一種與植物木質化相關的microRNA857及其相關生物材料與應用的制作方法

一種與植物木質化相關的microRNA857及其相關生物材料與應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種與植物木質化相關的microRNA857及其相關生物材料與應用。該應用為如下任一所述生物材料在降低植物木質化程度中的應用：(1)miR857；(2)miR857的編碼基因；(3)表達miR857的重組載體。本發明通過實驗證明，過量表達miR857導致莖干平均直徑減小和機械強度減弱，木質素含量降低。本發明為木本植物以及有關農作物木質化程度的改變等提供了更多的有效途徑。本發明為根據實際生產需要來培育木質素含量低的植物品種，提供了一種全新的并且簡單有效的方法。
【專利說明】-種與植物木質化相關的micr〇RNA857及其相關生物材料 與應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種與植物木質化相關的microRNA857及其 相關生物材料與應用。

【背景技術】
[0002] 植物的木質化與人類生活息息相關，木質化形成的木材是制漿造紙、建筑業以及 紡織業的原材料，在人類的生產和生活中起著重要的作用。木質化是木質素在特化細胞的 細胞壁中沉積的過程，如木質部導管分子和厚壁組織細胞壁的加厚等，在維持植物正常結 構、輸導水分和養料、防御機體不受病原菌侵害方面發揮著重要的作用。其中，木質素是植 物體內比重僅次于纖維素的高分子化合物，與某些農藝形狀和實際生產密切相關。譬如，木 質素的含量和組分與作物的抗倒伏相關；作為黏合劑和各種添加劑已廣泛應用于化學工業 中；木質素具有高熱能，分子中的碳氫含量高達70-80%，其內蘊含豐富的能量，將來可能 作為燃料替代品等。然而，木質素的存在也會產生一些負面效應，例如它是造紙工業廢水污 染產生的主要源頭物質，飼料植物中木質素含量及單體分布比例直接影響到牲畜的消化和 吸收等。因此，利用分子生物學手段根據實際需要調控木質素的含量，進而改變植物的木質 化程度，具有潛在的應用前景。
[0003] MicroRNA(miRNA)是一類內源的長約20?24核苷酸的非編碼RNA，它是一類新 型的調控基因表達的小分子RNA。miRNA通過與靶基因 mRNA分子互補配對來識別并指導 靶基因的切割或抑制靶基因的翻譯等方式，特異地對靶基因進行轉錄后調控，從而調節真 核生物的生長發育。近年來，研究人員發現miRNAs幾乎參與了植物生長發育的所有重要 過程，包括調控植物器官的發生發育（Yoon et al.，2010;Vidal et al.，2010;Wang et al. ,2011)、參與激素應答途徑（Gutierrez et al.，2009;Yoon et al.，2010;Navar;ro et al.，Scho_er et al·，2008)、參與逆境響應途徑（Navarro et al·，2006 ;Zhao et al·，2007)、參與對營養元素吸收的調控（Zhao et al·，2011 ;Kawashima et al·，2009; Bari et al.，2006)及其對自身合成代謝的反饋調節（Rajagopalan et al.2006)等。此 夕卜，大量miRNA的靶基因是編碼轉錄因子的蛋白（Jones-Rhoades et al.，2006)。
[0004] 以上實例均表明miRNA在基因表達調控中的發揮了重要的作用。如果能夠利用 miRNA這種新型的調控分子來研究植物木質化過程及其生物學特性，對于改良植物中木材 性狀以及改變木材生長量具有十分重要的意義。然而，到目前為止，關于miRNA參與對植物 木質化調控的研究未見報道。


【發明內容】

[0005] 本發明的一個目的是提供一種與植物木質化程度相關的micr〇RNA857及其相關 生物材料在降低植物木質化程度中的應用。
[0006] 本發明所提供的應用為如下任一所述生物材料在降低植物木質化程度中的應用 或在抑制植物中LAC7基因轉錄中的應用：
[0007] (l)miR857 ；
[0008] (2)miR857 的編碼基因；
[0009] (3)表達miR857的重組載體。
[0010] 上述應用中，所述miR857的序列如SEQ ID No. 2所示；
[0011] 上述應用中，所述miR857的編碼基因的序列如SEQ ID No. 1所示；
[0012] 上述應用中，所述表達miR857的重組載體是將SEQ ID No. 1所示DNA插入植物表 達載體的多克隆位點得到的。
[0013] 上述應用中，所述降低植物木質化程度為降低植物莖干的木質化程度。
