一種爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊的制備方法
【專利摘要】本發明涉及害蟲生物防治【技術領域】，具體公開了一種爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊的制備方法，所述分生孢子微膠囊以爪哇棒孢霉菌Isaria?javanicus的分生孢子懸浮液為囊心，以等量明膠與阿拉伯膠所形成的復合膠為囊壁，并以轉谷氨酰胺酶作為固化劑通過復凝聚反應制備得到。所制得的分生孢子微膠囊外形呈球形，大小均勻，表面光滑，平均粒徑為20～30μm左右；所述微膠囊貯藏期長，抗紫外能力強，可以延長真菌殺蟲劑的貨架期壽命，同時增強農藥的貯藏穩定性和生物防蟲效果，在農作物防蟲方面具有實際的應用價值。
【專利說明】一種爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及害蟲生物防治【技術領域】，更具體地，涉及一種爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊的制備方法。
【背景技術】
[0002]目前，大量使用化學殺蟲劑仍然是防治害蟲最主要的方法，然而，化學殺蟲劑的使用不僅費用投入較高，且對環境造成污染，影響食品安全；同時還會致使害蟲對殺蟲劑產生抗性，這些缺點使得人們越來越重視發展害蟲生物防治技術。
[0003]蟲生真菌資源豐富，對人、畜無毒害，且不會造成環境污染，因此真菌治蟲在害蟲生物防治中占有重要地位。然而，真菌殺蟲劑因為本身是生命體，對高溫、干旱及紫外線等環境因子敏感，作為防蟲制劑的貨架壽命短，防治效 果不穩定，影響了其發展與應用。因此發展劑型加工技術是解決真菌殺蟲劑的穩定性和延長貨架壽命的重要途徑。目前，真菌殺蟲劑已研制出的劑型主要有:原粉劑、粉劑、可濕性粉劑、油劑、顆粒劑及無紡布菌條等。
[0004]微膠囊制劑是20世紀30年代開發的新劑型，在70年代中期得到了迅猛發展。微膠囊技術是一種新劑型加工技術，微膠囊化能保護有效成份提高其抗逆能力，能使有效成份緩慢釋放提高藥效。在我國，活菌微膠囊技術發明以細菌為主，真菌微膠囊很少，說明我國蟲生真菌微膠囊技術還處在初級發展階段。
[0005]申請號為201110457248.7的中國發明專利公開一種白僵菌微膠囊劑技術，由白僵菌分生孢子、高嶺土、水制成的菌懸液為囊心，由海藻酸鈉為囊壁，在正十六烷、玉米油和卵磷脂不同比例分散劑中分散，通過鈣離子進行交聯，使微膠囊固化成粒徑小于100 μπι的具有包膜的微小顆粒。白僵菌分生孢子萌發時芽管可穿破囊壁包膜。該微膠囊劑中還加入了分生孢子萌發營養液，提高了分生孢子的萌發率和萌發速度，可有效阻隔外界紫外線、干旱等不良環境對分生孢子的影響，在相同溫度、濕度及紫外線影響下萌發率較高，對農林害蟲具有較好的防治效果。
[0006]趙軍的“球孢白僵菌微膠囊劑的研制”的研究中，以重要茶樹小綠葉蟬為目標害蟲，篩選出球孢白僵菌菌株，并研制出適用的微膠囊劑型。
[0007]真菌的分生孢子對外界環境，如溫度、濕度、光照等，較為敏感，真菌殺蟲劑劑型的加工要比化學殺蟲劑復雜的多。爪睡棒孢霉(J1SariaJaraflicw1S)是一類重要的蟲生真菌，其分布廣，寄主多，常用于防治小菜蛾、蚜蟲、粉虱等重要害蟲。現有技術中還沒有針對爪哇棒孢霉的所制備得到的包埋率高、殺蟲效果優秀的微膠囊制劑。
【發明內容】
[0008]本發明所要解決的技術問題是克服現有棒孢霉真菌殺蟲劑應用技術的不足，提供一種爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊的制備方法。
[0009]本發明的另一個目的是提供上述方法制備得到的爪哇棒孢霉分生孢子微膠囊，所述微膠囊具有潛在和重要的推廣應用價值。[0010]本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的:
本發明提供了一種爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊的制備方法，即將爪哇棒孢霉菌Isariajavanicus分生孢子純粉(簡稱純孢粉，其含水量小于3%,分生孢子含量大于5 X IO11個，下同)、0.05%吐溫80溶液制成的菌懸液與10~20% w/v明膠溶液混合后加入與明膠等質量的10~20% w/v阿拉伯膠溶液進行復凝聚反應，以轉谷氨酰胺酶為固化劑進行交聯，最后過篩和冷凍干燥得到粒徑20~30 Mm左右的微膠囊。
