一種冬小包腳菇的菌種培養基及其制備方法及利用其的菌種培養方法
【專利摘要】一種冬小包腳菇的菌種培養基及其制備方法及利用其的菌種培養方法，菌種培養基，玉米芯80％，米糠18％，過磷酸鈣1％，葡萄糖1％；玉米芯；制備方法：玉米芯加入沸水使其全部淹沒原料，浸泡0.8h～1.2h，過濾去水分，加入上述配方的米糠、過磷酸鈣、蔗糖，攪拌均勻，形成培養基；檢查并調整所述培養基的水分，含水量50％～55％；裝瓶，滅菌。菌種培養方法：菌種分離，培養并轉接：再按相同方法，再進行2次以上的轉接。本發明采用組織分離法，不經過試管培養，直接接入經制備好的玉米芯+米糠+過磷酸鈣+葡萄糖原料培養基培養，通過轉接純化，成功獲得了冬小包腳菇純培養菌種。本發明具有分離及培養基制作方便、不經過試管分離培養，縮短了菌種培養周期。
【專利說明】一種冬小包腳菇的菌種培養基及其制備方法及利用其的菌種培養方法
【技術領域】 [0001]本發明涉及農業生物【技術領域】，尤其是涉及一種冬小包腳菇的菌種培養基及其制備方法及利用其的菌種培養方法。
【背景技術】
[0002]冬小包腳燕(Volvariella brumal is He sp.),俗稱低溫草燕、谷樁菌、雞絲菌。野生冬小包腳菇僅貴州有分布報道，每年11月至翌年4月，生長于收割水稻后種植小麥、油菜、蠶豆、豌豆、馬鈴薯等作物地里。該菌是草菇屬中目前發現的唯一低溫型品種，填補了現有草菇屬均為中高溫型的缺陷。該菌菇肉細嫩、味道鮮美、營養豐富，具有很大的開發利用價值。但是，有關冬小包腳菇的菌種分離及培養技術卻是現有技術中的空白，嚴重制約著該產業的發展。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于設計一種冬小包腳菇的菌種培養基及其制備方法及利用其的菌種培養方法。
[0004]為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下:
[0005]一種冬小包腳菇的菌種培養基，質量百分百:玉米芯80%，米糠18%，過磷酸鈣1%，葡萄糖1% ；
[0006]要求:
[0007]玉米芯:無霉變，含水量≤12%，粉碎顆粒≤5mm ；
[0008]米糠:無霉變，含水量< 13% ；
[0009]過磷酸鈣:含有效P20514%~20%，其中80%~95%溶于水；
[0010]葡萄糖:化學純；
[0011]所述培養基的水分，含水量達到:50%~55%。
[0012]一種冬小包腳菇的菌種培養基的制備方法，包括步驟如下:
[0013]第一步，準備原料:按照質量百分比玉米芯80%，米糠18%，過磷酸鈣1%，葡萄糖1% ；
[0014]要求:
[0015]玉米芯:無霉變，含水量≤12%，粉碎顆粒≤5mm ；
[0016]米糠:無霉變，含水量< 13% ；
[0017]過磷酸鈣:含有效P20514%~20%，其中80%~95%溶于水；
[0018]葡萄糖:化學純；
[0019]第二步，培養基制作:稱取上述配方的玉米芯于容器中，加入沸水使其全部淹沒原料，浸泡0.Sh~1.2h，過濾去水分，加入上述配方的米糠、過磷酸鈣、蔗糖，攪拌均勻，形成培養基；檢查并調整所述培養基的水分，含水量50%~55%。[0020]還包括步驟如下:
