一種茄子花藥培養獲得單倍體再生植株的方法
【專利摘要】本發明涉及一種茄子花藥培養獲得單倍體植株的方法，屬于農業【技術領域】。本發明通過鑒定花粉發育時期，選取花蕾，花蕾消毒，花藥接種、預處理，花藥培養，誘導愈傷組織再分化為單倍體植株。本發明確定了花粉發育時期，外在形態學標記。本發明采用固體培養基將小孢子和花藥壁共培養，低溫、熱激預處理，愈傷誘導和分化培養基成分和培養條件調節，提高了愈傷誘導頻率和愈傷組織的分化能力。應用此方法進行茄子花藥培養，愈傷誘導率60％以上，出苗率80％以上，解決了茄子花藥培養誘導率低的難題。本發明可以獲得單倍體植株，出苗率高，若應用于育種實踐，可加快育種步伐，為新品種選育提供有力的手段。
【專利說明】
【技術領域】：
[0001] 本發明屬農業領域，具體涉及一種茄子花藥培養獲得單倍體再生植株的方法。 一種茄子花藥培養獲得單倍體再生植株的方法 技術背景：
[0002] 花藥培養，是適宜條件下離體花藥培養成單倍體植株的組織培養技術，是單細胞 水平上獲得純系的有效方法，是重要的育種輔助手段。茄子是重要茄科蔬菜作物之一，發展 茄子生產，尋求具有抗性、優質、高產等優良性狀的品種具有重要理論和實踐意義。茄子雜 交優勢十分顯著，在品種改良上發揮了重要作用；而未被利用的茄子種質材料日益減少，種 質資源匱乏，且常規育種手段時間長、工作量大、效率低；應用花藥培養技術獲得單倍體植 株，可克服雜種性狀的分離，短時間固定和分析雜種植株的新遺傳組合；經染色體加倍后， 得到基因位點純合的新品系，精確、快速創造新種質。常規育種獲得遺傳穩定自交系一般需 要5?8年，而花藥培養只需1?2年，省去多代自交的繁瑣過程，且避免了優質基因的丟 失；花藥培養用于茄子育種實踐中，大大縮短育種周期，開辟了一條新品種選育的新途徑。
[0003] 茄子花藥培養有諸多優點，但由于花粉發育時期選擇、花藥培養組織褐化、愈傷組 織誘導及分化頻率低等因素，誘導率極低，重復性操作不強，目前仍未能應用于茄子育種。
【發明內容】
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[0004] 本發明目的在于針對【背景技術】提出的茄子花藥培養效率低問題，提供一種茄子花 藥培養方法，獲得單倍體再生植株。
[0005] 本發明的目的通過以下技術方案實現：
[0006] -種茄子花藥培養獲得單倍體再生植株的方法，包括以下步驟：
[0007] ⑴取花粉發育處于單核中后期的花藥；
[0008] ⑵接種至預處理培養基上，預處理；
[0009] ⑶將預處理后的花藥，在24°C?28°C條件下暗培養6?7d至花藥頂端出現黃 白色組織后，轉接至愈傷組織誘導培養基，在晝溫25±1°C /夜溫22±1°C、光照2000? 3000LX、光周期14h ?(Γ1條件下培養12?16天后，轉接至增殖培養基上繼續培養至愈傷組 織直徑為〇. 4?0. 6cm ;
[0010] ⑷將直徑為〇. 4?0. 6cm的愈傷組織轉接至1/2B5分化培養基，在晝溫25± 1°C / 夜溫22± 1°C、光照3000?4000LX、光周期16h ?(Γ1條件下分化培養至愈傷組織直徑為1? 2cm，然后轉接至Β5分化培養基繼續培育獲得再生植株；
[0011] (5)移栽。
[0012] 所述的預處理培養基為 MS+0. lmg · L 1 ?0· 2mg · L 4-D+O. 5mg · L 1 ? 1. Omg · L-1KT+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%瓊月旨，ρΗ5· 8 ?6。
[0013] 所述預處理的過程為：置于4°C暗處理45?50h ;后移至36°C處理120?150h。
