重組載體包含Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS。
[0010] 重組載體可以將上述基因 StP5CS插入到克隆載體或表達載體而得到。本發明采 用的基礎載體包括PMD19-T載體和pCAMBIA3301載體，但本發明所述的重組載體并不限于 以上述2種載體為基礎與基因 StP5CS重組后獲得的載體，任何可以與基因 StP5CS進行重 組并可在宿主細胞中進行復制和表達的重組載體均應為本發明保護的范圍。
[0011] 本發明上述的重組載體，為植物表達載體pCAMBIA3301-StP5CS，含有StP5CS基因 和抗除草劑bar基因，將StP5CS基因的5'端和3'端分別引入CaMV35S啟動子和nos終止 子，并克隆到基礎載體PCAMBIA3301的T-DNA區得到的。
[0012] 包含上述重組載體的轉化細胞。
[0013] 上述重組載體為包含基因 StP5CS的載體或質粒。轉化細胞是宿主細胞經過轉 化或侵染后得到的細胞。宿主細胞可以為原核生物細胞--其可用于繁殖載體和真核細 胞--其可用于表達核酸。
[0014] 一種StP5CS耐鹽轉基因大豆的培育方法，該方法將野生茄子StP5CS基因構建至 PCAMBIA3301表達載體中，通過該表達載體將外源StP5CS基因導入大豆基因組中獲得耐鹽 轉基因大豆。
[0015] 本發明實施例中，將該表達載體所攜帶的外源基因 StP5CS基因導入大豆基因組 中是通過根癌農桿菌EHA105介導的農桿菌轉化法完成的，但是，本實驗提供的方法不僅限 于此，任何一種轉化方法能將本發明提供的外源基因 StP5CS導入大豆基因組中都適用。
[0016] 上述的StP5CS耐鹽轉基因大豆的培育方法，包括如下步驟：
[0017] 1) StP5CS耐鹽轉基因大豆轉化體的獲得
[0018] 將上述的植物表達載體pCAMBIA3301-StP5CS導入大豆基因組，通過除草劑篩選 獲得L代轉基因大豆植株；
[0019] 2)純合體轉基因大豆的篩選
[0020] 利用⑶S組織化學分析法和PCR鑒定法檢測?\代轉基因大豆，獲得陽性植株，進 行自交獲得τ 2代種子。選取Τ2代種子萌發后的第一片完全展開葉，利用GUS組織化學分析 法和PCR鑒定法，選擇均為陽性的株系，即為純合體轉基因株系。
[0021] 本發明一個實施例中，將植物表達載體pCAMBIA3301-StP5CS導入大豆基因組是 通過農桿菌侵染大豆子葉外植體完成的。
[0022] 上述基因或重組載體在耐鹽轉基因植物中的應用，優選地，為耐鹽轉基因大豆中 的應用。
[0023] 本發明所述野生茄子Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS，取自野生茄子 (Solanum torvum Swartz cv. 'Torvum Vigor'）葉片中，是爺子的近緣野生種，屬爺科。因 此，可以預見，該基因可應用于茄科任一種物種，而本發明優選地在轉基因大豆中的應用， 只是本發明實施例中的一個方案，證明該基因可應用于非茄科物種中。
[0024] 上述轉化細胞在耐鹽轉基因植物中的應用，優選地，為耐鹽轉基因大豆中的應用。
[0025] 本發明提供一種耐鹽轉基因大豆StP5CS基因相對表達量的測定方法，該方法通 過設計特異性引物，經熒光定量PCR測定StP5CS基因在耐鹽轉基因大豆中的表達量；
[0026] 其中，特異性引物：
[0027] 上游引物PF4 :如SEQ ID No. 13所示，
[0028] 下游引物PR4 :如SEQ ID No. 14所示。
[0029] 本發明還提供一種耐鹽轉基因大豆StP5CS基因相對表達量測定的試劑盒，該試 劑盒包括如下序列：
[0030] StP5CS基因檢測引物，上游引物PF4 :如SEQ ID No. 13所示，下游引物PR4 :如SEQ ID No. 14 所示；
[0031] 大豆內參基因 ELFlb的檢測引物，上游引物ELFlbF :如SEQ ID No. 15所示；下游 引物 ELFlbR :如 SEQ ID No. 16 所示。
[0032] 本發明有益效果：
[0033] 1.本發明提供了一個新的野生茄子Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS基因， 該基因編碼脯氨酸合成途徑的關鍵酶；在植物中過量表達該基因可以促進目標植物體內脯 氨酸的大量積累，提高目標植物的耐鹽性。
[0034] 2.本發明構建的StP5CS基因重組植物表達載體pCAMBIA3301-StP5CS，將StP5CS 基因5'端和3'端分別引入CaMV35S啟動子和nos終止子，提高了 StP5CS基因的表達水 平；該載體可以應用于多種耐鹽轉基因植株的培育，尤其是耐鹽轉基因大豆的培育，填補了 現有技術中的空白。