[0021]第三步，裝瓶:將第二步中制備的培養基裝入菌種瓶中，裝量至菌種瓶瓶肩，壓緊瓶內表面的培養基，松緊程度為:將菌種瓶倒置，培養基不下落；然后，用清水洗凈瓶外，再用紗布伸進瓶內，洗凈瓶口瓶肩，擦干瓶口水分，塞上棉塞，用牛皮紙抱住瓶口，捆扎；
[0022]第四步，滅菌:所述菌種瓶放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在1.5kg/cm2壓力下，保持Ih ；將滅菌好的所述菌種瓶移到超凈工作臺內，讓其自然冷卻，形成成品菌種瓶。
[0023]一種利用所述的冬小包腳菇的菌種培養基的冬小包腳菇的菌種培養方法，包括步驟如下:
[0024]第一步，菌種分離:
[0025]I)取當天采集的新鮮未全開傘的冬小包腳菇子實體，剪去菌柄基部泥土，用無菌濕脫脂棉擦去菌蓋上的雜物，裝入經過滅菌的塑料袋，放到塑料盒中并及時帶回實驗室；
[0026]2)用75%酒精棉擦拭所述無菌塑料袋外壁，移到超凈工作臺，無菌條件下，用解剖刀劃開所述無菌塑料袋一小口，使菌蓋頂部剛好露出，再用解剖刀削去菌蓋表皮，露出菌蓋內的白色組織，挑取白色組織約5_大小作為組織塊，將所述組織塊接入菌種瓶培養基中部，使其與培養基有較好接觸 。
[0027]第二步，培養并轉接:
[0028]I)將所述成品菌種瓶置于18°C~22°C恒溫箱培養。每天觀察接入的所述組織塊的萌發狀況:若所述組織塊及周圍無污染，單菌落，為正常，菌種分離成功；否則為污染，要及時檢出；
[0029]2)對上述正常萌發，形成單一菌落的所述菌種瓶，不等長滿瓶，當菌絲開始吃料，在培養基上形成一圈直徑為2.5cm~3.5cm菌落時，及時轉接，使之純化；轉接所使用的培養基和第一步中的培養基相同，轉接方法如下:
[0030]SI，在超凈工作臺無菌條件下，用接種針挑取菌落的邊緣菌絲體，轉接到另一個菌種瓶培養基上，置于18°C~22°C恒溫箱培養；每天觀察接入菌體生長狀況，菌絲吃料，生長整齊，濃密，健壯，無污染，為正常，進入下一步；
[0031]S2，再按相同方法，再進行2次以上的轉接，形成為冬小包腳菇菌種。
[0032]本發明中的超凈工作臺(clean bench)是指為了適應現代化工業、光電產業、生物制藥以及科研試驗等領域對局部工作區域潔凈度的需求而設計的。超凈工作臺原理是在在特定的空間內，室內空氣經預過濾器初濾，由小型離心風機壓入靜壓箱，再經空氣高效過濾器二級過濾，從空氣高效過濾器出風面吹出的潔凈氣流具有一定的和均勻的斷面風速，可以排除工作區原來的空氣，將塵埃顆粒和生物顆粒帶走，以形成無菌的高潔凈的工作環境。超凈臺的優點是操作方便自如，比較舒適，工作效率，預備時間短，開機10分鐘以上即可操作，基本上可隨時使用。在工廠化生產中，接種工作量很大，需經常長久地工作時，超凈臺是很理想的設備。超凈臺由三相電機作鼓風動力，功率145~260W左右，將空氣通過由特的微孔泡沫塑料片層疊合組的“超級濾清器”后吹送出來，形成連續不斷的無塵無菌的超凈空氣層流，即所謂“有效的特殊空氣”，它除去了大于0.3 μ m的塵埃、真菌和細菌孢子等等。超凈空氣的流速為24~30m/min，這已足夠防止附近空氣可能襲擾而引起的污染，這樣的流速也不會妨礙采用酒精燈或本生燈對器械等的灼燒消毒。工作人員就在這樣的無菌條件下操作，保持無菌材料在轉移接種過中不受污染。但是萬一操作中途遇到停電，暴露在未過濾空氣中的材料便難以幸免污染。這時應迅速結束工作，并在瓶上作出記號，內中的材料如處增殖階段，則以后不再用作增殖而轉入生根培養。如為一般性生產材料，極其豐富也可棄去。如處生根過，則可留待以后種植用。
