油桐下胚軸愈傷組織誘導及高效再生植株的方法
【專利摘要】本發明公開了油桐下胚軸愈傷組織誘導及高效再生植株的方法,屬于植物細胞工程領域。主要通過油桐下胚軸誘導愈傷組織、愈傷組織誘導不定芽、繼代增殖培養、壯苗培養、生根培養、煉苗移栽等過程,不僅為快速繁殖優良油桐植株提供了一條途徑,而且為以后通過基因工程的方法改良油桐的抗性、加速油桐分子育種進程及提高油脂質量等性狀,以及為油桐遺傳體系的建立打下堅實的基礎。
【專利說明】油桐下胚軸愈傷組織誘導及高效再生植株的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于油桐細胞工程領域，具體涉及一種利用油桐下胚軸愈傷組織誘導及 高效再生植株的方法。
【背景技術】
[0002] 油桐為大戟科（Euphorbiaceae)油桐屬（Vernicia)植物的統稱，是重要的工業 油料樹種，與油茶、核桃和烏桕并稱我國四大木本油料樹種。從油桐種子榨取的油稱為桐 油，是世界上最優質的植物干性油，為油漆、印刷墨油的優良原料。桐油具有干燥快、附著 力強、比重輕、富光澤、耐酸堿、耐高溫、抗凍裂、防水等優良特性。此外，桐油還是一種優良 涂料，是合成新型復合材料的基本原料，具有廣泛的用途。近年來，隨著全球人口增加和 經濟的飛速增長，資源開發利用過度，發展油桐產業已迫在眉睫，如何挖掘油桐這一寶貴 資源在生物質能源等領域的重要作用，推進油桐規模化發展是當前科研工作者艱巨的任 務，也是幫助山區農民脫貧致富的手段之一。目前，油桐的常規育苗方法主要為實生苗及 嫁接苗，嫁接苗雖然能夠保持母本的優良性狀，但成本較高，不利于規模化生產。同時， 油桐枯萎病是我國油桐產區一種毀滅性病害，嚴重影響了油桐產業的穩定發展。通過組織 培養可以快速繁殖油桐脫毒苗，在此基礎上通過遺傳體系轉化而獲得抗病植株，在木本油 料植物遺傳改良方面有廣闊的前景。
[0003] 油桐的離體培養研究很晚，到目前為止僅有以油桐離體葉片通過器官發生途徑 獲得再生植株的報道，但由于葉片較嫩，在農桿菌侵染過程中特別容易受傷，再生活性降 低，對實現油桐的遺傳體系轉化產生很大的障礙，并且，葉片容易失水，對卡那霉素的抗 性較低，在卡那霉素篩選過程中容易死亡，而下胚軸是通過合子胚發育而來胚性器官，胚 性較強，具有很高的活力及分化再生能力，在植物遺傳體系轉化中有廣闊的前景。目前， 通過農桿菌侵染下胚軸獲得轉基因植株已經在油菜及柑橘中獲得成功，而這些植物通過 離體葉片也可以獲得再生植株，但在農桿菌侵染時的過程中，以及在卡那霉素篩選中葉片 容易死亡，不能獲得轉基因植株，相反，這些植物的下胚軸對卡那霉素的抗性較強，有利 于目的基因的介導、轉化和再生。因此，通過利用油桐下胚軸愈傷組織誘導獲得再生植株 在油桐轉基因領域有廣闊的前景。本發明以油桐幼嫩的下胚軸為外植體，通過在高濃度的 激素下誘導愈傷組織，然后轉接到愈傷組織分化不定芽的培養基中進行不定芽的分化、繼 代增殖、生根和煉苗移栽等過程，旨在建立一個高效穩定的油桐下胚軸離體快繁體系，為 油桐遺傳改良奠定基礎。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是針對目前油桐采用葉盤法獲得再生植株技術存在的缺陷，在此 基礎上，提供了利用油桐下胚軸愈傷組織誘導獲得再生植株，該方法利用油桐幼嫩的下胚 軸誘導愈傷組織，再通過愈傷組織分化不定芽，其誘導率高，不定芽健壯，不定芽繼代增 殖系數1?，壯苗效果好，生根率1?，關鍵還在于能夠大大提1?農桿菌浸染實現遺傳轉化的 可能性。
[0005] 本發明的目的是通過以下方式實現的。
[0006] 油桐下胚軸愈傷組織誘導及高效再生植株的方法，包括以下步驟：