[0035] 3.采用本發明提供的耐鹽轉基因大豆的培育方法生產出的含有StP5CS基因的轉 基因大豆，具有耐鹽的特性，可在鹽漬化環境下種植，通過試驗鑒定，通過本發明提供的培 育方法生產出的耐鹽轉基因大豆，盆栽條件下可以耐受1. 17%氯化鈉（200mM NaCl)脅迫， 水培條件下可以耐受0.59%氯化鈉（100mM NaCl)脅迫，在脅迫條件下轉基因植株生長狀 況良好，結莢數也顯著高于野生型對照植株。
[0036] 4.本發明構建的StP5CS基因重組植物表達載體pCAMBIA3301-StP5CS，除了含有 耐鹽StP5CS基因之外，還含有除草劑抗性基因 bar基因，賦予了轉基因植株耐鹽和抗除草 劑雙重特性，更有利于在生產中的應用。
[0037] 5.本發明通過設計特異的檢測引物，使用熒光定量PCR技術，定量測定StP5CS基 因在轉基因大豆中的相對表達量，從而實時監測StP5CS基因在轉基因大豆中的表達情況， 為轉基因大豆的育種和檢測提供方便。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1植物表達載體pCAMBIA3301-StP5CS構建流程圖
[0039] 圖2StP5CS的克隆及植物表達載體pCAMBIA3301-StP5CS的酶切鑒定
[0040] A圖：StP5CS瓊脂糖凝膠電泳分析
[0041] M :DNA Marker 電泳條帶，由上至下大小分別為 2Kb、lKb、0. 75Kb、0. 5Kb、0. 25Kb 和 0. 1Kb ；
[0042] 1 :StP5CS 電泳條帶；
[0043] B圖：中間載體pCAMBIA3301-T800雙酶切檢測瓊脂糖凝膠電泳分析
[0044] M :DNA Marker 電泳條帶，由上至下大小分別為 2Kb、lKb、0. 75Kb、0. 5Kb、0. 25Kb 和 0. 1Kb ；
[0045] 1 :HindIII/EcoRI 雙酶切 pCAMBIA3301-T800 產物電泳條帶；
[0046] 2 :pCAMBIA3301-T800 質粒電泳條帶；
[0047] C圖：植物表達載體pCAMBIA3301-StP5CS雙酶切檢測瓊脂糖凝膠電泳分析
[0048] M:DNA Marker 由上至下大小分別為 15Kb、10Kb、7. 5Kb、5Kb、2. 5Kb、lKb 和 0.25Kb ；
[0049] 1，2 :BamHI/SalI 雙酶切 pCAMBIA3301-StP5CS 產物電泳條帶；
[0050] 3 :pCAMBIA3301-StP5CS 質粒電泳條帶；
[0051] 圖3轉基因大豆的獲得流程圖
[0052] A圖：大豆種子萌發后的無菌苗；B圖：外植體與農桿菌共培養；C圖：不定芽的誘 導；D圖：不定芽的伸長；E圖：伸長的不定芽；F圖：半葉法GUS組織化學分析；G圖：生根培 養；Η圖：移栽于溫室的轉基因苗；I圖：轉基因大豆植株抗除草劑Basta鑒定；J圖：非轉基 因大豆植株抗除草劑Basta鑒定；
[0053] 圖4轉基因大豆不同組織器官⑶S組織化學分析
[0054] 所有小圖中左側為轉基因植株組織器官，右側為野生型對照植株組織器官；A圖： TQ葉片；B圖：TQ莖段；C圖和D圖：TQ花（花藥和柱頭）；E圖：T Q豆莢；F圖：萌發72h的?\ 種子；G圖：萌發24h的Τ2種子；Η圖：Τ2幼苗的側根；堅線為標尺，標尺=0. 5cm
[0055] 圖5轉基因大豆L代植株PCR和Southern鑒定
[0056] A圖：轉基因大豆?；代植株PCR鑒定；B圖：轉基因大豆?；代植株Southern鑒定； P :pCAMBIA3301-StP5CS質粒；WT :未轉化植株，Z1和Z2 :TQ轉基因植株；
[0057] 圖6轉基因大豆純合體株系的耐鹽性鑒定
[0058] A圖：T2代純合體轉基因植株在盆栽試驗200mM NaCl脅迫條件下的生長表現；
[0059] B圖：T3代純合體轉基因植株在水培試驗lOOmM NaCl脅迫條件下的生長表現；
[0060] 圖7T3代純合體轉基因植株中外源StP5CS基因的熒光定量表達分析
[0061] WT:野生型植株陰性對照；Z1-3和Z2-7 :分別為1~3代轉基因大豆株系Z1-3和 Z2-7 ;相對表達量數據為8次重復（8株植株）的平均值；數據采用Student's t測驗進行 顯著性差異分析，*表示處理間的差異達5%顯著水平，**表示處理間的差異達1%顯著水 平。

【具體實施方式】
[0062] 下述實施例中所用方法若無特殊說明均為本領域慣用的技術手段，所用的試劑、 材料，如無特殊說明均可通過商業途徑得到。
[0063] 一、StP5CS基因的克隆及植物表達載體的構建
[0064] 本發明從野生爺子（Solanum torvum Swartz cv. 'Torvum Vigor'）葉片中克隆 了一個新的Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS，以pCAMBIA3301載體為基礎載體構建 含有該基因的過表達載體，構建流程如圖1所示，【具體實施方式】如下：