[0033]本發明包括具體步驟如下:
[0034]一、菌種分離
[0035](一 )材料
[0036]1、菌株來源
[0037]冬小包腳菇子實體，2010年4月6日采自貴州省龍里縣。
[0038]2、培養基及制備
[0039](I)培養基配方
[0040]玉米芯80%，米糠18%，過磷酸鈣1%，葡萄糖1%。pH值自然。 [0041](2)制備
[0042]玉米芯:無霉變，含水量≤12%，粉碎顆粒≤5mm。
[0043]米糠:無霉變，含水量< 13%。
[0044]過磷酸鈣:含有效P20514%~20% (其中80%~95%溶于水)。
[0045]葡萄糖:化學純。
[0046]培養基制作:按上述配方稱取玉米芯于容器中，加入沸水，使其全部淹沒原料，浸泡Ih左右，濾去多余水分，按配方加入米糠、過磷酸鈣、蔗糖，攪拌均勻，然后檢查培養基的水分，含水量50%~55%。
[0047]裝瓶:將配制好的培養基裝入菌種瓶中，裝量至菌種瓶瓶肩，壓緊瓶內表面的培養基，松緊程度為:將菌種瓶倒置，培養基不下落，用清水洗凈瓶外，再用紗布伸進瓶內，洗凈瓶口瓶肩，擦干瓶口水分，塞上棉塞，用牛皮紙抱住瓶口，捆扎。
[0048]滅菌:將裝好的菌種瓶放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在1.5kg/cm2壓力下，保持lh。將滅菌好的菌種瓶移到超凈工作臺內，讓其自然冷卻。
[0049]( 二)分離方法
[0050]取當天采集的新鮮未全開傘的冬小包腳菇子實體，剪去菌柄基部泥土，用無菌濕脫脂棉擦去菌蓋上的雜物，裝入經過滅菌的塑料袋，放到塑料盒中及時帶回實驗室。
[0051]用75%酒精棉擦拭塑料袋外壁，移到超凈工作臺無菌條件下，用解剖刀劃開塑料袋一小口，使菌蓋頂部剛好露出，再用解剖刀削去菌蓋表皮，露出菌蓋內的白色組織，挑取白色組織一小塊(約5mm左右)，接入菌種瓶培養基中部，使其與培養基有較好接觸。
[0052]二、菌種培養
[0053](一 )培養觀察
[0054]將已接種的上述菌種瓶置于18°C~22°C恒溫箱培養。每天觀察接入的組織塊萌發狀況，組織塊及周圍無污染，單菌落，即為正常，說明菌種分離成功。否則為污染，要及時檢出。
[0055]( 二 )純化
[0056]對上述正常萌發，形成單一菌落的菌種瓶，不能等長滿瓶。即當菌絲開始吃料，在培養基上形成一圈(直徑為2.5cm~3.5cm)菌落時,要及時轉接純化,轉接所使用的培養基和上述相同，至少要進行3次純化。[0057]轉接方法:在超凈工作臺無菌條件下，用接種針挑取菌落的邊緣菌絲體，轉接到另一個菌種瓶培養基上，置于18°C~22°C恒溫箱培養。每天觀察接入菌體生長狀況，菌絲吃料，生長整齊，濃密，健壯，無污染，即為正常。再按相同方法，進行第二次、第三次轉接培養，即為冬小包腳菇菌種。
[0058]本發明的有益效果可以總結如下:
[0059]1、本發明采用組織分離法，不經過試管培養，直接接入經制備好的玉米芯+米糠+過磷酸鈣+葡萄糖原料培養基培養，通過轉接純化，成功獲得了冬小包腳菇純培養菌種。
[0060]2、本發明具有分離及培養基制作方便、不經過試管分離培養，縮短了菌種培養周期。
【具體實施方式】