[0011]本發明針對所要包裹的內含物，即具有生物活性的分生孢子，經過探索性實驗選擇了等量明膠和阿拉伯膠(簡稱復合膠)為囊壁；本發明還特別的選擇轉谷氨酰胺酶代替甲醛作為固化劑，所包裹得到微膠囊不僅包埋率高，且無毒、安全。
[0012]上述爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊的制備方法包括以下步驟:
51.將爪哇棒孢霉菌純孢粉與0.05%的吐溫80溶液按照質量體積比為1:10(g/mL)的比例混合得到菌懸液；
52.將菌懸液與10~20%w/v明膠溶液混合后，加入10~20% w/v阿拉伯膠溶液進行復凝聚反應；明膠與阿拉伯膠等質量；
53.以轉谷氨酰胺酶為固化劑進行交聯，轉谷氨酰胺酶的用量為0.25 g/g明膠；過篩、冷凍干燥得到微膠囊。
[0013]優選地，SI所述爪哇棒孢霉菌分生孢子純粉與復合膠的質量比為0.5~1.5:10。
[0014]優選地，SI 所述菌懸液由爪哇棒孢霉菌純孢粉與0.05%吐溫80溶液通過渦旋攪拌配制而成，所述爪睡棒孢霉菌純孢粉與吐溫80溶液的質量體積比為1:10 (g/mL)。
[0015]優選地，S2所述10~20% w/v明膠溶液由明膠經浸泡溶脹后加熱溶解得到；所述10~20% w/v阿拉伯膠溶液由阿拉伯膠加水并水浴加熱至80°C，緩慢攪拌溶解得到；制備得到明膠溶液與阿拉伯膠溶液均在40°C下保溫備用。
[0016]優選地，S2所述復凝聚反應包括以下步驟:
521.40°C條件下，將10~20% w/v明膠溶液與菌懸液混合，攪拌均勻；反應5min后向上述混合液中加入與明膠等質量的10~20% w/v阿拉伯膠溶液，攪拌均勻，得到含復合膠12~18%w/v的水包油乳液；
522.將水包油乳液不斷攪拌，轉速600~800轉/min，滴加10%醋酸調節pH值至
3.6~4.0，溶液冷卻至35~38°C，進行成囊反應，反應時間為12~18min。
[0017]優選地，S3所述轉谷氨酰胺酶的用量為0.25 g/g明膠。
[0018]優選地，以轉谷氨酰胺酶為固化劑進行交聯反應步驟為:復凝聚反應后將其置于冰浴中，繼續攪拌至10°c以下，加入轉谷氨酰胺酶作為固化劑，繼續攪拌15min，再用10%NaOH溶液調其pH至8~9，繼續攪拌20min，觀察至有膠囊析出為止，靜置待微囊沉降。
[0019]作為一種優選方式，上述爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊的制備方法包括以下步驟:
51.囊心的制備:將爪哇棒孢霉菌分生孢子純粉與0.05%的吐溫80溶液按照質量體積比為1:10 (g/mL)的比例混合得到菌懸液；
52.囊壁的制備:取適量明膠，用蒸餾水浸泡溶脹后，水浴加熱溶解形成質量濃度為10~20%w/v的明膠溶液；另取與明膠等量的阿拉伯膠，加蒸餾水，水浴加熱至80°C，緩慢攪拌溶解形成質量濃度為10~20%w/v的阿拉伯膠溶液；所述明膠溶液與阿拉伯膠溶液均在40°C下保溫備用；
優選地，SI所述爪哇棒孢霉菌分生孢子純粉與S2所述明膠和阿拉伯膠總和的質量比為 0.5 ~1.5:10 ;
S3.微I父囊制備
40°C條件下，將10~20% w/v明膠溶液與菌懸液混合，緩慢攪拌均勻；反應5min后向上述混合液中加入與明膠等質量的10~20% w/v阿拉伯膠溶液，繼續攪拌使之充分混合，得到含復合膠12~18%w/v的水包油乳液；
將水包油乳液不斷攪拌，轉速600~800轉/min，滴加10%醋酸調節pH值至3.6~4.0，溶液冷卻至35~38°C，進行成囊反應，反應時間為12~18min ；
成囊反應后置于冰浴中，繼續攪拌至10°C以下，加入轉谷氨酰胺酶作為固化劑，繼續攪拌15min，再用10% NaOH溶液調其pH至8~9，繼續攪拌20min，觀察至有膠囊析出為止，靜置待微囊沉降。
[0020]本發明還提供了上述方法制備得到的爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊。優選地，所述微膠囊的粒徑為20~30 μ m。