[0065] 1.野生茄子Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS的克隆：
[0066] 以3周齡野生茄子幼苗葉片為材料，采用TaKaRa公司總RNA提取試劑（目錄號： D9108A)提取總RNA。然后將總RNA反轉錄成cDNA。參照番茄P5CS基因序列信息（NCBI登 錄號：U60267)，設計特異引物擴增如SEQ ID NO. 1所示基因片段；
[0067] 其中，特異性引物為：
[0068] 正向引物PF1 :如SEQ ID N0. 2所示
[0069] 反向引物PR1 :如SEQ ID NO. 3所示
[0070] 以上述獲得的野生茄子cDNA為模板進行PCR反應，50yL反應體系包含： 10 X PCRBuffer5. 0 μ L，dNTP mix4. 0 μ L (2. 5mmol · Γ1)，MgCl23 μ L (25mmol · Γ1)，PF1、PR1 引物各 1· Ομ L(20ymol .171)，Taq DNA PolymeraseO. 2μ L，cDNA 模板 1 μ L，ddH2034. 8μ L ; 反應程序：95°C預變性4min，然后30個循環反應包括94°C解鏈30sec，52. 7°C退火30sec， 72°C延伸2min30sec，最后72°C延伸lOmin ;PCR產物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果 如圖2A所示。檢測結束后，將PCR產物用凝膠回收試劑盒（AXYGEN，目錄號：AP-GX-50)回 收純化，用T 4DNA連接酶（TaKaRa，目錄號：D2011A)連接到pMD19-T載體（TaKaRa，目錄號： D102A)，轉化T0P10感受態細胞，進行序列測定；
[0071] 2.中間載體 pCAMBIA3301-T800 的改造
[0072] 全序列合成含有CaMV35S啟動子、多克隆位點、nos終止子的T800序列片段，其序 列如SEQ ID N0. 4所示，通過合成在T800序列片段兩端分別引入EcoRI和Hindlll酶切位 點；使用EcoRI(Promega，目錄號：R6011)和HindIII(Promega，目錄號：R6041)雙酶切基礎 載體PCAMBIA3301 (CAMBIA，Australia)和T800片段，得到酶切產物，將酶切產物按1:4的 比例用T4DNA連接酶（TaKaRa，目錄號：D2011A)連接，產物按照常規方法轉化T0P10感受態 細胞，提取質粒，酶切驗證，具體過程如下所述：
[0073] 1)取pCAMBIA3301質粒和T800片段各15 μ L，分別用EcoRI和Hindlll雙酶切， 其中，50μ L 雙酶切體系：10XBuffer Ε5μ L，BSA0. 5μ L，DNA15y L，EcoR II. 25μ L，Hind III1. 25 μ L，ddH2027 μ L ;37°C酶切反應3h，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，回收質粒 PCAMBIA3301 大片段（11256bp)和 T800 小片段（849bp);
[0074] 2)將上述酶切后的回收片段，按照大片段與小片段1:4的比例用T4DNA連接酶連 接，連接反應體系（25yL) :10XT4ligase Buffer2.5yL，pCAMBIA3301 大片段 2yL，T800 小片段8以1^，1'40嫩連接酶1以1^，(1(1!12011.5以1^161：反應過夜，獲得連接產物 ；取1(^1^連 接產物轉化T0P10感受態細胞，涂布于LB平板，37°C過夜培養；挑取單克隆擴大培養后， 提取質粒，進行酶切驗證，如圖2B所示；含有CaMV35S啟動子、多克隆位點、nos終止子的 PCAMBIA3301-T800中間載體改造完成；
[0075] 3.植物表達載體pCAMBIA3301-StP5CS的構建
[0076] 設計引物進行PCR反應，在目的基因StP5CS的5'端和3'端分別引入酶切位點 BamHI 和 Sail，米用 BamHI(Promega，目錄號：R6021)和 SalI(Promega，目錄號：R6051)雙 酶切PCAMBIA3301-T800中間載體和StP5CS基因PCR產物，回收pCAMBIA3301-T800大片段 (12097bp)和StP5CS (2250bp)片段，按1:4的比例用T4DNA連接酶連接，產物轉化T0P10感 受態細胞，提取質粒，進行雙酶切驗證，【具體實施方式】如下：
[0077] 其中，引物為：
[0078] 正向引物PF2:如SEQ ID N0. 5所示；
[0079] 反向引物PR2:如SEQ ID Ν0· 6所示。
