綠豆尾孢菌葉斑病的抗病性快速鑒定方法
【專利摘要】本發明公開了一種綠豆尾孢菌葉斑病的抗病性快速鑒定方法，該方法為將綠豆種子進行表面消毒，將表面消毒后的綠豆種子點播到培養盤內；光照黑暗交替下培養，并定期觀察綠豆苗生長情況；采集綠豆兩葉一心期的葉片，清水洗凈后放吸水紙上，并與吸水紙放入盒中保持濕潤，在葉片上用牙簽造成小傷口并接種6mm的菌餅，在溫室條件下光照，觀察其發病情況，本發明的鑒定體系是在培養室中觀察發病情況。已有的觀察和研究表明，病原菌的活動受到溫度、光照等環境因素的影響。由于培養室的環境條件較穩定，加之本發明的鑒定體系本身是一個完全封閉的系統，使得鑒定結果的重復性和可靠性得到保證。
【專利說明】綠豆尾孢菌葉斑病的抗病性快速鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及農業-植物保護【技術領域】，具體地指一種綠豆尾孢菌葉斑病的抗病性 快速鑒定方法。
【背景技術】
[0002] 綠豆尾孢菌葉斑病由變灰尾孢菌（Cercospora canescens)引起，主要侵染葉片， 嚴重時也浸染莖和莢，在生長季碰到高濕天氣尤為盛行。綠豆尾孢菌葉斑病是綠豆生產上 的毀滅性病害，發病初期葉片上出現水漬狀褐色小點，擴展后形成邊緣紅褐色至紅棕色、中 間淺灰色至淺褐色的近圓形病斑。濕度大時，病斑上密生灰色霉層，病情嚴重時，病斑融合 成片，很快干枯。輕者減產20-50 %，嚴重的高達90 %以上。
[0003] 目前對于綠豆尾孢菌葉斑病的防治主要是化學藥劑防治。培育抗病品種是控制該 病最有效的方法之一，而建立快速簡便的抗性鑒定體系是進行綠豆尾孢菌葉斑病抗病育種 的關鍵。
[0004] 由于該病菌的分離培養和產孢比較困難，而品種抗病性鑒定研究需要大量菌源， 因此給綠豆抗病品種的鑒定和篩選帶來了一定困難，相關的研究報道也較少。
【發明內容】
[0005] 本發明目的在于針對綠豆抗病育種的特點和現有技術的不足，建立一種室內可重 復、快速準確鑒定綠豆品種對尾孢菌葉斑病抗性的方法。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明提供的一種綠豆尾孢菌葉斑病的抗病性快速鑒定方 法，包括以下步驟：
[0007] 1)挑選顆粒飽滿，大小相似的綠豆種子進行表面消毒，備用；
[0008] 2)將培養土裝袋后進行高壓滅菌，滅菌后的有機培養土分裝到培養盤內，將表面 消毒后的綠豆種子點播到培養盤內；光照黑暗交替下培養，并定期觀察綠豆苗生長情況；
[0009] 3)將尾孢菌菌株在V8果蔬汁培養基平板上，并將平板置于28°C恒溫培養箱中活 化7天，再用無菌的、直徑6_的打孔器在活化好的菌種菌落生長邊緣打孔，將菌絲面扣在 新的V8蔬菜汁培養基中進行擴大繁殖，以備接種。
[0010] 4)采集綠豆兩葉一心期的葉片，清水洗凈后放吸水紙上，并與吸水紙放入盒中保 持濕潤，在葉片上用牙簽造成小傷口并接種6mm的菌餅，在溫室條件下光照，讓葉子發病； 一個品種做4個重復，每個重復3片葉子，一組對照。
[0011] 5)觀察其發病情況，接菌7d后，測量葉片病斑大小，根據病斑大小，進行分級，計 算病情指數；其中〇級：無可見侵染病斑；1級：葉片上僅有小點狀病斑，直徑2mm以下；2 級：病斑直徑3_以下，邊緣褐色；3級：直徑3?6_以上的中型斑，邊緣褐色，中央有灰白 色壞死組織；4級：直徑6_以上的不規則型病斑，其中0、1級屬于抗病型，記以R，2級屬于 中間型，記以1，3、4級屬感病型，記以S。
[0012] 作為優選方案，所述步驟1)中，先用體積分數為75%的酒精消毒2s，然后用質量 分數1 %的NaCIO溶液消毒3min，最后無菌水洗3次。
[0013] 作為優選方案，所述步驟3)中，V8果蔬汁培養基包括V8果蔬汁：200mL/L、CaC03 : 3g/L、瓊脂：20g/L。
