人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法
【專利摘要】本發明提供一種人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，該方法包括從從剛離體的大腸癌標本上切取腫瘤邊緣魚肉樣的無壞死腫瘤組織；將該腫瘤組織剪成0.8-1.3mm3的小塊后，進行原代移植與傳代移植，最終通過傳代移植的瘤模型來研究個體特異性，如某一個體對化療藥物或放射治療的敏感性。
【專利說明】人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及，尤其涉及一種人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法。
【背景技術】
[0002]大腸癌是消化道常見腫瘤，惡性程度高，嚴重威脅人類健康，而且大腸癌的發病率呈逐年上升趨勢。因此，大腸癌的研究己受到外科界的關注。為了更好地研究大腸癌的生物學特性、癌變機制、腫瘤診斷、抗癌藥物篩選、腫瘤與宿主的關系、腫瘤侵襲與轉移的過程以及治療措施的有效性，建立穩定、可靠和重復性好的動物模型是十分必要的。動物模型具有避免在人體上進行實驗所帶來的風險:可以嚴格控制實驗條件，增加實驗材料的可比性；克服腫瘤的潛伏期短、病程長和發病率低的缺點，提高實驗研究的效率；簡化實驗操作、日常管理和各種樣品的收集；有助于更全面地認識人類腫瘤本質等優點。建立合適的大腸癌動物模型，是進行大腸癌實驗研究的必備條件。[0003]人類疾病的動物模型是指各種醫學科學研究中建立的具有人類疾病模擬表現的動物。借助于動物模型可以有意識地改變那些在自然條件下不可能或不易排除的因素，以便更準確地觀察模型的實驗結果并與人類疾病進行比較研究，有助于更方便，更有效地認識人類疾病的發生發展規律，研究防治措施。小鼠與人類在遺傳學、病理學、生物學等許多特性方面都非常相似，是腫瘤研究的理想動物。理想的小鼠腫瘤模型應能模擬并真實地重復人類腫瘤的自然發生、發展過程，并具有與之相同的病理和生化特點。大腸癌是消化道常見腫瘤，惡性程度高，嚴重威脅人類健康，而且大腸癌的發病率呈逐年上升趨勢。因此，大腸癌的研究己受到外科界的關注。
[0004]目前大腸癌動物的腫瘤模型的建立大多數采用單一的細胞株移植于實驗動物體內而實現。這種模型的優點是細胞株通過數十代的傳代，成瘤率高，生長穩定。缺點是腫瘤細胞來源單一，對于需要研究個體化如化療藥物敏感性方面就顯示出局限性，不能反應人類腫瘤生物學特性個體變化巨大的特點，因此,對于一些需要研究個體特異性的如某一個體對化療藥物或放射治療的敏感性等時，單一的細胞株動物模型就不能勝任。
【發明內容】
[0005]本發明直接利用人大腸癌新鮮腫瘤組織接種于裸小鼠皮下建立模型，所建模型可反映患者的個體特征，同時也代表了臨床多樣性,能夠針對個體特異性來研究某一個體對化療藥物或放射治療的敏感性。
[0006]一種人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，包括以下步驟:
[0007](I)、從剛離體的大腸癌標本上切取腫瘤邊緣魚肉樣的無壞死腫瘤組織，用生理鹽水反復沖洗后浸泡于含雙抗的RPMI1640液中，放入冰盒中迅速送往實驗室，在超凈工作臺上取出標本，放入培養皿中，用含雙抗的PBS液反復沖洗，剪除標本外部的脂肪及壞死組織；所述雙抗為青霉素和鏈霉素，兩者濃度均為500U/ml ；
[0008](2)、在培養皿中，用眼科剪將腫瘤組織剪成0.8-1.3mm3的小塊；[0009](3)、原代移植，用濃度為70mg/kg的戊巴比妥鈉經腹腔注射裸鼠，用鑷子將腫瘤組織塊塞到20號穿刺針的針孔中，然后用穿刺針移植于裸鼠腋下或腹股溝皮下組織內，或于裸鼠皮膚上剪一小切口，經切口在皮下組織內適度分離出一小腔隙，用眼科鑷將腫瘤組織塊塞入腔隙內，最后縫合切口 ；每例標本原代接種10只裸鼠，共5例；