[0080] 1)以野生茄子葉片cDNA作為模板，用高保真酶（PrimeSTAR? HS DNA Polymerase，TaKaRa 目錄號：DR010A)進行 PCR 反應，50yL 反應體系：10XPCR Buffer5. 0 μ L，dNTP mix4. 0 μ L(2. 5mmol · Γ1)，引物 PF2 和 PR2 各 1· 0 μ L(20 μ mol · Γ1)， PrimeSTAR? HS DNA PolymeraseO. 4 μ L，cDNA 模板 1 μ L，ddH2037. 6 μ L ;反應程序：95°C預 變性4min，然后30個循環反應包括98°C解鏈10sec，68°C延伸2min30sec，最后72°C延伸 lOmin。PCR產物用凝膠回收試劑盒回收，進行序列測定；
[0081] 2)分別取改造好的pCAMBIA3301-T800中間載體和含有酶切位點的StP5CS PCR產 物各15μL，用BamHI和SalI雙酶切，雙酶切體系（50μL):10XBufferE5μL，BSA(λ5μL， DNA15y L，BamHIl. 25μ L，Salll. 25μ L，（ΜΗ2027 μ L ;37°C酶切反應 3h ;酶切結束后進行 瓊脂糖凝膠電泳分離，回收質粒PCAMBIA3301-T800大片段（12097bp)和StP5CS小片段 (2250bp)；
[0082] 3)上述回收的大片段和小片段，按照1:4的比例，用T4DNA連接酶連接，連接反應 體系（25μ L) :10XT4ligase Buffer2. 5μ L，PCAMBIA3301-T800 大片段 2μ L，StP5CS 小片 段8 μ L，T4DNA連接酶1 μ L，ddH2011. 5 μ L ; 16°C反應過夜，取10 μ L連接產物轉化T0P10感 受態細胞。37°C過夜培養，挑取單克隆擴大培養，提取質粒，進行酶切驗證（圖2C)，植物表 達載體pCAMBIA3301-StP5CS的構建成功。
[0083] 二、植物表達載體采用凍融法轉化農桿菌菌株EHA105
[0084] 實驗用農桿菌 EHA105 在文獻（Hood E E, Gelvin S B, Melchers L S, Hoekema A. New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Research, 1993,2:208-218.)中公開過，購自北京天恩澤生物技術有限公司。凍融法轉 化農桿菌的具體方法在文獻（Jyothishwaran G，Kotresha D，Selvaraj T，Srideshikan S,Rajvanshi P,Jayabaskaran C. A modified freeze-thaw method for efficient transformation of Agrobacterium tumefaciens. Current Science, 2007, 93:770-772.) 中公開過。
[0085] 1.根癌農桿菌EHA105感受態的制備
[0086] 取_70°C保存的EHA105甘油菌于YEB固體培養基劃線活化；挑取單菌落，接到5mL YEB液體培養基，28°C，250rpm培養過夜進行活化；取2. 5mL活化的菌液，加入到50mL YEB 液體培養基中，28°C，250rpm擴大培養至0D_值約0. 5-0. 6左右；將菌液轉至50mL無菌離 心管中，冰浴3〇111；[11，41€，6000印1]1離心5111；[11 ;棄上清，沉淀用101]11^預冷的0.151似(]1懸浮 后4°C，6000rpm，離心5min，棄上清液；將沉淀再次用2mL CaCl2 (20mM)懸浮后，每份200 μ L 分裝到1. 5mL離心管中，液氮迅速冷凍lmin，保存于-70°C冰箱備用。
[0087] 2.植物表達載體凍融法轉化根癌農桿菌
[0088] 取_70°C保存的EHA105感受態細胞，置冰上融化；取2 μ g純化的植物表達載體 pCAMBIA3301-T800-StP5CS質粒，加入到200 μ L已解凍的菌液中，輕輕混合，冰浴30min。然 后轉移至液氮中冷凍3min，迅速轉至37°C水浴中溫浴5min ;向菌液中加入800 μ L新鮮YEB 液體培養基（蛋白胨5g · ΙΛ酵母提取物lg · ΙΛ牛肉膏5g · L'MgSC^ · 7H200. 5g · ΙΛ蔗 糖5g · Γ1，pH值至7· 0)，28°C，lOOrprn，振蕩培養2-4h，使菌體復蘇。將菌液5000rpm離心 5min，棄去大部分上清液，剩余菌液吸打混勻；涂布于含有50mg · Γ1卡那霉素的YEB固體 培養基；28°C培養直至出現單克隆；挑取單克隆，接種到5mL YEB液體培養基（含50mg噸4 卡那霉素），28°C，250rpm培養過夜，PCR檢測陽性菌液制備甘油菌，-70°C保存。
[0089] 三、農桿菌介導StP5CS基因轉化大豆