[0007] 將油桐成熟胚在無菌條件下萌發30天的下胚軸，在無菌條件下切成長為 0· 5-1. 0cm 的小塊，接種到 WPM+5. 0-10. 0mg/L6-BA+l. Omg/L ΚΤ+0. lmg/L NAA 的培養基中 誘導愈傷組織，暗培養3天后，轉到光照條件下培養10天；培養溫度為26 士 1°C，光照 強度為2100-22001X，光照時間12-14h/d;然后經過不定芽分化、繼代增殖、壯苗和生根培 養獲得完整植株；最后進行煉苗、移栽。
[0008] 上述方法中不定芽分化的具體過程如下：將下胚軸誘導的質地較好的愈傷組織 接種到 WPM+0. 5-1. 0mg/L6-BA+0. 01-0. 05mg/L NAA+2. Omg/L GA3 的培養基中進行不定芽的 分化培養，暗培養1天后，轉到光照條件下培養25-30天；培養溫度為26 士 1°C，光照強 度為 2100-22001X，光照時間 12-14h/d。
[0009] 上述方法中繼代增殖培養的具體過程如下：將愈傷組織分化培養得到的健壯不 定芽切下接種到WPM+2. 0-3. Omg/L ΚΤ+0. 05mg/L IAA+2. Omg/L GA3的培養基中進行不定芽 的增殖培養，暗培養1天后，在光照條件下培養25-30天；培養溫度為26 士 1°C，光照強 度為 2100-22001X，光照時間 12-14h/d。
[0010] 上述方法中壯苗培養的具體過程如下：將增殖培養得到的芽轉接到 WPM+0. 5-1. Omg/LNAA+1. 0-2. Omg/L GA3的培養基中進行壯苗培養，暗培養1天后，在光照 條件下培養15-20天；培養溫度為26 士 1°C，光照強度為2100-22001x，光照時間12-14h/ d〇
[0011] 上述方法中生根培養的具體過程如下：將壯苗培養獲得2-4cm的苗接到 1/4MS+0. 1-0. 3mg/L IBA的培養基中進行生根培養；培養溫度為26 士 1 °C，暗培養3-5天， 再轉到光照下培養5-7天即可生根，光照強度為2100-22001X，光照時間12-14h/d。
[0012] 上述方法中煉苗、移栽的具體過程如下：
[0013] 將生根后的苗先在人工氣候箱中進行移栽前煉苗，煉苗保持空氣相對濕度為 80%以上，3-5天后從培養瓶中取出，洗凈根部培養基，移栽到營養杯中，基質為泥炭土： 珍珠巖：黃土 = 2:1:1，用薄膜蓋住營養杯口，保持恒定的氣候條件，兩周后取出薄膜， 逐步進行正常水肥管理。
[0014] 所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導及高效再生植株的方法優選，
[0015] 不定芽分化的培養基為：WPM+1. 0mg/L6-BA+0. 01mg/L NAA+2. 0mg/L GA3。
[0016] 壯苗培養使用的培養基為：WPM+0. 5-1. Omg/L NAA+2. Omg/L GA3。
[0017] 下胚軸的獲得過程如下：
[0018] 選取成熟的油桐當年生種子，取除種皮，將種仁用自來水沖洗5_8min，然后浸泡 15-20h，中間換水3-4次，然后在超凈工作臺中用0. 1%的HgCl2消毒3-5min，用無菌水沖 洗4-6次，接種在1/2MS基本培養基中，暗培養3-5天，再轉到光照條件下培養20-30天 即可使用下胚軸進行愈傷組織誘導；培養溫度為26 士 1°C，光照強度為2100-22001X，光 照時間12-14h/d。
[0019] 所述方法中用到的培養基均附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH調至5. 4-5. 8。