[0010](4)、原代移植后，用游標卡尺測量腫瘤的最大直徑Dmax和最小直徑Dmin，按公式V = 1/2XDmaxXDmin2計算腫瘤體積,待原代荷瘤鼠的瘤體達300~500mm3時，隨機取其中I只進行傳代；
[0011](5)、傳代移植，將隨機選取的荷瘤鼠I只采用拉脫頸椎法處死動物，體表消毒，無菌條件下剖出移植瘤組織，將腫瘤組織放入玻璃均漿器中，加適量無菌生理鹽水研磨后，經濾網過濾成單個的細胞懸液，用0.4%臺盼藍染色法計數活細胞數，將細胞濃度調整至5X106~5X107/ml，用Iml的注射器注射到荷瘤鼠腋下或腹股溝皮下組織內，每點接種
0.2ml，每例接種25只，共5例。
[0012]進一步地，如上所述的人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，步驟2還包括用眼科剪在剪切過程中向腫瘤組織上滴加1-2滴RPMI1640液，以保持濕潤。
[0013]進一步地，如上所述的人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，在步驟5之后，還包括以下步驟:
[0014]將原代與傳荷瘤鼠均于接種后9周處死，所有荷瘤鼠均剖出腫瘤組織，10%甲醛固定，制作石蠟切片，蘇木素一伊紅染色，光鏡下觀察，并與患者原發腫瘤進行對比。
[0015]本發明以大腸癌患者手術切除腫瘤組織為瘤源，接種于裸鼠體內，通過原代移植與傳代移植進行建模，經過傳代移植后的瘤成活率高；通過觀察腫瘤生長特征，建立一種代表個體化的大腸癌裸鼠移植模型，并為進一步對大腸癌的個體化研究提供一種新的模型系統，利用此模型來測試患者腫瘤細胞對放、化療等治療措施的敏感性，為臨床治療提供參考資料，實現腫瘤治療的個體化以提高治療的效果。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為傳代荷瘤鼠腫瘤移植生長曲線圖；
【具體實施方式】
[0017]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面本發明中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0018]實施例:
[0019]步驟1:原代裸鼠移植瘤模型的建立
[0020] 從剛離體的大腸癌標本上切取腫瘤邊緣魚肉樣的無壞死腫瘤組織，用生理鹽水反復沖洗后浸泡于含雙抗(內含青霉素和鏈霉素各500U/ml)的RPMI1640液中，放入冰盒中迅速送往實驗室，在超凈工作臺上取出標本，放入培養皿中，用含雙抗的PBS液反復沖洗，剪除標本外部的脂肪及壞死組織；在培養皿中，用眼科剪將組織剪成Imm3左右的小塊，剪切過程中適當向組織上滴加1-2滴RPMI1640液，以保持濕潤；用戊巴比妥鈉(70mg/kg)經腹腔注射裸鼠，用鑷子將組織塊塞到20號穿刺針的針孔中，然后用穿刺針移植于裸鼠腋下(或腹股溝)皮下組織內，或于裸鼠皮膚上剪一小切口，經切口在皮下組織內適度分離出一小腔隙，用眼科鑷將腫瘤組織塊塞入腔隙內，最后縫合切口。每例標本原代接種10只裸鼠，共5例。
[0021 ] 步驟2:裸鼠成瘤情況
[0022]原代移植后每日觀察裸鼠的精神、飲食、活動、大小便等一般情況，移植處皮下是否成瘤。從接種之日起至接種部位出現肉眼可見的移植瘤時為潛伏期，發現成瘤后開始每周用游標卡尺測量腫瘤的最大直徑(Dmax)和最小直徑(Dmin)，按公式V =1/2 X DmaxX (Dmin) 2計算腫瘤體積，并畫出腫瘤體積時間生長曲線,待原代荷瘤裸鼠的瘤體達300~500mm3左右時(約20~30天)，隨機取其中I只進行傳代。
[0023]步驟3:傳代裸鼠移植瘤模型的建立
[0024]為了解決成本，本發明當原代移植成功后，繼續進行傳代裸鼠移植瘤模型的建立，其方法為:隨機選取其中的荷瘤鼠I只，拉脫頸椎法處死動物，體表消毒，無菌條件下剖出移植瘤組織，將腫瘤組織放入 玻璃均漿器中，加適量無菌生理鹽水研磨后，經濾網過濾成單個的細胞懸液，用0.4%臺盼藍染色法計數活細胞數，將細胞濃度調整至5X IO6~5X IO7/ml，用Iml的注射器注射到裸鼠腋下(或腹股溝)皮下組織內，每點(即每個接種的部位)接種0.2ml，每例接種25只，共5例。
