叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種促進豆科植物吸收礦物磷的應用的制作方法
【專利摘要】叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種促進豆科植物吸收礦物磷的應用，屬于豆科植物的培養方法【技術領域】。該應用中單株豆科植物中叢枝菌根真菌接種菌量為30～50個孢子/ml，根瘤菌接種量為濃度1.0×109cfu.mL-1的根瘤菌菌液5～15mL。該應用中礦物磷含量為每kg豆科植物培養基質中含有0.1～0.2g難溶性磷，難溶性磷為有效磷含量為0.67g/kg的磷礦粉。本發明為叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種豆科植物吸收難溶性礦物質提供了理論依據，為減少化學肥料使用及促進豆科植物更好地利用營養物質提供了理論依據。
【專利說明】叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種促進豆科植物吸收礦物磷的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于豆科植物的培養方法【技術領域】，具體涉及叢枝菌根菌和根瘤菌雙接種促進豆科植物吸收礦物磷的應用。
【背景技術】
[0002]叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza, AM)真菌是一類內生菌根真菌，廣泛存在于土壤中，能與陸地上90%以上的植物根系形成共生體，其宿主包括苔蘚植物、蕨類植物、裸子植物和被子植物。同時AM真菌的根外菌絲可以從外界環境中吸收水分和礦質元素，促進植物生長，改善植物營養狀況。根瘤菌是革蘭氏陰性細菌，廣泛分布于土壤中，可與相應的豆科植物根系共生，侵染豆科植物的根部形成根瘤，進而將空氣中的分子態氮轉化為植物可利用的氨。研究表明，豆科植物根系周圍生長著大量的AM真菌和根瘤菌，它們在長期的進化過程中形成了 AM真菌-豆科植物-根瘤菌三重共生體系，從而為豆科植物的生長提供了豐富的營養。
[0003]磷素是植物所必需的，對于豆科植物來說，磷酸鹽濃度的高低影響著植物的生長和有效根瘤的形成，且相對較高的磷水平有利于根瘤的形成和氮的固定。但大田土壤中90%的磷素是難溶性的，植物不能直接吸收利用，施用過多磷肥又會造成營養流失，環境污染。AM真菌作為內生菌根真菌，可與90%的植物形成共生體系，并可通過增加植物根際土壤中磷酸酶活性，增加植物對土壤中磷素的吸收，滿足根瘤生長和固氮作用對磷的需求。
【發明內容】
[0004]針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供利用叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種促進豆科植物吸收難溶性磷的方法的技術方案。
[0005]所述的叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種促進豆科植物吸收礦物磷的應用。
[0006]所述的應用，其特征在于所述的單株豆科植物中叢枝菌根真菌接種菌量為30~50個孢子/ml，根瘤菌接種量為濃度1.0X 19Cfu.mL—1的根瘤菌菌液5~15 mL。
[0007]所述的應用，其特征在于所述的叢枝菌根真菌為根內球囊霉，來自根內球囊霉與發根農桿菌質粒DNA轉化的胡蘿卜根建立的共生系統，所述的根瘤菌經YMA斜面培養基活化及YMA液體培養基搖床培養獲得。
[0008]所述的應用，其特征在于礦物磷含量為:每kg豆科植物培養基質中含有0.1~
0.2g難溶性磷，所述的難溶性磷為有效磷含量為0.67g/kg的磷礦粉。
[0009]所述的應用，其特征在于所述的根內球囊霉與發根農桿菌質粒DNA轉化的胡蘿卜根建立的共生系統為:以發根農桿菌質粒DNA轉化的胡蘿卜根作為宿主。
[0010]本發明通過對叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種豆科植物的試驗，得到了叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種能夠促進豆科植物吸收難溶性磷的用途，為叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種豆科植物吸收難溶性礦物質提供了理論依據，為減少化學肥料使用及促進豆科植物更好地利用營養物質提供了理論依據。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為三室隔離培養盒的示意圖；