[0014] 本發明的有益效果在于：
[0015] 1、本發明能直接觀察綠豆苗的發病情況
[0016] 2、本發明可在較短時間內連續鑒定較大數量的綠豆苗，有利于大規模篩選綠豆尾 孢菌葉斑病抗病種苗
[0017] 3、本發明的鑒定體系是在培養室中觀察發病情況。已有的觀察和研究表明，病原 菌的活動受到溫度、光照等環境因素的影響。由于培養室的環境條件較穩定，加之本發明的 鑒定體系本身是一個完全封閉的系統，使得鑒定結果的重復性和可靠性得到保證。
[0018] 4、本發明綠豆尾孢菌葉斑病抗病鑒定時容易進行人工控制，滿足不同試驗需要。
[0019] 5、本發明明確綠豆種子質量對于綠豆葉斑病的抗性，是綠豆抗葉斑病的前提條 件，為抗病親本選擇提供依據。選育抗尾孢菌葉斑病的綠豆品種資源是最經濟有效地方法。 本發明為了從根本上減少尾孢菌葉斑病對綠豆產量和質量的損失，從抗病育種的角度基于 豆類葉斑病現有的抗性鑒定方法，研究通過菌絲塊接種離體葉片，旨在建立一種室內可重 復、快速準確鑒定綠豆品種對尾孢菌葉斑病抗性的方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1為灰尾孢高粱產孢形態圖；
[0021] 圖2為V8果蔬汁培養灰尾孢形態圖（扇變）；
[0022] 圖3為不同品種離體葉片室內抗病性測定結果圖。
【具體實施方式】
[0023] 為了更好地解釋本發明，以下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但 本發明的內容不僅僅局限于以下實施例。
[0024] 1、V8果蔬汁培養基配料及制作方法：
[0025] V8果蔬汁培養基配料：100%的蕃茄、胡蘿卜、甜菜、菠菜、生菜、西芹、西洋菜 (watercress)及洋堯茜8種田園蔬菜汁。購買品牌：金寶Campbell's。
[0026] 固體V8果蔬汁培養基配料及制作方法：每升培養基中含有V8果蔬汁：200mL、 CaC03 :3g、瓊脂：15?20g。將各個材料按照比例分裝到250mL的三角瓶中，用lmol/L氫氧 化鈉調節pH值在6. 5?7. 0之間，滅菌后使用。
[0027] 液體V8果蔬汁培養基配料及制作方法：按照每升培養基中含有V8果蔬汁： 200mL、CaC0 3 :3g的比例加入到250mL三角瓶中，調節pH值到6. 5?7. 0之間，封口滅菌后 使用。
[0028] 2、病原菌分離和培養
[0029] 2. 1材料與設備
[0030] 從田間采集到的具有典型灰斑病癥狀的發病綠豆病葉，攜帶回實驗室進行病原菌 的分離。共長嶺縣、公主嶺市、鎮賚縣、通榆縣、前郭縣和洮南市等六個地方采集了葉斑病的 標樣。
[0031] 配置好的體積分數為：75%的乙醇溶液、質量分數為1%的次氯酸鈉溶液、摩爾濃 度為：lmol/L的氫氧化鈉溶液；
[0032] 滅過菌的純水、V8蔬菜汁、燕麥片、新鮮的番茄、高粱米、瓊脂、碳酸鈣等；
[0033] 250mL三角瓶、50mL三角瓶、培養皿、燒杯、剪刀、鑷子、玻璃棒等。
[0034] 2. 2方法步驟
[0035] 選取發病葉片，按常規組織分離法對發病的綠豆葉片進行單病斑分離：
[0036] a.將從田間采集的發病葉片輕輕的沖洗干凈，選取病健交界的組織切成 3mm X 3mm的小塊；
[0037] b.表面消毒：用鑷子夾住剪好的小葉片在75 %乙醇溶液中浸泡2?3s，再用1% 次氯酸鈉消毒3min，后用滅菌水沖洗3次；
[0038] c.將表面消毒過的葉片放置于倒好的V8固體培養基平板上，在28°C條件下培養。
[0039] d.根據菌落顏色、形態，將不同的菌落挑出，在V8培養基上轉接再純化1?3次， 純化后的菌株在V8果蔬汁培養基平板上28 °C培養。
[0040] 2. 3病原菌形態