[0021]與現有技術相比，本發明具有以下技術效果: 本發明提供了一種爪哇棒孢霉分生孢子微膠囊的制備方法，所述方法使用的原料成本低，且無毒安全，適用于生物防治技術，該方法操作簡易，具有潛在和重要的推廣應用價值。
[0022]本發明還提供了上述方法制備得到的微膠囊，本發明選用特定的物質作為壁材，不僅很好的包裹和保護分生孢子，還可以延長真菌殺蟲劑的貨架壽命；爪哇棒孢霉菌Isaria javanicusS?0^?>菌株分生孢子微膠囊的孢子萌發率在忙存180天后仍然保持在90%以上。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊制備流程圖；
圖2采用不同固化劑所制備得到的微膠囊的成囊率和分生孢子的萌發率；分生孢子短期萌發率是指微膠囊制成后2天內測定的萌發率；長期萌發率是指存儲120天以后的萌發率；甲醛(FM) 0.3/0.6/1.2 mL/g 明膠；轉谷氨酰胺酶(Tgase) 0.13/0.25/0.5 g/g 明膠；圖3為爪睡棒孢霉菌(Jsaria javanicus) SP053菌株分生孢子微膠囊掃描電鏡照片；其中，圖B為圖A的放大圖；
圖4為爪睡棒孢霉菌Usaria javanicus)S?0^?>菌株分生孢子微膠囊的分生孢子萌發率與貯存時間的關系；
圖5為爪睡棒孢霉菌Usaria javanicus)S?0^?>菌株分生孢子微膠囊對紫外光的耐受能力。
【具體實施方式】
[0024]下面通過實施例和附圖對本發明進一步具體描述。下述所使用的實驗方法若無特殊說明，均為本【技術領域】現有常規的方法，所使用的配料或材料，如無特殊說明，均為通過商業途徑可得到的配料或材料；本發明不應限制于實施例范圍。
[0025]實施例1 10% (純孢粉/復合膠W/W)爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊的制備圖1為爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊劑的制備流程圖，具體包括如下步驟:
S1.囊心的制備:取爪哇棒孢霉菌SP053菌株的純孢粉lg，加10 mL 0.05%的吐溫80溶液，渦旋攪拌，配制菌懸液，備用。
[0026]S2.囊壁的制備:取明膠5g，加蒸餾水35 mL浸泡溶脹后，加熱溶解成溶液；取阿拉伯膠5克，加蒸餾水35 mL加熱至80°C左右溶解成溶液；兩溶液均40°C保溫備用。
[0027]S3.微膠囊制備:在40°C水浴條件下，將明膠溶液與囊心材料混合，輕輕攪拌均勻。5min后向混合液加入與明膠等質量的阿拉伯膠溶液形成復合膠，所述復合膠的濃度為12.5%，繼續攪拌充分混合均勻，形成水包油乳液，在700轉/min速度下不斷攪拌下，滴加10%醋酸調節pH值至3.6~4.0,溶液自然冷卻至35°C,繼續攪拌15min進行復凝聚化成囊反應。然后，冰浴條件下，繼續攪拌使溫度降至10°C以下，加入1.25g轉谷氨酰胺酶，繼續攪拌15min，再用10% NaOH溶液調其pH8~9，繼續攪拌20min左右至膠囊析出為止，靜置待微囊沉降。將固化后的微膠囊用蒸餾水進行洗滌，過篩(320目)，收集，冷凍干燥后等到分生孢子微膠囊劑。
[0028]實施例2 5% (純孢粉/復合膠W/W)爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊的制備 圖1為爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊劑的制備流程圖，具體包括如下步驟:
S1.囊心的制備:取爪哇棒孢霉菌SP053菌株的純孢粉0.5g，加5 mL0.05%的吐溫80溶液，渦旋攪拌，配制菌懸液，備用。
[0029]S2.囊壁的制備:取明膠5g，加蒸餾水35 mL浸泡溶脹后，加熱溶解成溶液；取阿拉伯膠5g，加蒸餾水35 mL加熱至80°C左右溶解成溶液；兩溶液均40°C保溫備用。