[0061]為了使本發明所解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0062]實施例1
[0063]一種冬小包腳菇的菌種培養基，質量百分百:玉米芯80%，米糠18%，過磷酸鈣1%，葡萄糖1% ;要求:
[0064]玉米芯:無霉變，含水量≤12%，粉碎顆粒≤5mm ；
[0065]米糠:無霉變，含水量< 13% ；
[0066]過磷酸鈣:含有效P20514%，其中80%溶于水；
[0067]葡萄糖:化學純；
[0068]所述培養基的水分，含水量達到:50%。
[0069]一種冬小包腳菇的菌種培養基的制備方法，包括步驟如下:
[0070]第一步，準備原料:按照質量百分比玉米芯80%，米糠18%，過磷酸鈣1%，葡萄糖1% ;要求:
[0071]玉米芯:無霉變，含水量≤12%，粉碎顆粒≤5mm ；
[0072]米糠:無霉變，含水量< 13% ；
[0073]過磷酸鈣:含有效P20514%，其中80%溶于水；
[0074]葡萄糖:化學純；
[0075]第二步，培養基制作:稱取上述配方的玉米芯于容器中，加入沸水使其全部淹沒原料，浸泡0.8h，過濾去水分，加入上述配方的米糠、過磷酸鈣、蔗糖，攪拌均勻，形成培養基；檢查并調整所述培養基的水分，含水量50%。
[0076]第三步，裝瓶:將第二步中制備的培養基裝入菌種瓶中，裝量至菌種瓶瓶肩，壓緊瓶內表面的培養基，松緊程度為:將菌種瓶倒置，培養基不下落；然后，用清水洗凈瓶外，再用紗布伸進瓶內，洗凈瓶口瓶肩，擦干瓶口水分，塞上棉塞，用牛皮紙抱住瓶口，捆扎；
[0077]第四步，滅菌:所述菌種瓶放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在1.5kg/cm2壓力下，保持Ih ；將滅菌好的所述菌種瓶移到超凈工作臺內，讓其自然冷卻，形成成品菌種瓶。
[0078]—種利用所述的冬小包腳菇的菌種培養基的冬小包腳菇的菌種培養方法，包括步驟如下:[0079]第一步，菌種分離:
[0080]I)取當天采集的新鮮未全開傘的冬小包腳菇子實體，本實施例中，冬小包腳菇子實體2010年4月6日采自貴州省龍里縣。
[0081]剪去菌柄基部泥土，用無菌濕脫脂棉擦去菌蓋上的雜物，裝入經過滅菌的塑料袋，放到塑料盒中并及時帶回實驗室；
[0082]2)用75%酒精棉擦拭所述無菌塑料袋外壁，移到超凈工作臺，無菌條件下，用解剖刀劃開所述無菌塑料袋一小口，使菌蓋頂部剛好露出，再用解剖刀削去菌蓋表皮，露出菌蓋內的白色組織，挑取白色組織約5mm大小作為組織塊，將所述組織塊接入菌種瓶培養基中部，使其與培養基有較好接觸。
[0083]第二步，培養并轉接:
[0084]I)將所述成品菌種瓶置于18°C恒溫箱培養。每天觀察接入的所述組織塊的萌發狀況:若所述組織塊及周圍無污染，單菌落，為正常，菌種分離成功；否則為污染，要及時檢出；
[0085]2)對上述正常萌發，形成單一菌落的所述菌種瓶，不等長滿瓶，當菌絲開始吃料，在培養基上形成一圈直徑為2.5cm~3.5cm菌落時，及時轉接，使之純化；轉接所使用的培養基和第一步中的培養基相同，轉接方法如下: [0086]SI，在超凈工作臺無菌條件下，用接種針挑取菌落的邊緣菌絲體，轉接到另一個菌種瓶培養基上，置于18°C恒溫箱培養；每天觀察接入菌體生長狀況，菌絲吃料，生長整齊，濃密，健壯，無污染，為正常，進入下一步；