[0014] 所述的愈傷組織誘導培養基為MS+0. 2mg · Γ1?0. 25mg · Ll, 4-D+l. Omg · Γ1? 2.0mg · 1^0+2%?3%蔗糖+0.6%?0.8%瓊脂，ρΗ5·8?6 ;所述的增殖培養基為 MS+O. lmg · L 1 ?0· 25mg · L 工2, 4-D+2. Omg · L 1 ?3. Omg · L % ?3 % 鹿糖 +0· 6 % ? 0· 8%瓊脂，ρΗ5· 8 ?6。
[0015] 所述的 1/2Β5 分化培養基為 1/2Β5+0· Olmg · Γ1 ?0· 02mg · L^NAA+t Omg · Γ1 ? 6. Omg · L iT+l· Omg · L 1 ?5. Omg · L WcC 維生素 C)+2 % ?3 % 鹿糖 +0· 6 % ?0· 8 % 瓊 月旨，ρΗ5· 8 ?6 ;所述的 B5 分化培養基為 Β5+0· Olmg · L 1 ?0· 02mg · L iNAA+e. Omg · L 1 ? 8. Omg · L ^Τ+δ. Omg · L 1 ?10. Omg · L 40+2% ?3%鹿糖 +0· 6% ?0· 8%瓊月旨，ρΗ5· 8 ? 6。
[0016] 本發明所述培養基中蔗糖和瓊脂的濃度單位為質量百分比。
[0017] 步驟（5)中所述移栽的過程為：提前2d打開瓶蓋，然后取出再生植株，洗凈培養 基，50 %多菌靈可濕性粉劑1000倍液浸泡，晾干后移植于裝有滅菌蛭石和珍珠巖（體積比 2:1)的穴盤；置于育苗棚內馴化30?35d后定植于棚室。
[0018] 步驟（1)中所述單核中后期花藥的取出過程為：植株盛花期于晴天上午9:00? 11:00采集花蕾，醋酸洋紅染色壓片法鏡檢鑒定花粉發育時期，選取處于單核中后期花蕾； 花蕾消毒：花蕾洗滌靈清洗，流水沖洗20?30min;然后依次用75 % (體積百分比）乙醇溶 液浸0. 5min，6. 5 %次氯酸鈉溶液（取市售次氯酸鈉分析純6. 5ml加水定容至100ml)消毒 15min，最后用無菌水沖洗3?4次；無菌條件下，將花藥從花蕾中完整剝離、取出。
[0019] 本發明方法的最優選技術方案為：
[0020] ⑴取花粉發育處于單核中后期的花藥
[0021] 取材：植株盛花期，于晴天上午9:00?11:00,選取對茄、四門斗或八面風花蕾；醋 酸洋紅染色壓片法鏡檢選取花粉發育時期處于單核中后期的花蕾；適宜生長環境條件下花 芽分化后24?26d，即開花前6?8d花蕾。選取對茄、四門斗、八面風等生長活躍部位、花 藥活力旺盛、花粉發育至單核中后期的花蕾，提高愈傷誘導頻率。
[0022] 消毒：花蕾洗滌靈清洗，流水沖洗20?30min ;超凈工作臺內，用75%的乙醇表面 消毒0. 5min，然后用6. 5%的次氯酸鈉溶液消毒15min，最后用無菌水沖洗3?4次，每次 5min ;無菌條件下，將花藥從消毒的花蕾中完整剝離、取出。
[0023] ⑵接種至預處理培養基上，預處理
[0024] 將取出的花藥接種于MS預處理培養基上，Parafilm封口膜封口。
[0025] 預處理培養基：MS+0. lmg · L 1 ?0· 2mg · L 4-D+O. 5mg · L 1 ? 1. Omg · L-1KT+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%瓊月旨，ρΗ5· 8 ?6。
[0026] 預處理：接種后，置于4°C暗處理45h?50h ;然后移至36°C處理120h?150h。通 過預處理可顯著提高愈傷組織誘導頻率。
[0027] ⑶愈傷組織誘導、培養：預處理后的花藥，移至24°C?28°C組織培養室中暗培養。 6?7d后花藥頂端現黃白色組織，轉接至愈傷組織誘導培養基，置于晝溫25土 1°C /夜溫 22±1°C、光照2000?3000LX、光周期14h · cf1條件下培養。12?16d后愈傷組織轉接至 增殖培養基上繼續培養至愈傷組織直徑為〇. 4?0. 6cm。花藥壁組織與小孢子共培養，能提 高愈傷組織的誘導頻率。