[0025]步驟4:病理學檢查
[0026]原代與傳代荷瘤鼠均于接種后9周處死，所有荷瘤鼠均剖出腫瘤組織，10%甲醛固定，制作石蠟切片，蘇木素一伊紅(HE)染色，光鏡下觀察，并與患者原發腫瘤進行對比。
[0027]表1、表2分別是原代荷瘤鼠與傳代荷瘤鼠移植成瘤率的高低以及腫瘤生長的變化。原代接種共50只，成活20只，成功率為40% (20/50)，傳代接種共125只，成活93只，成功率為74.4% (93/125)。見表1和表2。可見，通過傳代移植后，成功率更高，因此，在建模的過程中增加傳代移植建模，可降低本發明建模的成本。
[0028]表1原代裸鼠皮下移植瘤成活率及潛伏期(Xfs) (η = 10)
[0029]觀察指標
[0030]
組別成話例數成話率14潛伏期(d )
第—例33015.66 士 1.52
第二例44014.33 士 2.51
第三例55013.66 士 2.08
第四例44013.33 士 2.43
第五例44014.63 士 2.32[0031]表2傳代裸鼠皮下移植瘤成活率及潛伏期(rfs) (η = 25)
[0032]觀察指標
[0033]
【權利要求】
1.一種人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、從剛離體的大腸癌標本上切取腫瘤邊緣魚肉樣的無壞死腫瘤組織，用生理鹽水反復沖洗后浸泡于含雙抗的RPMI1640液中，放入冰盒中迅速送往實驗室，在超凈工作臺上取出標本，放入培養皿中，用含雙抗的PBS液反復沖洗，剪除標本外部的脂肪及壞死組織；所述雙抗為青霉素和鏈霉素，兩者濃度均為500U/ml ； (2)、在培養皿中，用眼科剪將腫瘤組織剪成0.8-1.3mm3的小塊； (3)、原代移植，用濃度為70mg/kg的戊巴比妥鈉經腹腔注射裸鼠，用鑷子將腫瘤組織塊塞到20號穿刺針的針孔中，然后用穿刺針移植于裸鼠腋下或腹股溝皮下組織內，或于裸鼠皮膚上剪一小切口，經切口在皮下組織內適度分離出一小腔隙，用眼科鑷將腫瘤組織塊塞入腔隙內，最后縫合切口 ；每例標本原代接種10只裸鼠，共5例； (4)、原代移植后，用游標卡尺測量腫瘤的最大直徑Dmax和最小直徑Dmin，按公式V=1/2 X Dmax X Dmin2計算腫瘤體積，待原代荷瘤鼠的瘤體達300~500mm3時，隨機取其中I只進行傳代； (5)、傳代移植，將隨機選取的荷瘤鼠I只采用拉脫頸椎法處死動物，體表消毒，無菌條件下剖出移植瘤組織 ，將腫瘤組織放入玻璃均漿器中，加適量無菌生理鹽水研磨后，經濾網過濾成單個的細胞懸液，用0.4%臺盼藍染色法計數活細胞數，將細胞濃度調整至5X IO6~5X107/ml，用Iml的注射器注射到荷瘤鼠腋下或腹股溝皮下組織內，每點接種0.2ml，每例接種25只，共5例。
2.根據權利要求1所述的人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，其特征在于，步驟2還包括用眼科剪在剪切過程中向腫瘤組織上滴加1-2滴RPMI1640液，以保持濕潤。
3.根據權利要求1所述的人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，其特征在于，在步驟5之后，還包括以下步驟: 將原代與傳荷瘤鼠均于接種后9周處死，所有荷瘤鼠均剖出腫瘤組織，10%甲醛固定，制作石蠟切片，蘇木素一伊紅染色，光鏡下觀察，并與患者原發腫瘤進行對比。
【文檔編號】A61D1/00GK103976803SQ201410225860
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月26日 優先權日:2014年5月26日
【發明者】顏登國, 張東興, 龔慧 申請人:貴陽醫學院附屬醫院