[0090] 大豆品種 'ΝΥ-100Γ 及轉化方法在文獻（Liu S C，Zhang G C，Yang L F，Mii M，Gai J Y，Zhu Y L Bialaphos-resistant transgenic soybeans produced by the Agrobacterium-mediated cotyledonary-node method.Journal of Agricultural Science and Technology，2014, 16:175-190.)中公開過。
[0091] 1.外植體的制備及農桿菌侵染
[0092] 取成熟飽滿的'ΝΥ100Γ大豆種子，在密閉容器中氯氣表面消毒16h(氯氣由 3. 5mL12N的HC1和100mL5. 25%的次氯酸鈉混合制得）。消毒結束后轉移至萌發培養基 (B5基本培養基+3% (w/v)蔗糖+0.8% (w/v)瓊脂，pH5.8)，25°C條件下，光照（16/8h， 90 μ mol · m_2 · S_〇培養5天，獲得無菌苗（圖3A)，切取子葉節作為外植體。
[0093] 將含有pCAMBIA3301-T800-StP5CS載體的農桿菌ΕΗΑ105劃線于ΥΕΒ平板，28°C培 養24h，挑取單克隆液體培養24h，然后取2mL復蘇的菌液加入200mL YEP液體培養基中，擴 大培養至〇D65(l為0. 8,菌液離心后，用液體共培養培養基（1/10B5,1. 67mg · L、-芐基氨基 噪呤，0.2511^^171 赤霉素，200 μ mol· L-1 乙酰丁香酮，3% (w/v)鹿糖和 0.7% (w/v)瓊脂， PH5. 4)重懸，調節0D65(I值為1。每25個外植體加入到50mL重懸菌液中，侵染30min，期間 每隔lOmin搖動一次。侵染結束后，吸干多余菌液，將外植體近軸面向下放置于鋪有一層濾 紙的共培養基上（添加3. 3mmol · L^L-半胱氨酸，lmmol · I71硫代硫酸鈉和lmmol · I71二 硫蘇糖醇），22°C遮光共培養4天（圖3B)。
[0094] 2.轉基因大豆的再生與篩選
[0095] 1)不定芽的誘導
[0096] 共培養結束后的外植體，用液體芽誘導培養基（B5,1. 67mg · L、-芐基氨基嘌呤， 500mg .171羧節青霉素，3% (w/v)鹿糖，3mmol .1^2-嗎啉乙磺酸，pH5. 6)搖動洗漆4-5次， 近軸面向上置于固體芽誘導培養基（液體芽誘導培養基添加0.8% (w/v)瓊脂）。25°C光 照（16/8h，90ymol m^V1)培養10天。10天后，外植體轉移至含有4mg·]^雙丙氨膦的芽 誘導篩選培養基（圖3C)，篩選培養4周，每2周繼代一次。
[0097] 2)芽伸長培養
[0098] 將篩選后含有叢生芽的外植體，轉移到芽伸長培養基（MS, lmg · I71玉米素， 0. 5mg · I71赤霉素,0. lmg · I71卩引哚乙酸，100mg · L-1焦谷氨酸，50mg · I^L-天冬酰胺， 30011^171羧芐青霉素，雙丙氨膦，3 % (w/v)蔗糖，3mmol .1^2-嗎啉乙磺酸和 0· 8% (w/v)的瓊脂，ρΗ5· 6)，芽伸長6-8周（圖3D和3E)，每隔2周繼代1次。
[0099] 3)半葉法轉化體的篩選
[0100] 為盡早確定轉化體，當有不定芽伸長時，采用半葉法進行GUS組織化學鑒定，先對 伸長的芽逐一編號，用無菌手術剪從每個芽上剪半張葉片進行GUS組織化學分析（圖3F)。 GUS陽性的芽轉移到新的芽伸長培養基中單獨培養。
[0101] 4)生根
[0102] 當⑶S陽性的芽伸長至3-4cm時，用手術刀從基部切下，轉入生根培養基（1/2Β5， 0. Smg·!/1!!引哚丁酸，3% (w/v)鹿糖，0. 8% (w/v)瓊脂，pH5. 6)誘導生根。待有3-4條 健壯根長出后（圖3G)，打開培養瓶瓶蓋馴化2-3d，然后用鑷子小心將幼苗取出，洗凈根 部的培養基，移栽含有蛭石：草炭=1 :1的塑料盆中，開始3-4天用保鮮膜覆蓋保濕，25°C 在光照培養箱中生長1周。1周后，逐漸將保鮮膜打開馴化，并移入溫室中，在自然光下 生長，每隔2天澆一次1/4濃度的園試配方營養液，直至成熟收獲（圖3H)。所使用園 試配方營養液大量元素及含量分別為（mmol · Γ1) :Ca(N03)2 · 4H20(4.00)、KN03(8 . 00)、 ΝΗ4Η2Ρ04(1· 33)和MgS04 ·7Η20(2· 00);微量元素及其含量分別為（μ mol 七1) :H3B03(B140)、 CuS04 ·5Η20(αι100)、MnCl2 ·4Η20(Μη36)、ZnS04 ·7Η20(Ζη46)、Fe-EDTA(Fe30)和％]?〇02(]\1〇1)。
[0103] 3.轉基因大豆植株的鑒定
[0104] 1)1；轉基因大豆Basta抗性鑒定