[0028] 愈傷組織誘導培養基：MS+0. 2mg · Γ1 ?0· 25mg · 1^2, 4-D+l. Omg · Γ1 ? 2. Omg · L-1KT+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%瓊月旨，ρΗ5· 8 ?6。
[0029] 增殖培養基：]^+0.111^噸1?0.2511^噸12,4-〇+2.〇11^噸1?3.〇11^噸 10+2(%? 3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%瓊脂，ρΗ5· 8 ?6。
[0030] ⑷植株誘導：愈傷組織直徑0. 4?0. 6cm，轉接至1/2Β5分化培養基，置于晝溫 25±1°C /夜溫22±1°C、光照3000?4000LX、光周期16h .(Γ條件下分化培養。18?24d 后愈傷組織直徑1?2cm，轉接至B5分化培養基繼續培養。愈傷組織周圍逐漸產生黃綠色 小點，并逐漸發育成小苗。
[0031] 1/2B5 分化培養基：1/2Β5+0· Olmg · L 1 ?0· 02mg · L ΑΑΑ+^ι· Omg · L 1 ? 6. Omg · L kT+l. Omg · L 1 ?5. Omg · L 40+2%?3%鹿糖 +0· 6%?0· 8%瓊月旨，ρΗ5· 8 ?6。
[0032] Β5 分化培養基：Β5+0· Olmg · L 1 ?0· 02mg · L iNAA+G· Omg · L 1 ? 8. Omg · L ^Τ+δ. Omg · L 1 ?10. Omg · L 40+2% ?3%鹿糖 +0· 6% ?0· 8%瓊月旨，ρΗ5· 8 ? 6。
[0033] (5)移栽：移植前2d打開瓶蓋；移栽時，將再生植株取出，洗凈培養基，50 %多菌靈 可濕性粉劑1000倍液浸泡，晾干，移植于裝有滅菌蛭石和珍珠巖（體積比2:1)的穴盤；穴 盤置于育苗棚內馴化，30?35d后定植于棚室。
[0034] 染色體鑒定：采用染色體計數直接鑒定法，顯微鏡下觀察統計根尖細胞中期染色 體，再生植株染色體倍性檢測。
[0035] 本發明通過培養成分和培養條件的調節，降低愈傷組織褐化的發生，提高誘導頻 率。
[0036] 本發明的有益效果：
[0037] 本發明提供了一種茄子花藥培養技術，利用茄子花藥培養獲得了單倍體再生植 株，出苗率高，若應用于育種實踐，可加快育種步伐。
[0038] 本發明采用固體培養基將小孢子和花藥壁共培養，低溫、熱激預處理，愈傷誘導和 分化培養基成分和培養條件調節，提高了愈傷誘導頻率和愈傷組織的分化能力。通過本發 明的方法培育爺子單倍體植株，其愈傷誘導率達到60%以上，出苗率達到80%以上。本發 明的茄子花藥培養技術獲得再生單倍體植株，解決了茄子花藥培養誘導率低的難題；花藥 培養可獲得大量的新基因型純系，豐富了種質資源，為茄子新品種選育提供更有效的手段。
【具體實施方式】：
[0039] 本實例以綜合優良性狀的雜交一代茄子組合S8847、S8889作為試驗材料，采用本 發明方法獲取了單倍體植株。實施過程如下：
[0040] 一、取材
[0041] 5月上旬，試材盛花期于晴天上午10:00采集對茄、四門斗的花蕾。醋酸洋紅染色 壓片法鏡檢花粉發育時期，確定花粉發育時期和花藥形態的相關性。選取花粉發育處于單 核中后期的花蕾，蕾長12. 0?13. 5_，蕾直徑6. 5?7. 5_，花萼包裹花冠、先端微微張開 略現花冠頂部，花藥呈綠黃色；適宜生長環境條件下，花芽分化后24?26d，即開花前6? 8d花蕾。
[0042] 二、消毒
[0043] ⑴培養基滅菌與分裝：60mm培養皿、三角瓶、固體培養基等121°C、1. IMpa滅菌 20min。超凈工作臺內分裝，每一培養皿8ml培養基。
[0044] ⑵試材消毒：花蕾洗滌靈清洗，流水沖洗30min ;超凈工作臺內，沖洗后的花蕾用
【權利要求】