[0087]S2，再按相同方法，再進行2次以上的轉接，形成為冬小包腳菇菌種。
[0088]本發明采用組織分離法，不經過試管培養，直接接入經制備好的玉米芯+米糠+過磷酸鈣+葡萄糖原料培養基培養，通過轉接純化，成功獲得了冬小包腳菇純培養菌種。本發明具有分離及培養基制作方便、不經過試管分離培養，縮短了菌種培養周期——本實施例中，用時45天，而現有技術中通常經過試管分離，純化，培養，獲得母種，再轉接原種、栽培種，需要60-75天，本技術45-60天，可縮短菌種培養周期15天。
[0089]冬小包腳菇菌種的鑒定:
[0090]菌落特征:白色，菌絲絨毛狀，匍匐生長，菌落邊緣整齊，邊緣與中央部位顏色一致，質地均勻。
[0091]菌絲體特征:肉眼觀察菌絲體白色，顯微鏡下菌絲透明，分枝，有隔，初生菌絲體纖細，次生菌絲體較粗壯。
[0092]經過出菇試驗證明，本實施例中獲得的為冬小包腳菇菌種的實體。
[0093]實施例2
[0094]一種冬小包腳菇的菌種培養基，質量百分百:玉米芯80%，米糠18%，過磷酸鈣1%，葡萄糖1% ;要求:
[0095]玉米芯:無霉變，含水量≤12%，粉碎顆粒≤5mm ；
[0096]米糠:無霉變，含水量≤13% ；
[0097]過磷酸鈣:含有效P20520%，其中95%溶于水；
[0098]葡萄糖:化學純；
[0099]所述培養基的水分，含水量達到:55%。[0100]一種冬小包腳菇的菌種培養基的制備方法，包括步驟如下:
[0101]第一步，準備原料:按照質量百分比玉米芯80%，米糠18%，過磷酸鈣1%，葡萄糖1% ;要求:
[0102]玉米芯:無霉變，含水量≤12%，粉碎顆粒≤5mm ；
[0103]米糠:無霉變，含水量≤ 13% ；
[0104]過磷酸鈣:含有效P20520%，其中95%溶于水；
[0105]葡萄糖:化學純；
[0106]第二步，培養基制作:稱取上述配方的玉米芯于容器中，加入沸水使其全部淹沒原料，浸泡1.2h，過濾去水分，加入上述配方的米糠、過磷酸鈣、蔗糖，攪拌均勻，形成培養基；檢查并調整所述培養基的水分，含水量55%。
[0107]第三步，裝瓶:將第二步中制備的培養基裝入菌種瓶中，裝量至菌種瓶瓶肩，壓緊瓶內表面的培養基，松緊程度為:將菌種瓶倒置，培養基不下落；然后，用清水洗凈瓶外，再用紗布伸進瓶內，洗凈瓶口瓶肩，擦干瓶口水分，塞上棉塞，用牛皮紙抱住瓶口，捆扎；[0108]第四步，滅菌:所述菌種瓶放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在1.5kg/cm2壓力下，保持Ih ；將滅菌好的所述菌種瓶移到超凈工作臺內，讓其自然冷卻，形成成品菌種瓶。
[0109]一種利用所述的冬小包腳菇的菌種培養基的冬小包腳菇的菌種培養方法，包括步驟如下:
[0110]第一步，菌種分離:
[0111]I)取當天采集的新鮮未全開傘的冬小包腳菇子實體，本實施例中，冬小包腳菇子實體2010年4月6日采自貴州省龍里縣。
[0112]剪去菌柄基部泥土，用無菌濕脫脂棉擦去菌蓋上的雜物，裝入經過滅菌的塑料袋，放到塑料盒中并及時帶回實驗室；
[0113]2)用75%酒精棉擦拭所述無菌塑料袋外壁，移到超凈工作臺，無菌條件下，用解剖刀劃開所述無菌塑料袋一小口，使菌蓋頂部剛好露出，再用解剖刀削去菌蓋表皮，露出菌蓋內的白色組織，挑取白色組織約5mm大小作為組織塊，將所述組織塊接入菌種瓶培養基中部，使其與培養基有較好接觸。