[0014] 上述應用中，所述降低植物木質化程度體現在如下方面中的至少一種：
[0015] (1)降低木質素含量；
[0016] (2)降低植物莖干的機械強度；
[0017] (3)降低植物莖干的直徑；
[0018] (4)降低植物莖干的鮮重；
[0019] (5)降低厚壁細胞占植物莖干橫切面的比例；
[0020] (6)降低植物單個維管束中木質細胞的數目；
[0021] (7)使植物木質部細胞排列更加松散。
[0022] 上述應用中，所述植物為草本植物或木本植物；所述草本植物具體為擬南芥。
[0023] 本發明的另一個目的是提供一種構建轉基因植物的方法。
[0024] 本發明所提供的構建轉基因植物的方法，包括如下步驟：使受體植物中過表達 miR857,得到木質化程度低于所述受體植物的轉基因植物。
[0025] 上述方法中，所述使受體植物中過表達miR857的方法為：向受體植物中導入 miR857的編碼基因。
[0026] 上述方法中，所述木質化程度為植物莖干的木質化程度。
[0027] 上述方法中，所述木質化程度體現在如下方面中的至少一種：
[0028] (1)木質素含量；
[0029] (2)植物莖干的機械強度；
[0030] ⑶植物莖干的直徑；
[0031] (4)植物莖干的鮮重；
[0032] (5)厚壁細胞占植物莖干橫切面的比例；
[0033] (6)植物單個維管束中木質細胞的數目；
[0034] (7)植物木質部細胞排列狀況。
[0035] 上述方法中，所述植物為草本植物或木本植物；所述草本植物具體為擬南芥。
[0036] 本發明通過實驗證明，過量表達miR857導致莖干平均直徑減小和機械強度減弱， 木質素含量降低。本發明為木本植物以及有關農作物木質化程度的改變等提供了更多的有 效途徑。本發明為根據實際生產需要來培育木質素含量低的植物品種，提供了一種全新的 并且簡單有效的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1為AtMIR857基因 PCR擴增產物的電泳鑒定。
[0038] 圖2為重組質粒pBI121-35S-miR857載體示意圖。
[0039] 圖3為35S:MIR857過表達植株中靶基因 AtLAC7的轉錄水平的表達。
[0040] 圖4為35S:MIR857過表達植株木質素含量測定。
[0041] 圖5為35S:MIR857過表達植株木質化特性分析圖。
[0042] 圖6為35S:MIR857過表達植株莖部解剖結構圖。

【具體實施方式】
[0043] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0044] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0045] 實施例1 :植物表達載體pBI121-35S-miR857的構建。
[0046] 1、DNA的提取。采用CTAB法提取野生型擬南芥的基因組DNA。
[0047] 2、引物的設計。在上下游引物的5'端分別引入BamH I和EcoR I的酶切位點（下 劃線）以及保護堿基。引物序列如下：
[0048] miR857-F: 5' -GCGGATCCTTCGACTCCTACAACAAACTTTC-3' ；
[0049] miR857-R: 5' ~GCGAATTCTCCGATTCCTACAATACACCTTC~3,。
[0050] 3、目的基因的擴增。以野生型擬南芥基因組DNA為模版，采用miR857-F和 miR857-R進行PCR擴增，得到長度為377bp的目的基因片段。
[0051] PCR反應結束后，取2 μ L反應液進行2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產物，擴增出 的約377bp的AtMIR857基因特異條帶如圖1所示。PCR產物回收連入Τ載體后測序，結果 正確。
[0052] 4、載體的構建。用限制性內切酶BamH I和EcoR I對表達載體pBI121和上述PCR 純化產物分別進行雙酶切，連接，得到重組表達載體pBI121-35S-miR857，
[0053] 圖2為重組質粒pBI121-35S-miR857的構建示意圖。測序表明，連入pBI121的基 因序列如SEQ ID No. 1所示。該載體在植物體內表達的產物為miR857，miR857序列如SEQ ID No. 2 所示。
[0054] 實施例2 :轉基因植株的獲得及Real-time PCR分析
[0055] -、農桿菌介導的浸花法轉化擬南芥。
