一種將外源基因導入閉穎授粉秈稻品種的遺傳轉化方法
【專利摘要】本發明提供一種將外源基因導入閉穎授粉秈稻品種的遺傳轉化方法。具體而言，本發明通過農桿菌介導，將外源基因導入到閉穎授粉的秈稻品種中。本發明的發明人發現，對于閉穎授粉水稻(尤其是水稻品種9m90)而言，常規的介導方法要么并不適用，要么轉化效率很低。因此，本發明提出了一種新的轉化方法，大大提高了轉化效率。通過對所獲得的植株進行PCR檢測鑒定，可以證明外源基因已導入9m90中。該方法成功實現了閉穎授粉的秈稻品種的遺傳轉化，在加快性狀改良過程同時，可避免花粉外傳導致的基因漂移。
【專利說明】一種將外源基因導入閉穎授粉秈稻品種的遺傳轉化方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術和植物基因工程【技術領域】，具體而言，本發明涉及一種將外源基因導入到閉穎授粉的秈稻品種，尤其是9m90的遺傳轉化方法
【背景技術】
[0002]水稻（Oryza sativa L.)是我國乃至世界上最重要的糧食作物，世界上60%以上的人口以稻米為主食。近年來面對日益頻繁的干旱、極端溫度等非生物脅迫的影響，人口增長和生態環境的壓力，現代生物技術手段，特別是轉基因技術在作物遺傳改良方面的重要性日漸凸顯。轉基因技術為農作物的產量提升、品質改良和抗性增強提供了新路徑、開拓了新空間。
[0003]但隨著轉基因作物的種植范圍迅速擴大，轉基因作物及其產品的安全性，引起了廣泛關注。例如轉基因品種花粉外傳會帶來基因漂移，可能產生“超級雜草”等風險，但目前缺乏實用有效的技術手段加以克服，比如物理隔離需要一定的空間阻止花粉傳播（水稻需在IOOm以上），只適于小面積實驗，在大面積生產中是不切實際的。
[0004]而閉穎授粉品種在整個授粉過程中，穎花不張開，花藥不外露，花粉不會向外傳播，可以有效抑制花粉外傳，避免基因污染。通過閉穎受體來解決基因污染問題，是目前被認為最可行的技術手段，但目前生產還缺乏實用化的閉穎水稻品種。本實驗室創制的9m90等閉穎授粉秈稻品種，不僅完全閉穎授粉，而且結實率、株高等重要農藝性狀較好，可作為理想的轉基因受體應用于品種快速遺傳改良，減少生態風險。
[0005]但目前還沒有閉穎授粉水稻品種的遺傳轉化方法的報道。為充分利用具有閉穎授粉性狀的獨特遺傳資源，本發明旨在建立一種適用于閉穎授粉秈稻品種的遺傳轉化方法。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種將外源基因導入到閉穎授粉的秈稻品種9m90的遺傳轉化方法、利用該方法生產轉基因水稻的方法。本發明提供了下列技術方案來實現該目的。
[0007]在一個方面，本發明提供一種將外源基因導入閉穎授粉秈稻品種的遺傳轉化方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟：
[0008]步驟I、提取水稻種子的胚，將所述胚置于愈傷組織誘導培養基上以產生次級愈傷組織；
[0009]步驟2、將所述次級愈傷組織轉移至新的愈傷組織誘導培養基進行預培養；
[0010]步驟3、對所獲得的愈傷組織進行農桿菌侵染；
[0011]步驟4、對所述愈傷組織進行前篩選；
[0012]步驟5、將經前篩選的愈傷組織轉移至篩選培養基上，以獲得抗性愈傷組織
[0013]步驟6、對所述抗性愈傷組織進行分化再生，以分化成苗；[0014]步驟7、將所獲得的苗轉移到生根培養基中生根。
[0015]優選地，所述水稻種子為閉穎授粉秈稻品種9m90的種子。[0016]優選地，所述步驟I包括將所述水稻種子去殼、滅菌后將胚分離出來，所述愈傷組織誘導培養基中[NO3-]/[NH4+] =20禮/201111，并且含有3(^1氯化鈷。
[0017]優選地，所述步驟3包括：將所述步驟2中獲得的愈傷組織與攜帶外源基因的農桿菌接觸15分鐘，然后將所獲得的愈傷組織轉移到上墊有無菌濾紙的培養皿中在21-23°C培養48小時；
[0018]所述步驟4包括將愈傷組織置于前篩選培養基上培養5-7天；
[0019]所述步驟6包括將所述抗性愈傷組織轉移到分化再生培養基中分化成苗。 [0020]優選地,所述無菌濾紙中加入2. 5-3. 5mL農桿菌懸浮培養基,所述農桿菌懸浮培養基中[NO3I/[NH4+] = 20mM/20mM ；
[0021]所述愈傷組織轉移篩選培養基中[NO3-]/[NH4+] = 20mM/20mM,并且含有30 μ M氯化鈷；
[0022]所述分化再生培養基中[NO3-] / [NH4+] = 20mM/20mM,并且含有30 μ M氯化鈷、lmg/L激動素（KT)和lmg/L萘乙酸（NAA);并且
[0023]所述生根培養基中含O. 4mg/L的NAA。
[0024]優選地，所述步驟I中的種子是成熟種子；和/或