1. 一種茄子花藥培養獲得單倍體再生植株的方法，其特征在于包括以下步驟： ⑴取花粉發育處于單核中后期的花藥； ⑵接種至預處理培養基上，預處理； ⑶將預處理后的花藥，在24°C?28°C條件下暗培養6?7d至花藥頂端出現黃白色組 織后，轉接至愈傷組織誘導培養基，在晝溫25 ± 1 °C /夜溫22 ± 1 °C、光照2000?3000LX、光 周期14h · cf1條件下培養12?16天后，轉接至增殖培養基上繼續培養至愈傷組織直徑為 0. 4 ?0. 6cm ; ⑷將直徑為0. 4?0. 6cm的愈傷組織轉接至1/2B5分化培養基，在晝溫25土 l°C /夜 溫22土 1°C、光照3000?4000LX、光周期16h · cf1條件下分化培養至愈傷組織直徑為1? 2cm，然后轉接至B5分化培養基繼續培育獲得再生植株； (5)移栽。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的預處理培養基為MS+0. lmg · Γ1? 0.211^*]^12,4-0+0.511^*]^1?1.011^*]^11(丁+2 (%?3(%鹿糖+0.6(%?0.8(%瓊月旨，卩!15.8? 6。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述預處理的過程為：置于4°C暗處理 45?50h ;后移至36°C處理120?150h。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的愈傷組織誘導培養基 為 MS+0. 2mg · L 1 ?0· 25mg · L 4-D+1. Omg · L 1 ?2. Omg · L % ?3 % 蔗糖+0. 6 %?0. 8 %瓊脂，pH5. 8?6 ;所述的增殖培養基為MS+0. lmg · L-1? 0· 25mg *L 4-D+2. Omg *L 1 ?3. Omg *L ?3%鹿糖 +0· 6%?0· 8%瓊脂，ρΗ5· 8 ? 6。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的1/2Β5分化培養基為 l/2B5+0. Olmg · L 1 ~ 0. 02mg · L 1NAA+4. Omg · L 1 ~ 6. Omg · L ^T+l. Omg · L 1 ~ 5. Omg · I^VC+2 %?3 %蔗糖+0· 6 %?(λ 8 %瓊脂，pH5. 8?6 ;所述的B5分化培養 基為 Β5+0· Olmg · L 1 ?0· 02mg · L iNAA+e. Omg · L 1 ?8. Omg · L ^Τ+δ. Omg · L 1 ? 10. Omg · L-1VC+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%瓊月旨，ρΗ5· 8 ?6。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（5)中所述移栽的過程為：提前2d打 開瓶蓋，然后取出再生植株，洗凈培養基，50 %多菌靈可濕性粉劑1000倍液浸泡，晾干后移 植于裝有滅菌蛭石和珍珠巖（體積比2:1)的穴盤；置于育苗棚內馴化30?35d后定植于 棚室。
7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1)中所述單核中后期花藥的取出過 程為：植株盛花期于晴天上午9:00?11:00采集花蕾，醋酸洋紅染色壓片法鏡檢鑒定花粉 發育時期，選取處于單核中后期花蕾；花蕾消毒：花蕾洗滌靈清洗，流水沖洗20?30min ; 然后依次用75%乙醇溶液浸0. 5min，6. 5 %次氯酸鈉溶液消毒15min，最后用無菌水沖洗 3?4次；無菌條件下，將花藥從花蕾中完整剝離、取出。
【文檔編號】A01H4/00GK104041415SQ201410274444
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】張燕燕, 繆其松, 唐懋華, 劉葉瓊, 黃忠陽, 魏猷剛, 胡靜, 孫雪花 申請人:南京市蔬菜科學研究所