[0105] 用棉棒蘸取0. 05% Basta均勻涂抹于健康的轉基因大豆和未轉化大豆半張葉片 表面，10天后觀察葉片的癥狀，結果表明轉基因植株具有抗Basta除草劑特性（圖31)，而 非轉基因植株葉片黃化（圖3J)。
[0106] 2)轉基因大豆⑶S組織化學分析
[0107] 取?；代轉基因大豆和未轉化大豆的葉片、莖段、花、豆莢，以及?\代種子分別置于 ⑶S 反應液[50mmol · I71 憐酸鈉緩沖液（ρΗ7· 0)，1 % (v/v) Triton X100, 20% (v/v)甲醇， 50mmol · I71六氰合亞鐵酸鉀，50mmol · I71六氰合鐵酸鉀，lmmol · Ll-Gluc (Goldbio,貨號： G1281C)]中，37°C反應12h。70%乙醇去除葉綠素后，拍照觀察。結果如圖4所示，gus基 因在I代轉基因植株各器官中均有表達，并且在I\、T 2代種子以及T2代幼苗側根中穩定地 表達，說明外源基因已經成功遺傳到后代中。
[0108] 3)TQ代轉基因大豆植株PCR鑒定
[0109] 取轉基因大豆幼嫩葉片，以常規SDS法提取基因組DNA，然后以獲得的基因組DNA 為模板進行PCR，分別檢測gus、bar和StP5CS基因。結果顯示轉基因植株中含有清晰地gus 基因、bar基因和StP5CS基因目的條帶，而未轉化植株中沒有擴增到相應的條帶，說明外源 基因已經成功整合到大豆基因組中（圖5A)。
[0110] 反應體系包含：10XPCR Buffer2. 0μ L，dNTP mixl. 6μ L(2. 5mmol · Γ1)， MgCl2l. 2 μ L(25mmol · I/1)，檢測弓 | 物各 1. 0 μ L (20 μ mol · I/1)，Taq DNA Polymerase。· 2 μ L，cDNA 模板 1 μ L，ddH2012 μ L ;
[0111] gus基因 PCR擴增引物：
[0112] 正向引物gusF :如SEQ ID Ν0· 7所示
[0113] 反向引物gusR :如SEQ ID Ν0· 8所示
[0114] 反應程序：94°C 5min，（95°C 45sec，55°C 45sec，72°C lmin) X30 循環，72°C lOmin ;
[0115] bar基因 PCR擴增引物為：
[0116] 正向引物barF :如SEQ ID NO. 9所示
[0117] 反向引物barR :如SEQ ID Ν0· 10所示
[0118] 反應程序：94°C 5min，（95°C lmin，55°C lmin，72°C lmin) X30 循環，72°C lOmin ;
[0119] StP5CS基因 PCR擴增引物為：
[0120] 正向引物PF3 :如SEQ ID NO. 11所示
[0121] 反向引物PR3 :如SEQ ID NO. 12所示
[0122] 反應程序：94 °C 5min，（94 °C 30sec，50 °C 30sec，72 °C 45sec) X30 循環， 72。。 lOmin ;
[0123] 4) L代轉基因大豆植株Southern雜交鑒定
[0124] 提取?；代轉基因大豆植株的基因組DNA，純化后用EcoRI進行酶切16h，0. 8% (w/ v)瓊脂糖電泳分離，轉膜用于雜交。雜交探針的制備采用地高辛隨機引物標記法進行，選 用與大豆內源P5CS基因序列相似性較低的639bp StP5CS基因編碼區片段用于探針標記。 探針的標記、雜交、顯色使用羅氏公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche, Germany)進行。Southern雜交結果確認StP5CS基因以低拷貝的形 式成功整合到大豆基因組中（圖5B)。
[0125] 4.純合體轉基因大豆的篩選
[0126] 1)?\代轉基因植株的鑒定
[0127] 將?；代轉基因植株自交收獲的種子置于去離子水中浸泡吸漲4_5h，種子完全膨脹 后轉移至含有濕潤濾紙的培養皿中，在25°C條件下催芽。待種子萌發后，分別播種于含有蛭 石和草炭（1:1，v/v)的塑料盆中[23(上直徑）X13(下直徑）X20cm(高）]，每盆播一粒 種子。真葉展開后每2天澆1/4濃度的園試配方營養液。當第一片三出復葉完全展開后， 剪取葉片進行⑶S組織化學分析和PCR鑒定。結果表明，外源基因在?\代中以3:1的比例 分離，符合孟德爾遺傳定律。
[0128] 2) Τ2代純合體轉基因株系的篩選
[0129] 為篩選純合的轉基因株系，將GUS和PCR檢測陽性的轉基因 ?\代植株分別進行自 交，收獲Τ2種子。收獲的種子按照上述方法催芽并播種于溫室。當第一片復葉完全展開后， 取葉片進行⑶S組織化學分析和PCR鑒定。經鑒定有兩個株系，命名為Ζ1-3和Ζ2-7的后 代植株均顯示⑶S陽性和StP5CS基因 PCR陽性，說明這兩個株系為純合體轉基因株系。
[0130] 四、T2代和T3代純合體轉基因大豆耐鹽性鑒定
[0131] 1. Τ2代純合體轉基因大豆盆栽法耐鹽性鑒定