[0041] 灰尾孢引起的葉斑病斑點生于葉片的正反兩面，近圓形或不規則形，葉片斑點紅 褐色至暗褐色，或中央淺褐色，邊緣暗褐色，葉背面斑點淺褐色或者淺灰褐色。在V8液體培 養基中接菌，搖菌20天后觀察孢子形態：分生孢子鞭形或蠕蟲形，無色，有3-5?12個隔 膜，基部截形，頂端略尖，直或稍彎（圖1)。這一觀察結果與郭英蘭描述的寄生在豆科植物 上的尾孢菌基本一致，故確認綠豆葉斑病的病原菌為尾孢菌。
[0042] 灰尾孢在培養過程中由于高頻率的變異和基因重組而發生形態上可辨識的表現 型分離時，可出現扇形菌落（圖2)。
[0043] 3、室內與田間的抗病性測定
[0044] 將綠玉翡翠、綠珍珠、十八羅漢、中綠一號等4個品種為實驗材料，采集兩葉一心 期的葉片，用自來水洗凈備用，將塑料箱鋪上適量的吸水紙，用小噴壺均勻噴上一層水于紙 上便于保濕。用直徑6mm的打孔器在V8培養基上的菌絲前沿取菌絲塊，在每片葉片的正面 中部稍偏葉脈部位用牙簽造成小傷口后，接種菌絲塊，將有菌絲面朝下貼著葉片的表面。用 保險膜蒙在塑料箱上有利于保濕條件，放入溫室25°C條件下光照保濕培養。每個品種4個 重復，每個重復3次。接種病原菌后7d，按照0-4級的病害評價等級對綠豆苗進行病害等級 鑒定。
[0045] 其中0級：無可見侵染病斑；1級：葉片上僅有小點狀病斑，直徑2mm以下；2級：病 斑直徑3mm以下，邊緣褐色；3級：直徑3?6mm以上的中型斑，邊緣褐色，中央有灰白色壞 死組織；4級：直徑6mm以上的不規則型病斑。其中0、1級屬于抗病型，記以R(Resistant)， 2級屬于中間型，記以I (Intermediate)，3、4級屬感病型，記以S(Susceptible)。鑒定結果 見表1和圖3。
[0046] 表14個綠豆品種的抗病性結果
[0047]
【權利要求】
1. 一種綠豆尾孢菌葉斑病的抗病性快速鑒定方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 挑選顆粒飽滿，大小相似的綠豆種子進行表面消毒，備用； 2) 將培養土裝袋后進行高壓滅菌，滅菌后的有機培養土分裝到培養盤內，將表面消毒 后的綠豆種子點播到培養盤內；光照黑暗交替下培養，并定期觀察綠豆苗生長情況； 3) 將尾孢菌菌株在V8果蔬汁培養基平板上，并將平板置于28°C恒溫培養箱中活化7 天，再用無菌的、直徑6_的打孔器在活化好的菌種菌落生長邊緣打孔，將菌絲面扣在新的 V8果蔬汁培養基中進行擴大繁殖，以備接種； 4) 采集綠豆兩葉一心期的葉片，清水洗凈后放吸水紙上，并與吸水紙放入盒中保持濕 潤，在葉片上用牙簽造成小傷口并接種6_的菌餅，在溫室條件下光照； 5) 觀察其發病情況，接菌7d后，測量葉片病斑大小，根據病斑大小，進行分級，計算病 情指數；其中〇級：無可見侵染病斑；1級：葉片上僅有小點狀病斑，直徑2_以下；2級：病 斑直徑3mm以下，邊緣褐色；3級：直徑3?6mm以上的中型斑，邊緣褐色，中央有灰白色壞 死組織；4級：直徑6mm以上的不規則型病斑，其中0、1級屬于抗病型，記以R，2級屬于中間 型，記以1，3、4級屬感病型，記以S。
2. 根據權利要求1所述的綠豆尾孢菌葉斑病的抗病性快速鑒定方法，其特征在于：所 述步驟1)中，先用體積分數為75%的酒精消毒2s，然后用質量分數1 %的NaCIO溶液消毒 3min，最后無菌水洗3次。
3. 根據權利要求1或2所述的綠豆尾孢菌葉斑病的抗病性快速鑒定方法，其特征在于： 所述步驟3)中，V8果蔬汁培養基包括V8果蔬汁：200ml/L、CaC0 3 :3g/L、瓊脂：20g/L。
【文檔編號】A01G7/00GK104094837SQ201410276784
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月20日 優先權日:2014年6月20日
【發明者】劉昌燕, 焦春海, 肖炎農, 吳小微, 萬正煌, 仲建鋒, 李莉 申請人:湖北省農業科學院糧食作物研究所