[0056] 將構建好的重組質粒轉化到農桿菌GV3101中，采用活體植株農桿菌浸花法進行 轉化，通過農桿菌浸染野生型擬南芥植株，將目的片段插入到擬南芥基因組DNA中。具體步 驟如下：
[0057] 1、挑取農桿菌單菌落接種到5-10mL含抗生素（Rif+Gen+Kan)的LB液體培養基 中，在28°C、250rpm條件下，振蕩培養至對數生長晚期。
[0058] 2、以1:50比例轉接至新鮮的抗生素（Rif+Gen+Kan)LB液體培養基中，同樣條件下 培養至00600為1-2左右。6000印111離心收集菌體，用5%蔗糖洗兩遍，然后用適量浸花液 (5%蔗糖，0· 02% silwet L-77)重懸到 0D600 為 0· 8。
[0059] 3、選取四周左右剛開花的擬南芥植株，剪去果莢，然后將整個花序浸泡在上述浸 花液中15s，同時不停攪動。
[0060] 4、農桿菌浸染后的擬南芥放于陰暗環境下保濕培養24h，然后將擬南芥移到培養 室中正常培養，7d后再浸泡轉化一次。
[0061] 二、轉基因植株篩選
[0062] 1、將收獲成熟的種子放到10mL的離心管中，加入5mL消毒液[0. 5 % (v/v) NaClO+O.Ol% (v/v)Triton X-100]表面消毒 10_15min，期間不停顛倒混勻。
[0063] 2、倒掉消毒液，加入5mL滅菌水，洗3-4次。
[0064] 3、將消毒好的種子鋪到含有卡那霉素（50 μ g/mL)的1/2MS固體平板上。
[0065] 4、將平板在4°C低溫處理3d，然后轉移到培養箱中培養。培養條件為：22°C，16h光 照/8h黑暗。
[0066] 5、挑取抗性植株移入土中繼續培養。
[0067] 6、采用CTAB法從轉基因植株的葉片中提取DNA。
[0068] 7、以轉基因植株葉片的基因組DNA為模板，以野生型擬南芥基因組DNA為陰性對 照，以pBI121-35S-miR857重組質粒為陽性對照，以質粒上35S啟動子的5'端為上游引物， 以AtMIR857基因的3'端為下游引物分別進行PCR擴增，進行陽性轉基因植株的鑒定。引 物如下：
[0069] F :5, -AGGCCATGGAGTCAAGATTCAAATAGAGG-3,；
[0070] R : 5 ' -GCGAATTCTCCGATTCCTACAATACACCTTC-3 '。
[0071] 此后，將T1代種子進行篩選，獲得純合體植株。
[0072] 三、靶基因 AtLAC7轉錄水平表達量的檢測。
[0073] 提取純合體植株的RNA，進行反轉錄獲得cDNA。以所獲得的cDNA為模板，采用 LAC7qPCR_F 和 LAC7qPCR_R 引物，通過 Real-time PCR 檢測 miR857 靶基因 AtLAC7 轉錄水平 表達量的變化。引物序列如下：
[0074] LAC7qPCR-F:5,-GCAATCCCGTAACACTTTGGCTGTCCC-3,；
[0075] LAC7qPCR-R: 5 ' -GCTATTATTGTTGTTTATGCATGAAAC-3 '。
[0076] 分析方法采用比較CT法，以Tubulin作為內參基因，未經處理的野生型樣品作為 對照。通過2- Λ Λ CT法計算AtLAC7基因表達量變化差異。各基因表達量用均值土標 準差表示。結果顯示，轉基因植株中，靶基因 AtLAC7轉錄水平表達量與野生型相比下降了 40% (圖 3)。靶基因 AtLAC7 的 genbank 號為 AT3G09220。基因 AtLAC7 是編碼 genbank 號 為NP_187533. 1的蛋白序列。
[0077] 實施例3 :轉基因植株木質素含量的測定。
[0078] 利用傅里葉紅外光譜測定轉基因植株和野生型中木質素的含量，取生長6周的擬 南芥莖部組織，先用PBS洗滌3次，再用雙蒸水洗滌3次。置于BaF2晶片上，室溫干燥。采 用MAGNA750FTIR光譜儀進行紅外光譜分析，并配備同一公司的顯微鏡，MCT檢測器，光譜分 辨率8CHT 1，掃描次數為128次，代表木質素的吸收峰大約在1356CHT1處。通過統計1356CHT1 處的吸收光譜表明，轉基因植株的木質素含量低于野生型，（圖4A為野生型植株的光譜圖， 圖4B是轉基因植株的光譜圖，而圖4C是轉基因植株的光譜圖與野生型光譜圖之間的差譜 圖，峰值在橫坐標以下可以反映轉基因植株的木質素含量低于野生型）。
[0079] 實施例4 :轉基因植株木質化特性的測定。
[0080] 用電子萬能材料試驗機來測定生長6周左右的擬南芥莖部的機械強度。用拉伸氣 動夾具來測定其莖部的力學性能，測力計的基本參數為500N和5N。用掃描儀和統計分析軟 件得到莖部的平均直徑和高度。通過萬分之一天平稱重得到莖部的平均鮮重。