[0132] 采用盆栽法對篩選得到的Τ2代純合轉基因株系（Ζ1-3和Ζ2-7)進行耐鹽性鑒定， 并以野生型大豆植株作為對照。試驗在南京農業大學溫室進行，采用完全隨機設計，植株在 溫室中隨機排列。溫室環境采用人工控制，晝夜溫度：25/20°C，相對濕度：70 - 80%，光周 期：16/8h (光照/黑暗），光照強度：600 μ mol. πΓ2· s-1 (PPFD)，C02濃度：400ppm。植株栽培 于含有蛭石和草炭（1:1，v/v)的塑料盆中[23(上直徑）X 13(下直徑）X20cm(高）]，每2 天澆1/4濃度的園試配方營養液。當第五片三出復葉完全展開后，從每個株系隨機選取生 長一致的6株植株進行200mM NaCl鹽脅迫處理。為了防止鹽激反應，NaCl處理的濃度從 50mM開始以50mM的梯度緩慢提高：前3天的處理濃度分別為50, 100, 150mM ;從第4天開始 在200mM NaCl濃度條件下連續處理10天。200mM NaCl鹽處理10天后，進行鹽害級別的統 計，測定株高、葉面積、相對葉綠素含量生長指標，然后常規管理直至植株結莢。
[0133] 鹽害級別統計時，將大豆的鹽害癥狀分為1到5五個級別，其中1 =無明顯的黃化 失綠癥狀；2 =輕度黃化（25%的葉片黃化失綠）；3 =中度黃化（50%的葉片有黃化癥狀， 其中一部分葉片干枯）；4=嚴重黃化（75%以上的葉片黃化，并且葉片干枯死亡）；5=植 株死亡（葉片嚴重的干枯，萎蔫）。各株系平均鹽害級別=Σ (該級別植株數X單株鹽害 級別）/各株系植株總數。葉面積的測量使用自動葉面積測量儀（YMJ-C，浙江托普儀器有限 公司）進行。相對葉綠素含量使用SPAD_502Plus葉綠素儀（Minolta Camera Co.，Japan) 測定，以SPAD值表示，每株測量9次，取平均值代表該株的相對葉綠素含量。
[0134] 正常栽培條件下，轉基因植株與對照植株沒有明顯地表型差異。然而，如表1所 示，鹽脅迫條件下，轉基因植株的耐鹽性顯著高于對照植株，純合轉基因株系Z1-3和Z2-7 的鹽害級別分別為1. 67和1. 83,而非轉基因株系的鹽害級別為4. 17。鹽脅迫處理10天后， 轉基因植株生長表現良好，上部葉片生長正常仍然保持綠色，而對照植株葉片黃化萎蔫，植 株底部葉片出現焦枯癥狀（圖6A)，生長指標測定結果顯示轉基因植株的株高、最大單葉葉 面積、葉綠素含量顯著高于非轉基因植株。此外，在鼓粒期，轉基因植株的有效莢數顯著多 于對照植株。
[0135] 2. T3代純合體轉基因大豆水培法耐鹽性鑒定
[0136] Τ3代純合體轉基因株系由Τ2代純合體轉基因植株自交獲得，采用水培法對篩選 得到的Τ 3代純合轉基因株系進行耐鹽性鑒定，試驗在南京農業大學溫室進行，采用完全隨 機設計，每個株系處理8株植株（8次重復），植株在溫室中隨機排列。溫室環境采用人工 控制，晝夜溫度：25/201：，相對濕度 ：70 - 80%，光周期：16/811(光照/黑暗），光照強度： 600 μ mol. m_2_ iT1 (PPFD)，C02濃度：400ppm。試驗在水培條件下進行，營養液采用1/2濃度的 園試配方營養液。為保證處理條件的一致性，將T 3代Z1-3和Z2-7純合轉基因株系和野生 型對照大豆植株，每株系各一株栽培于同一個含有14L園試配方營養液（EC = 2. 40dS ?πΓ1) 的塑料桶中，植株用海綿固定于泡沫板上（圖6Β)，對營養液進行通氣供氧，每隔3天更換 一次營養液。當植株第五片三出復葉完全展開后，在營養液中添加 l〇〇mM NaCl脅迫處理， 為防止鹽激，最初2天的處理濃度為50mM，從第3天開始NaCl濃度提高至100mM并維持10 天。鹽處理期間，每隔2天更換一次營養液，EC值保持在11. 0-11. 5ds.Hr1之間，pH保持 在6. 0-6. 5之間。100mM NaCl處理10天后，進行鹽害級別的統計，測定株高、葉面積、相對 葉綠素含量生長指標，然后常規管理直至植株結莢。生長指標統計方法同盆栽試驗。
[0137] 如表2所示，鹽脅迫條件下，轉基因植株的耐鹽性顯著高于對照植株，純合轉基因 株系Z1-3和Z2-7的鹽害級別分別為1. 75和1. 50,而非轉基因株系的鹽害級別為4. 13。鹽 脅迫處理10天后，轉基因植株生長表現良好，大部分葉片仍然保持綠色，而對照植株葉片 嚴重黃化萎蔫（圖6B)，生長指標測定結果顯示轉基因植株的株高、最大單葉葉面積、葉綠 素含量顯著高于非轉基因植株。此外，在鼓粒期，T 3代轉基因植株的有效莢數顯著多于對照 植株。這些結果說明，轉基因植株的耐鹽特性順利的遺傳到了后代中。
[0138] 3. StP5CS基因在Τ3代純合體中的表達分析
[0139] 采用熒光定量的方法檢測1~3代純合體轉基因株系中StP5CS基因的表達；如圖7所 示，在正常栽培和鹽脅迫處理兩種條件下，StP5CS基因在兩個純合體株系中均成功表達，且 鹽處理后StP5CS基因的表達量提高；而對照植株沒有檢測到StP5CS基因的表達，具體定量 方法如下：