[0025]所述誘導培養基包括預定配比的N6大量元素（[NO3-] / [NH4+] = 20mM/20mM)、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麥芽糖、2mg/L2，4_D、30 μ M氯化鈷、8g/L瓊脂；和/或
[0026]所述步驟3中的與農桿菌接觸是將愈傷組織浸泡在所述農桿菌懸浮液中；和/或
[0027]所述農桿菌懸浮培養基包括預定配比的N6大量元素（[N<V] / [NH4+]=20mM/20mM)、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2, 4-D、20g/L麥芽糖、10g/L葡萄糖、100 μ mo I/L乙酰丁香酮；和/或
[0028]所述前篩選培養基包括預定配比的N6大量元素（[NO3M/[NH4+] = 20mM/20mM)、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麥芽糖、2mg/L2，4_D、30 μ M氯化鈷、8g/L瓊脂、250mg/L羧芐青霉素；和/或
[0029]所述篩選培養基包括預定配比的N6大量元素（[NO3M / [NH4+] = 20mM/20mM)、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麥芽糖、2mg/L2，4_D、30 μ M氯化鈷、8g/L瓊脂、50mg/L潮霉素、250mg/L羧芐青霉素；和/或
[0030]所述分化再生培養基包括預定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、lg/L CH、30g/L 鹿糖、30g/L sorb i to I > 500mg/L MES >2. 5mg/L CuS04、lmg/L KT、lmg/L 萘乙酸（NAA)、AA氨基酸、125mg/L羧芐青霉素、30 μ M氯化鈷、8g/L瓊脂；和/或
[0031]所述生根培養基包括1/2MS基礎鹽（2. 165g/L)、MS維生素、20g/L蔗糖、25mg/L潮霉素、O. 4mg/L NAA、125mg/L羧芐青霉素、3. 5g/L植物凝膠。
[0032]這里預定配比的N6大量元素指的是培養基中[N(V]/[NH4+] = 20mM/20mM。
[0033]另一方面，本發明提供一種生產轉基因水稻的方法，包括：
[0034]I)通過上述方法將外源基因導入水稻細胞；和
[0035]2)利用所獲得的水稻細胞培育水稻植株。
[0036]在一種實現方式中，所述方法包括下述具體步驟：[0037](I)將水稻種子去殼、滅菌后將胚分離出來，置于愈傷組織誘導培養基上以產生次級愈傷組織；
[0038](2)次級愈傷組織轉移至新的誘導培養基預培養；
[0039](3)將步驟⑵中獲得的愈傷組織與攜帶外源基因的農桿菌接觸15分鐘；
[0040](4)將步驟（3)的愈傷組織轉移到上墊上三張無菌濾紙（加入2. 5-3. 5mL農桿菌懸浮培養基）的培養皿中，21-23°C培養48小時；
[0041](5)將步驟（4)的愈傷組織置于前篩選培養基上培養5-7天；
[0042](6)將步驟（5)的愈傷組織轉移篩選培養基上，以獲得抗性愈傷組織；
[0043](7)將抗性愈傷組織轉移到分化再生培養基中分化成苗；和
[0044](8)將步驟（7)的苗轉移到生根培養基中生根。
[0045]在另一個方面，本發明提供一種用于轉化水稻的培養基套組，包括如下所述的組分： [0046](I)愈傷組織誘導培養基；
[0047](2)農桿菌懸浮培養基；
[0048](3)前篩選培養基；
[0049](4)篩選培養基；
[0050](5)分化再生培養基；
[0051](6)生根培養基。
[0052]其中所述（1)-(6)分別包含如說明書表1所示的成分。
[0053]本方面還涉及這樣的培養基套組用于將外源基因導入水稻細胞的程序的用途。所述的水稻優選秈稻，包括但不限于9m90等閉穎授粉秈稻品種。
[0054]技術效果
[0055]本發明的方法成功實現了閉穎授粉的秈稻品種的遺傳轉化，從而在加快性狀改良過程同時，避免花粉外傳導致的基因漂移，降低可能的生態風險。
[0056]通過本發明，可以實現對水稻尤其是閉穎授粉秈稻的高轉化頻率、高重復性的農桿菌介導轉化（對于水稻品種9m90而言，常規的介導方法要么并不適用，要么轉化效率很低）；另一方面，本發明步驟簡單（如不需洗菌和預分化，只需一輪篩選），縮短周期，節約成本，適合高通量操作，便于規模化應用。從而為開發工業規模的、無基因漂移的轉基因水稻制備工藝提供了可能。
[0057]表1培養基的示例性配方
[0058]
【權利要求】