[0020] 本發明主要過程包括：主要通過油桐下胚軸誘導愈傷組織、愈傷組織分化不定 芽、繼代培養、增殖培養、壯苗培養、生根培養、煉苗移栽。該方法對油桐下胚軸愈傷組織誘 導率高，愈傷組織再分化能力強，不定芽健壯有利于繼代培養，增殖系數高，壯苗效果 好，生根率高；不僅為快速繁殖大量優良油桐植株提供了一條新的技術途徑，而且為以后 通過基因工程的方法改良油桐抗性、培育抗病植株，提高油桐產量及油脂質量等性狀，以 及為油桐遺傳體系的建立打下基礎。這為油桐從傳統的育種方式向分子育種方向邁進提供 了可行性，為以后緩解生物能源短缺方面有著重要意義。
[0021] 此外，油桐離體組織培養的研究比較少見。本發明的詳細優勢總結如下：
[0022] 1、本發明采用的離體組織是下胚軸，是通過合子胚發育而來胚性器官，胚性較 強，具有很高的活力及分化再生能力，在植物遺傳體系轉化中有廣闊的前景；
[0023] 2、下胚軸在農桿菌侵染時的過程中不易死亡，以及在卡那霉素篩選中抗性較強， 有利于目的基因的介導、轉化和再生。目前，通過下胚軸獲得轉基因植株已有報道，轉基因 油菜就是通過農桿菌介導下胚軸成功獲得的，在木本植物柑橘中也通過農桿菌介導下胚 軸獲得了轉基因植株，而柑橘葉片再生體系已建立，但是通過農桿菌侵染葉片的過程中， 葉片容易死亡，此方法還不能得到柑橘轉基因植株。因此，下胚軸在植物遺產體系轉化過 程中是較好的選擇。本發明是在前人在其它植物研究過程中的到了啟發，選取油桐下胚軸 通過大量的試驗組合得到了油桐下胚軸高效再生體系建立的培養基配方，為油桐轉基因 植株的培育提供更有效的途徑。
[0024] 3、本發明通過油桐下胚軸誘導的不定芽無論從長勢、芽體長度、葉片數量、葉片顏 色、芽的粗度及質地等方面都要好于葉片誘導的不定芽（圖15-16)。由圖可知，葉片誘導 的不定芽雖然較密，芽體較多，但大部分芽畸形，沒有明顯的頂芽和莖，只長葉片，不利 于后期的繼代培養，因此，通過油桐下胚軸誘導的不定芽生長健壯，主莖明顯，能過克服 葉片誘導不定芽的不足，從而為油桐遺傳改良提供了更廣的途徑。
[0025] 4、試驗表明，用誘導葉片的培養基配方對下胚軸不定芽的誘導效果較差，主要原 因是不同器官組織所含的營養成分和內源激素的含量有所差異，因此，不同組織器官有合 適他們的最適宜培養基配方，下胚軸是通過合子胚發育而來的，具有胚性，細胞活性較 強，分化能力遠遠高于葉片和其他器官的分化能力。所以本發明重新考慮以下胚軸為外植 體，通過在高濃度的激素下誘導愈傷組織，然后轉接到愈傷組織分化不定芽的培養基中進 行不定芽的分化、繼代增殖、生根和煉苗移栽等過程，旨在建立一個新的高效穩定的油桐 下胚軸離體快繁體系和途徑，為油桐遺傳改良奠定基礎。關鍵還在于能夠大大提高農桿菌 浸染實現遺傳轉化的可能性。
[0026] 5、黃艷等人用油桐下胚軸進行愈傷組織及不定芽的誘導，雖然愈傷組織誘導率 可達100%，但后期分化的不定芽不利于繼代增殖，容易死亡，且誘導率較低，最高誘導 率僅為56%，不能實現油桐遺傳體系轉化。本發明前期采用該配方對油桐下胚軸進行誘 導，發現誘導出的不定芽大部分畸形，繼代過程榮慢慢死亡，不利于后期的繼代增殖培 養。本發明重新選擇適合木本植物培養的WPM培養基添加高濃度的6-BA，附加 KT和生長 素 NAA的不同組合快速誘導愈傷組織，等愈傷組織長出后及時轉接到不定芽誘導的培養基 中進行不定芽誘導，通過大量試驗得到了適合油桐下胚軸穩定高效的培養基配方，極大的 提高了愈傷組織分化率，更有利于后期的繼代增殖培養。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發明油桐下胚軸接種的照片；
[0028] 圖2為本發明油桐下胚軸誘導出愈傷組織的照片；
[0029] 圖3為本發明油桐下胚軸愈傷組織分化出不定芽初期的照片；
[0030] 圖4為本發明油桐下胚軸愈傷組織分化不定芽后的照片；