[0081] 結果表明：與野生型相比，植株的高度變化不大，但轉基因植株莖干的機械強度顯 著降低，莖干的平均直徑和鮮重也有所減小（圖5)。
[0082] 實施例5 :轉基因植株解剖結構的觀察。
[0083] 鑒于轉基因植株的木質化的相關參數有所變化，我們通過進行半薄切片對其解剖 結構進行了觀察，步驟如下：
[0084] 1、配制2. 5%戊二醛固定液（pH7. 0磷酸緩沖液），分別選取生長6周的野生型和 過表達擬南芥相同部位的莖段和根段，投入固定液中，用真空泵抽氣，4°C放置過夜。
[0085] 2、在緩沖液中清洗 3 次，每次 lOmin，依次經：30%、50%、60%、70%、80%、90%、 95 %、100 %、100 %系列乙醇脫水，每級20min。
[0086] 3、材料依次經：無水乙醇：L. R. White樹脂比例為2:1、無水乙醇：L. R. White樹脂 比例為1:1和無水乙醇：L. R. White樹脂比例為1:2,每級3h。最后在純L. R. White樹脂中 滲透ld，期間更換1次。
[0087] 4、6〇°C 烘箱包埋 24h。
[0088] 5、取L. R. White包埋后的組織塊于超薄切片機上，切取厚度為1 μ m的半薄切片， 將其移到加水滴的載玻片上，然后于烘片機上加熱烘干。
[0089] 6、將1 %硼砂甲苯胺藍染液滴在切片上，約0.5min左右，用洗瓶沖洗切片上多余 的染液，濾紙吸干水分，自然干燥，即可鏡檢。
[0090] 結果顯示，與野生型相比，轉基因植株的厚壁組織細胞面積明顯減少（圖6A)，在 野生型中厚壁組織所占莖部橫切面總面積的 21. 3%，而轉基因植株中厚壁組織僅占莖部橫 切面總面積的13.9% (圖6B)。進一步的觀察發現，與野生型相比，轉基因植株的木質部細 胞排列更為松散（圖6A)，次生木質部細胞數目較少（圖6C)。
【權利要求】
1. 如下任一所述生物材料在降低植物木質化程度中的應用： (1) miR857 ； (2) miR857的編碼基因； (3) 表達miR857的重組載體。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述miR857的序列如SEQ ID No. 2所示； 所述miR857的編碼基因的序列如SEQ ID No. 1所示； 所述表達miR857的重組載體是將SEQ ID No. 1所示DNA插入植物表達載體的多克隆 位點得到的。
3. 根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于：所述降低植物木質化程度為降低植 物莖干的木質化程度。
4. 根據權利要求1-3任一所述的應用，其特征在于，所述降低植物木質化程度體現在 如下方面中的至少一種： (1) 降低木質素含量； (2) 降低植物莖干的機械強度； (3) 降低植物莖干的直徑； (4) 降低植物莖干的鮮重； (5) 降低厚壁細胞占植物莖干橫切面的比例； (6) 降低植物單個維管束中木質細胞的數目； (7) 使植物木質部細胞排列更加松散。
5. 根據權利要求1-4任一所述的應用，其特征在于：所述植物為草本植物或木本植物； 所述草本植物具體為擬南芥。
6. -種構建轉基因植物的方法，包括如下步驟：使受體植物中過表達miR857,得到木 質化程度低于所述受體植物的轉基因植物。
7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述使受體植物中過表達miR857的方法 為：向受體植物中導入miR857的編碼基因。
8. 根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述木質化程度為植物莖干的木質 化程度。
9. 根據權利要求6-8任一所述的方法，其特征在于：所述木質化程度體現在如下方面 中的至少一種： (1) 木質素含量； (2) 植物莖干的機械強度； (3) 植物莖干的直徑； (4) 植物莖干的鮮重； (5) 厚壁細胞占植物莖干橫切面的比例； (6) 植物單個維管束中木質細胞的數目； (7) 植物木質部細胞排列狀況。
10. 根據權利要求6-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物為草本植物或木本植 物；所述草本植物具體為擬南芥。
【文檔編號】A01H5/00GK104232639SQ201410309033
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月1日 優先權日:2014年7月1日
【發明者】林金星, 趙媛媛, 林森 申請人:北京林業大學