[0114]第二步，培養并轉接:
[0115]I)將所述成品菌種瓶置于22°C恒溫箱培養。每天觀察接入的所述組織塊的萌發狀況:若所述組織塊及周圍無污染，單菌落，為正常，菌種分離成功；否則為污染，要及時檢出；
[0116]2)對上述正常萌發，形成單一菌落的所述菌種瓶，不等長滿瓶，當菌絲開始吃料，在培養基上形成一圈直徑為2.5cm~3.5cm菌落時，及時轉接，使之純化；轉接所使用的培養基和第一步中的培養基相同，轉接方法如下:
[0117]SI，在超凈工作臺無菌條件下，用接種針挑取菌落的邊緣菌絲體，轉接到另一個菌種瓶培養基上，置于22°C恒溫箱培養；每天觀察接入菌體生長狀況，菌絲吃料，生長整齊，濃密，健壯，無污染，為正常，進入下一步；
[0118]S2，再按相同方法，再進行2次以上的轉接，形成為冬小包腳菇菌種。
[0119]本發明采用組織分離法，不經過試管培養，直接接入經制備好的玉米芯+米糠+過磷酸鈣+葡萄糖原料培養基培養，通過轉接純化，成功獲得了冬小包腳菇純培養菌種。本發明具有分離及培養基制作方便、不經過試管分離培養，縮短了菌種培養周期。本實施例中，用時68天，而現有技術中通常經過試管分離，純化，培養，獲得母種，再轉接原種、栽培種，需要60-75天，本技術45-60天，可縮短菌種培養周期15天。
[0120] 冬小包腳菇菌種的鑒定:
[0121]菌落特征:白色，菌絲絨毛狀，匍匐生長，菌落邊緣整齊，邊緣與中央部位顏色一致，質地均勻。
[0122]菌絲體特征:肉眼觀察菌絲體白色，顯微鏡下菌絲透明，分枝，有隔，初生菌絲體纖細，次生菌絲體較粗壯。
[0123]經過出菇試驗證明，本實施例中獲得的為冬小包腳菇菌種的實體。
[0124]實施例3
[0125]一種冬小包腳菇的菌種培養基，質量百分百:玉米芯80%，米糠18%，過磷酸鈣1%，葡萄糖1% ;要求:
[0126]玉米芯:無霉變，含水量≤12%，粉碎顆粒≤5mm ；
[0127]米糠:無霉變，含水量< 13% ；
[0128]過磷酸鈣:含有效P20518%，其中87.5%溶于水；
[0129]葡萄糖:化學純；
[0130]所述培養基的水分，含水量達到:52.5%。
[0131]一種冬小包腳菇的菌種培養基的制備方法，包括步驟如下:
[0132]第一步，準備原料:按照質量百分比玉米芯80%，米糠18%，過磷酸鈣1%，葡萄糖1% ;要求:
[0133]玉米芯:無霉變，含水量≤12%，粉碎顆粒≤5mm ；
[0134]米糠:無霉變，含水量< 13% ；
[0135]過磷酸鈣:含有效P20518%，其中87.5%溶于水；
[0136]葡萄糖:化學純；
[0137]第二步，培養基制作:稱取上述配方的玉米芯于容器中，加入沸水使其全部淹沒原料，浸泡lh，過濾去水分，加入上述配方的米糠、過磷酸鈣、蔗糖，攪拌均勻，形成培養基；檢查并調整所述培養基的水分，含水量52.5%。
[0138]第三步，裝瓶:將第二步中制備的培養基裝入菌種瓶中，裝量至菌種瓶瓶肩，壓緊瓶內表面的培養基，松緊程度為:將菌種瓶倒置，培養基不下落；然后，用清水洗凈瓶外，再用紗布伸進瓶內，洗凈瓶口瓶肩，擦干瓶口水分，塞上棉塞，用牛皮紙抱住瓶口，捆扎；