[0140] 提取T3代純合體株系和對照植株的總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA。根據 StP5CS基因序列設計一對的特異引物擴增128bp編碼區：
[0141] 正向引物PF4:如SEQ ID N0. 13所示，
[0142] 反向引物PR4:如SEQ ID NO. 14所示；
[0143] 以大豆真核延伸因子基因 ELFlb作為內參基因，擴增引物為：
[0144] 正向引物 ELFlbF:如 SEQ ID N0. 15 所示，
[0145] 反向引物 ELFlbR:如 SEQ ID NO. 16 所示。
[0146] 熒光定量PCR在安捷倫Mx3005P熒光定量PCR儀上進行，將反轉錄的cDNA樣品稀 釋10倍作為熒光定量PCR擴增的模板，反應體系參照TaKaRaSYBFT Premix Ex Taq?說明 書。熒光定量PCR反應體系（25yL)包含：SYBir Premix Ex Taq?(2X)12. 5yL;正向和 反向引物各 〇· 5 μ L (20 μ mol · Γ1)，cDNA50ng，dd Η209· 5 μ L ;熒光定量 PCR 反應程序：95°C 預變性30s后，95 °C變性5s，60°C退火20s，40個循環，在每個循環結束后采集熒光信號進行 實時檢測。以大豆真核延伸因子基因 ELFlb作為內參基因，StP5CS基因的相對表達量通過 公式 2_Δσ 來計算。Λ CT = CTstRTO-CTRI.F J，其中 CTstPsre :為 StP5CS 基因的 CT 值，CTRI.F1h :為 大豆真核伸長因子基因的CT值。
[0147] 表1盆栽試驗200mM NaCl處理對T2代純合體轉基因大豆的耐鹽性及生長的影 響
[0148]

【權利要求】
1. 一種野生茄子Λ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS，其特征在于：該基因序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
2. -種重組載體，其特征在于：該重組載體包含權利要求1所述的Λ1-吡咯啉-5-羧 酸合成酶基因 StP5CS。
3. 權利要求2所述的重組載體，其特征在于：該重組載體為植物表達載體 pCAMBIA3301-StP5CS，含有StP5CS基因和抗除草劑bar基因，將StP5CS基因的5'端和3' 端分別引入CaMV35S啟動子和nos終止子，并克隆到基礎載體pCAMBIA3301的T-DNA區得 到的。
4. 包含權利要求2或3所述重組載體的轉化細胞。
5. -種StP5CS耐鹽轉基因大豆的培育方法，其特征在于：將野生茄子StP5CS基因構 建至PCAMBIA3301表達載體中，通過該表達載體將外源StP5CS基因導入大豆基因組中獲得 耐鹽轉基因大豆。
6. 權利要求5所述的StP5CS耐鹽轉基因大豆的培育方法，其特征在于：包括如下步 驟： 1. StP5CS耐鹽轉基因大豆轉化體的獲得 將權利要求3所述的植物表達載體pCAMBIA3301-StP5CS導入大豆基因組，通過除草劑 篩選獲得?；代轉基因大豆植株； 2) 純合體轉基因大豆的篩選 利用⑶S組織化學分析法和PCR鑒定法檢測?\代轉基因大豆，獲得陽性植株，進行自 交獲得Τ2代種子；選取Τ2代種子萌發后的第一片完全展開葉，利用GUS組織化學分析法和 PCR鑒定法，選擇均為陽性的株系，即為純合體轉基因株系。
7. 權利要求1所述基因或權利要求2或3所述重組載體在耐鹽轉基因植物中的應用， 優選地，為耐鹽轉基因大豆中的應用。
8. 權利要求4所述轉化細胞在耐鹽轉基因植物中的應用，優選地，為耐鹽轉基因大豆 中的應用。
9. 一種耐鹽轉基因大豆StP5CS基因相對表達量的測定方法，其特征在于：設計特異性 引物，通過熒光定量PCR測定StP5CS基因在耐鹽轉基因大豆中的表達量； 其中，特異性引物： 上游引物PF4 :如SEQ ID No. 13所示， 下游引物PR4 :如SEQ ID No. 14所示。
10. -種耐鹽轉基因大豆StP5CS基因相對表達量測定的試劑盒，其特征在于：該試劑 盒包括如下序列： StP5CS基因檢測引物，上游引物PF4:如SEQ ID No. 13所示，下游引物PR4:如SEQ ID No. 14所示； 大豆內參基因 ELFlb的檢測引物，上游引物ELFlbF :如SEQ ID No. 15所示；下游引物 ELFlbR :如 SEQ ID No. 16 所示。
【文檔編號】A01H5/00GK104099355SQ201410332153
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月11日 優先權日:2014年7月11日
【發明者】朱月林, 蓋鈞鎰, 張功臣 申請人:南京農業大學