圖2為不同濃度磷礦粉對莖葉總磷含量的影響圖。
[0012]圖2中磷礦粉中的有效磷含量為0.67g/kg，設置每kg河沙中0、0.06、0.12、和
0.24g磷礦粉，分別用P0、P1、P2、P3表示。
【具體實施方式】
[0013]以下結合實施例來進一步說明本發明。
實施例
[0014](I)育苗處理
選取籽粒飽滿的綠豆種子，10%H202消毒10 min，蒸餾水反復沖洗干凈后播種于盛有滅菌蛭石的培養杯中，置于智能光照培養箱中培養。待種子萌發，植株長出兩片真葉后選取長勢一致的綠豆苗進行移栽。
[0015](2)菌劑的制備
將AM真菌根內球囊霉iGlomus.1ntraradices)與毛根農桿菌質粒DNA轉化的胡蘿卜根建立的共生系統倒入粉碎機中粉碎，然后倒入400目篩子中用自來水反復沖洗至培養基消失。漂洗干凈后，用蒸餾水稀釋到每毫升30~50個孢子后倒入試劑瓶，內含有侵染根，孢子和菌絲。根瘤菌在YMA斜面培養基上活化后，后轉接到盛于200mLYMA液體培養基的500mL三角瓶中，置于搖床上培養。
[0016](3)培養方法
將育好的綠豆苗轉移到三室隔離培養盒中(如圖1所示)，三室隔離培養盒是由不銹鋼的白色鐵皮制作，兩層孔徑大小為38 μ m的尼龍網將培養盒分成菌根室1、隔離室2和菌絲室3。菌絲室3的體積為5 cmX 10 cmX 13 cm,菌根室I的體積為3 cmX 10 cmX 10 cm,隔離室2的體積僅為I cmX 10 cmX 10 cm,并且隔離室2的尼龍網只允許菌絲通過而不允許植物根通過進入菌絲室3，這樣有效地減少了菌根室和菌絲室之間的營養物質流動。同時菌根室I比菌絲室3高3cm，進一步限制了兩室之間的營養物質流動。菌根室I中的培養基質為滅菌的河沙，該河沙經自來水反復沖洗后再用去離子水沖洗，然后IX 15 Pa滅菌2 h得到。
[0017]因根瘤菌是細菌，不能產生菌絲，不能透過隔離層吸收菌絲室的營養物質，故本試驗設置3個處理，接種根瘤菌、AM真菌及根瘤菌和AM真菌雙接種。AM真菌接種菌劑為2 mL(孢子數約為60~100個)，根瘤菌菌液5~15 mL (濃度約1.0X 109cfu.mL—1)，在接種根瘤菌之前先用根瘤菌菌液浸泡根5min,后都置于智能光照培養箱中培養,光照溫度為25 °C,夜間溫度為18°C。每隔6d向菌根室加5mL的Hoagland限氮限磷營養液(如表1)。30d后往菌絲室施加滅菌河沙，繼續培養10d，保證菌根室I的菌絲可以延伸進入到菌絲室3，在此培養過程中每隔6d在菌根室I和菌絲室3加入5mL的Hoagland限氮限磷營養液。
[0018] 表1 Hoagland限氮限磷營養液
【權利要求】
1.叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種促進豆科植物吸收礦物磷的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述的單株豆科植物中叢枝菌根真菌接種菌量為30~50個孢子/ml，根瘤菌接種量為濃度1.0X 19Cfu.mL—1的根瘤菌菌液5~15 mL。
3.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述的叢枝菌根真菌為根內球囊霉，來自根內球囊霉與發根農桿菌質粒DNA轉化的胡蘿卜根建立的共生系統，所述的根瘤菌經YMA斜面培養基活化及YMA液體培養基搖床培養獲得。
4.如權利要求1所述的應用，其特征在于礦物磷含量為:每kg豆科植物培養基質中含有0.1~0.2g難溶性磷，所述的難溶性磷為有效磷含量為0.67g/kg的磷礦粉。
5.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述的根內球囊霉與發根農桿菌質粒DNA轉化的胡蘿卜根建立 的共生系統為:以發根農桿菌質粒DNA轉化的胡蘿卜根作為宿主。
【文檔編號】A01G31/00GK104025983SQ201410247847
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月6日 優先權日:2014年6月6日
【發明者】金海如, 刁亞南 申請人:浙江師范大學