1.一種將外源基因導入閉穎授粉秈稻品種的遺傳轉化方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟: 步驟1、提取水稻種子的胚，將所述胚置于愈傷組織誘導培養基上以產生次級愈傷組織； 步驟2、將所述次級愈傷組織轉移至新的愈傷組織誘導培養基進行預培養； 步驟3、對所獲得的愈傷組織與攜帶所述外源基因的農桿菌接觸，進行農桿菌侵染； 步驟4、對所述愈傷組織進行前篩選； 步驟5、將經前篩選的愈傷組織轉移至篩選培養基上，以獲得抗性愈傷組織； 步驟6、對所述抗性愈傷組織進行分化再生，以分化成苗； 步驟7、將所獲得的苗轉移到生根培養基中生根。
2.根據權利要求1所述的遺傳轉化方法，其特征在于，所述水稻種子為閉穎授粉秈稻品種9m90的種子。
3.根據權利要求1所述的遺傳轉化方法，其特征在于， 所述步驟I包括將所述水稻種子去殼、滅菌后將胚分離出來，所述愈傷組織誘導培養基中[NO3-]/[NH4+] = 20mM/20mM,并且含有 30 μ M 氯化鈷。
4.根據權利要求1所述的遺傳轉化方法，其特征在于， 所述步驟3包括:將所述步驟2中獲得的愈傷組織與攜帶外源基因的農桿菌接觸15分鐘，然后將所獲得的愈傷組織轉移到墊有無菌濾紙的培養皿中在21-23°C培養48小時； 所述步驟4包括將愈傷組織置于前篩選培養基上培養5-7天； 所述步驟6包括將所述抗性愈傷組織轉移到分化再生培養基中分化成苗。
5.根據權利要求4所述的遺傳轉化方法，其特征在于，所述無菌濾紙中加入2.5-3.5mL農桿菌懸浮培養基，所述農桿菌懸浮培養基中[NO3-]/[NH4+] = 20mM/20mM ； 所述愈傷組織轉移篩選培養基中[NO3-]/[NH4+] = 20mM/20mM，并且含有30 μ M氯化鈷；所述分化再生培養基中[NO3-] / [NH4+] = 20mM/20mM,并且含有30 μ M氯化鈷、lmg/L激動素(KT)和lmg/L萘乙酸(NAA);并且所述生根培養基中含0.4mg/L的NAA。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于， 所述步驟I中的種子是成熟種子；和/或 所述誘導培養基包括N6大量兀素、B5微量兀素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麥芽糖、2mg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸、.30 μ M氯化鈷、8g/L瓊脂；和/或 所述步驟3中的與農桿菌接觸是將愈傷組織浸泡在所述農桿菌懸浮液中；和/或所述農桿菌懸浮培養基包括預定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2, 4_D、20g/L麥芽糖、1g/L葡萄糖、.100 μ mo I/L乙酰丁香酮；和/或 所述前篩選培養基包括預定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、.500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麥芽糖、2mg/L2，4-D、.30 μ M氯化鈷、8g/L瓊脂、250mg/L羧芐青霉素；和/或 所述篩選培養基包括預定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麥芽糖、2mg/L2, 4_D、30 μ M氯化鈷、8g/L瓊脂、50mg/L潮霉素、250mg/L羧芐青霉素；和/或 所述生根培養基包括1/2MS基礎鹽2.165g/L、MS維生素、20g/L蔗糖、25mg/L潮霉素、.0.4mg/L萘乙酸、125mg/L羧芐青霉素、3.5g/L植物凝膠。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3包括農桿菌菌株的培養和懸浮液準備，所述農桿菌菌株的培養包括進行兩次活化。
8.一種生產轉基因水稻的方法，包括: 1)通過權利要求1-7中任意一項所述的方法將外源基因導入水稻細胞；和 2)利用所獲得的水稻細胞培育水稻植株。
9.一種用于轉化水稻的培養基套組，包括如下所述的組分: (1)愈傷組織誘導培養基； (2)農桿菌懸浮培養基； (3)前篩選培養基； (4)篩選培養基； (5)分化再生培養基； (6)生根培養基，其特征在于，所述愈傷組織誘導培養基、所述農桿菌懸浮培養基和所述分化再生培養基中[NO3-]/[NH4+] = 20mM/20mM。
【文檔編號】A01H5/00GK104031938SQ201410235771
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月28日 優先權日:2014年5月28日
【發明者】倪大虎, 楊劍波, 魏鵬程, 李 浩, 楊亞春, 李莉, 倪金龍, 陸徐忠, 宋豐順, 馬卉, 秦瑞英 申請人:安徽省農業科學院水稻研究所