[0031] 圖5為本發明油桐下胚軸愈傷組織分化不定芽20d的照片；
[0032] 圖6為本發明油桐下胚軸愈傷組織分化不定芽15d的照片；
[0033] 圖7為本發明油桐下胚軸愈傷組織分化不定芽15d的照片；
[0034] 圖8為本發明不定芽繼代增殖培養初期的照片；
[0035] 圖9為本發明不定芽增殖培養后期的照片；
[0036] 圖10為本發明不定芽壯苗培養的照片；
[0037] 圖11為本發明不定芽生根培養的照片；
[0038] 圖12為本發明不定芽生根培養的照片；
[0039] 圖13為本發明生根后移栽的組培苗的照片；
[0040] 圖14為本發明移栽后成活的組培苗的照片；
[0041] 圖15為葉片誘導不定芽做對照；
[0042] 圖16為葉片誘導不定芽做對照。
【具體實施方式】
[0043] 以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。
[0044] 實施例1
[0045] 依次進行以下操作：
[0046] 1、選取成熟的油桐當年生種子，取除種皮，將種仁用自來水沖洗5_8min，然后浸 泡15-20h，中間換水3-4次，然后在超凈工作臺中用0. 1%的HgCl2消毒3-5min，用無菌 水沖洗4-6次，接種在1/2MS基本培養基中，暗培養5天，再轉到光照條件下培養25天， 下胚軸高度可達3-4cm，在無菌條件下切成長為0.5-lcm的小塊，按形態學頂端朝上的方 式接種在1?]\1培養基+5.〇-10.〇11^/16-84+1.〇11^/110'+0.111^/1隱4誘導愈傷組織，暗培 養3天后，再到光照條件下培養10天，最高誘導率可達100%。附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/ L，ρΗ5· 5。培養溫度為（26 士 1) °C，光照強度為2100-22001x，光照時間12-14h/d ;(見附 圖2)
[0047] 表1不同激素配比對油桐下胚軸愈傷組織誘導的效果影響
[0048]
【權利要求】
1. 油桐下胚軸愈傷組織誘導及高效再生植株的方法，其特征在于，包括以下步驟： 將油桐成熟胚在無菌條件下萌發30天的下胚軸，在無菌條件下切成長為0. 5-1. Ocm 的小塊，接種到WPM+5. O-Κλ 0mg/L6-BA+L Omg/L ΚΤ+0. lmg/L NAA的培養基中誘導愈傷 組織，暗培養3天后，轉到光照條件下培養10天；培養溫度為26 士 1°C，光照強度為 2100-22001X，光照時間12-14h/d ;然后經過不定芽分化、繼代增殖、壯苗和生根培養獲得 完整植株；最后進彳了煉苗、移栽。
2. 根據權利要求1所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導及高效再生植株的方法，其 特征在于，不定芽分化的具體過程如下：將下胚軸誘導的質地較好的愈傷組織接種到 WPM+0. 5-1. 0mg/L6-BA+0. 01-0. 05mg/L NAA+2. Omg/L GA3 的培養基中進行不定芽的分化培 養，暗培養1天后，轉到光照條件下培養25-30天；培養溫度為26 士 1°C，光照強度為 2100-22001x,光照時間 12-14h/d。
3. 根據權利要求1所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導及高效再生植株的方法，其特征 在于，繼代增殖培養的具體過程如下：將愈傷組織分化培養得到的健壯不定芽切下接種到 WPM+2. 0-3. Omg/L ΚΤ+0. 05mg/L IAA+2. Omg/L GA3的培養基中進行不定芽的增殖培養，暗 培養1天后，在光照條件下培養25-30天；培養溫度為26 士 1°C，光照強度為2100-22001X， 光照時間12_14h/d。