[0139]第四步，滅菌:所述菌種瓶放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在1.5kg/cm2壓力下，保持Ih ；將滅菌好的所述菌種瓶移到超凈工作臺內，讓其自然冷卻，形成成品菌種瓶。
[0140]一種利用所述的冬小包腳菇的菌種培養基的冬小包腳菇的菌種培養方法，包括步驟如下:
[0141]第一步，菌種分離:
[0142]I)取當天采集的新鮮未全開傘的冬小包腳菇子實體，本實施例中，冬小包腳菇子實體2010年4月6日采自貴州省龍里縣。
[0143]剪去菌柄基部泥土，用無菌濕脫脂棉擦去菌蓋上的雜物，裝入經過滅菌的塑料袋，放到塑料盒中并及時帶回實驗室；[0144]2)用75%酒精棉擦拭所述無菌塑料袋外壁，移到超凈工作臺，無菌條件下，用解剖刀劃開所述無菌塑料袋一小口，使菌蓋頂部剛好露出，再用解剖刀削去菌蓋表皮，露出菌蓋內的白色組織，挑取白色組織約5mm大小作為組織塊，將所述組織塊接入菌種瓶培養基中部，使其與培養基有較好接觸。
[0145]第二步，培養并轉接:
[0146]I)將所述成品菌種瓶置于20°C恒溫箱培養。每天觀察接入的所述組織塊的萌發狀況:若所述組織塊及周圍無污染，單菌落，為正常，菌種分離成功；否則為污染，要及時檢出；
[0147]2)對上述正常萌發，形成單一菌落的所述菌種瓶，不等長滿瓶，當菌絲開始吃料，在培養基上形成一圈直徑為2.5cm~3.5cm菌落時，及時轉接，使之純化；轉接所使用的培養基和第一步中的培養基相同，轉接方法如下:
[0148]SI，在超凈工作臺無菌條件下，用接種針挑取菌落的邊緣菌絲體，轉接到另一個菌種瓶培養基上，置于20°C恒溫箱培養；每天觀察接入菌體生長狀況，菌絲吃料，生長整齊，濃密，健壯， 無污染，為正常，進入下一步；
[0149]S2，再按相同方法，再進行2次以上的轉接，形成為冬小包腳菇菌種。
[0150]本發明采用組織分離法，不經過試管培養，直接接入經制備好的玉米芯+米糠+過磷酸鈣+葡萄糖原料培養基培養，通過轉接純化，成功獲得了冬小包腳菇純培養菌種。本發明具有分離及培養基制作方便、不經過試管分離培養，縮短了菌種培養周期。本實施例中，用時75天，而現有技術中通常經過試管分離，純化，培養，獲得母種，再轉接原種、栽培種，需要60-75天，本技術45-60天，可縮短菌種培養周期15天。
[0151]冬小包腳菇菌種的鑒定:
[0152]菌落特征:白色，菌絲絨毛狀，匍匐生長，菌落邊緣整齊，邊緣與中央部位顏色一致，質地均勻。
[0153]菌絲體特征:肉眼觀察菌絲體白色，顯微鏡下菌絲透明，分枝，有隔，初生菌絲體纖細，次生菌絲體較粗壯。
[0154]經過出菇試驗證明，本實施例中獲得的為冬小包腳菇菌種的實體。
[0155]可見，現有技術中通常經過試管分離，純化，培養，獲得母種，再轉接原種、栽培種，需要60-75天，本技術45-60天，可縮短菌種培養周期15天。
[0156]以上通過具體的和優選的實施例詳細的描述了本發明，但本領域技術人員應該明白，本發明并不局限于以上所述實施例，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種冬小包腳菇的菌種培養基，其特征在于: 質量百分百:玉米芯80%，米糠18%，過磷酸鈣1%，葡萄糖1% ； 要求: 玉米芯:無霉變，含水量≤12%，粉碎顆粒≤5mm ； 米糠:無霉變，含水量< 13% ； 過磷酸鈣:含有效P2O5H%~20%，其中80%~95%溶于水； 葡萄糖:化學純； 所述培養基的水分，含水量達到:50%~55%。