4. 根據權利要求1所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導及高效再生植株的方法，其 特征在于，壯苗培養的具體過程如下：將增殖培養得到的芽轉接到WPM+0. 5-1.0mg/L NAA+1. 0-2. Omg/L GA3的培養基中進行壯苗培養，暗培養1天后，在光照條件下培養15-20 天；培養溫度為26 士 1°C，光照強度為2100-22001x，光照時間12-14h/d。
5. 根據權利要求1所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導及高效再生植株的方法，其特征在 于，生根培養的具體過程如下：將壯苗培養獲得2-4cm的苗接到1/4MS+0. 1-0. 3mg/L IBA 的培養基中進行生根培養；培養溫度為26 士 1°C，暗培養3-5天，再轉到光照下培養5-7 天即可生根，光照強度為2100-22001x，光照時間12-14h/d。
6. 根據權利要求1所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導及高效再生植株的方法，其特征在 于，煉苗、移栽的具體過程如下： 將生根后的苗先在人工氣候箱中進行移栽前煉苗，煉苗保持空氣相對濕度為80%以 上，3-5天后從培養瓶中取出，洗凈根部培養基，移栽到營養杯中，基質為泥炭土 ：珍珠 巖：黃土 = 2:1:1，用薄膜蓋住營養杯口，保持恒定的氣候條件，兩周后取出薄膜，逐步 進行正常水肥管理。
7. 根據權利要求1-6任一項所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導及高效再生植株的方法， 其特征在于，不定芽分化的培養基為：1?]?+1.〇11^/16-84+0.0111^/1嫩4+2.〇11^/16八 3。
8. 根據權利要求1-6任一項所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導及高效再生植株的方法， 其特征在于，壯苗培養使用的培養基為：WPM+0. 5-1. 0mg/L NAA+2. 0mg/L GA3。
9. 根據權利要求1所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導及高效再生植株的方法，其特征在 于，下胚軸的獲得過程如下： 選取成熟的油桐當年生種子，取除種皮，將種仁用自來水沖洗5-8min，然后浸泡 15-20h，中間換水3-4次，然后在超凈工作臺中用0. 1%的HgCl2消毒3-5min，用無菌水沖 洗4-6次，接種在1/2MS基本培養基中，暗培養3-5天，再轉到光照條件下培養20-30天 即可使用下胚軸進行愈傷組織誘導；培養溫度為26 士 1°C，光照強度為2100-22001x，光 照時間12-14h/d。
10.根據權利要求1所述的油桐下胚軸愈傷組織誘導及高效再生植株的方法，其特征 在于，所述方法中用到的培養基均附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH調至5. 4-5. 8。
【文檔編號】A01H4/00GK104094848SQ201410326807
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月10日 優先權日:2014年7月10日
【發明者】譚曉風, 李澤, 張琳, 盧錕, 龍洪旭, 吳玲利, 林青, 呂佳斌 申請人:中南林業科技大學