2.—種根據權利要求1所述的冬小包腳燕的菌種培養基的制備方法，其特征在于，包括步驟如下: 第一步，準備原料:按照質量百分比玉米芯80 %，米糠18 %，過磷酸鈣I %，葡萄糖I % ； 要求: 玉米芯:無霉變，含水量≤12%，粉碎顆粒≤5mm ； 米糠:無霉變，含水量< 13% ； 過磷酸鈣:含有效P20514%~20%，其中80%~95%溶于水； 葡萄糖:化學純； 第二步，培養基制作:稱取上述配方的玉米芯于容器中，加入沸水使其全部淹沒原料，浸泡0.Sh~1.2h，過濾去水分，加入上述配方的米糠、過磷酸鈣、蔗糖，攪拌均勻，形成培養基；檢查并調整所述培養基的水分，含水量50%~55%。
3.根據權利要求2所述的冬小包腳菇的菌種培養基的制備方法，其特征在于:還包括步驟如下: 第三步，裝瓶:將第二步中制備的培養基裝入菌種瓶中，裝量至菌種瓶瓶肩，壓緊瓶內表面的培養基，松緊程度為:將菌種瓶倒置，培養基不下落；然后，用清水洗凈瓶外，再用紗布伸進瓶內，洗凈瓶口瓶肩，擦干瓶口水分，塞上棉塞，用牛皮紙抱住瓶口，捆扎； 第四步，滅菌:所述菌種瓶放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在1.5kg/cm2壓力下，保持Ih ;將滅菌好的所述菌種瓶移到超凈工作臺內，讓其自然冷卻，形成成品菌種瓶。
4.一種利用權利要求1所述的冬小包腳燕的菌種培養基的冬小包腳燕的菌種培養方法，其特征在于，包括步驟如下: 第一步，菌種分離: 1)取當天采集的新鮮未全開傘的冬小包腳菇子實體，剪去菌柄基部泥土，用無菌濕脫脂棉擦去菌蓋上的雜物，裝入經過滅菌的塑料袋，放到塑料盒中并及時帶回實驗室； 2)用75%酒精棉擦拭所述無菌塑料袋外壁，移到超凈工作臺，無菌條件下，用解剖刀劃開所述無菌塑料袋一小口，使菌蓋頂部剛好露出，再用解剖刀削去菌蓋表皮，露出菌蓋內的白色組織，挑取白色組織約5mm大小作為組織塊，將所述組織塊接入菌種瓶培養基中部，使其與培養基有較好接觸。 第二步，培養并轉接: I)將所述成品菌種瓶置于18°C~22°C恒溫箱培養。每天觀察接入的所述組織塊的萌發狀況:若所述組織塊及周圍無污染，單菌落，為正常，菌種分離成功；否則為污染，要及時檢出；2)對上述正常萌發，形成單一菌落的所述菌種瓶，不等長滿瓶，當菌絲開始吃料，在培養基上形成一圈直徑為2.5cm~3.5cm菌落時，及時轉接，使之純化；轉接所使用的培養基和第一步中的培養基相同，轉接方法如下: SI，在超凈工作臺無菌條件下，用接種針挑取菌落的邊緣菌絲體，轉接到另一個菌種瓶培養基上，置于18°C~22°C恒溫箱培養；每天觀察接入菌體生長狀況，菌絲吃料，生長整齊，濃密，健壯，無污染，為正常，進入下一步； S2，再按相同方法，再 進行2次以上的轉接，形成為冬小包腳菇菌種。
【文檔編號】C05G1/00GK103980027SQ201410234837
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月29日 優先權日:2014年5月29日
【發明者】潘高潮, 夏榮盛, 鄒方倫, 龍漢武, 陳宵 申請人:貴州省山地資源研究所