[0030]S3.微膠囊制備:在40°C水浴條件下，將明膠溶液與囊心材料混合，輕輕攪拌均勻。5min后向混合液加入與明膠溶液等量的阿拉伯膠溶液形成復合膠，所述復合膠的濃度為13.3%，繼續攪拌充分混合均勻，形成水包油乳液，在600轉/min速度下不斷攪拌下，滴加 10%醋酸調節pH值至3.6~4.0，溶液自然冷卻至35°C，進行復凝聚化成囊反應15min。然后，冰浴條件下，繼續攪拌至溫度降至10°C以下，加入1.25g轉谷氨酰胺酶，繼續攪拌15min，再用10% NaOH溶液調其pH8~9，繼續攪拌20min左右至膠囊析出為止，靜置待微囊沉降。將固化后的微膠囊用蒸餾水進行洗滌，過篩(320目)，收集，冷凍干燥后等到分生孢子微膠囊。
[0031]對比例I爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊的制備
按照實施例1所述方法制備爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊劑，唯一不同的就是所選用的固化劑為甲醛。
[0032]結果如圖2所示，當選用的固化劑為甲醛(FM)時，所制備得到的微膠囊的成囊率及分生孢子萌發率均明顯低于選用轉谷氨酰胺酶(Tgase)為固化劑所制備得到的微膠囊的成囊率和分生孢子萌發率；同時，所選用的轉谷氨酰胺酶以0.25g/g明膠最佳。
[0033]對比例2正交設計爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊的制備
按照實施例1所述方法制備爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊劑，采用正交試驗設計考察菌膠比(分生孢子與復合膠的質量比)、pH值、復合膠量、反應溫度、反應時間、攪拌轉速對包埋率的影響，確定影響因子的最優組合，結果表明，在設定的處理條理下，除了菌膠比對包埋率影響顯著外，其他因子都沒有顯著影響(表1，表2)。因此，最佳的成囊反應條件是:菌膠比(w/w)為5~10%，復合膠用量(w/v)12~18%、反應體系的pH值3.6~4.0、反應時間12~18 min、反應溫度35~38°C及攪拌轉速600~800 rpm，此條件下制備得到的微膠囊的包埋率達90%以上。
[0034]表1復凝聚反應微膠囊化正交優化設計結果
【權利要求】
1.一種爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.將爪哇棒孢霉菌分生孢子純粉與0.05%的吐溫80溶液按照質量體積比為1:10(g/mL)的比例混合得到菌懸液； 52.將菌懸液與10~20%w/v明膠溶液混合后，加入10~20% w/v阿拉伯膠溶液進行復凝聚反應；明膠與阿拉伯膠等質量； 53.以轉谷氨酰胺酶為固化劑進行交聯，轉谷氨酰胺酶的用量為0.25 g/g明膠；過篩、冷凍干燥得到微膠囊； 所述爪哇棒孢霉菌分生孢子純粉與明膠和阿拉伯膠總和的質量比為0.5~1.5:10。
2.根據權利要求1所述的爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊的制備方法，其特征在于，S2所述復凝聚反應包括以下步驟: 521.40°C條件下，將10~20% w/v明膠溶液與菌懸液混合，攪拌均勻；反應5min后向上述混合液中加入與明膠等質量的10~20% w/v阿拉伯膠溶液，攪拌均勻，得到水包油乳液； 522.將水包油乳液不斷攪拌，轉速600~800轉/min，滴加10%醋酸調節pH值至3.6~4.0，溶液冷卻至35~38°C，進行成囊反應，反應時間為12~18min。
3.根據權利要求1所述的爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊的制備方法，其特征在于，S3所述以轉谷氨酰胺酶為固化劑進行交聯反應步驟為:復凝聚反應后將其置于冰浴中，繼續攪拌至10°C以下，加入轉谷氨酰胺酶作為固化劑，繼續攪拌15min，再用10% NaOH溶液調其pH值至8~9，繼續攪拌20min，觀察至有膠囊析出為止，靜置待微囊沉降。
4.根據權利要求1至3任一項所述爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.囊心的制備:將爪哇棒孢霉菌分生孢子純粉與0.05%的吐溫80溶液按照質量體積比為1:10 (g/mL)的比例混合得到菌懸液； 52.囊壁的制備:取適量明膠，用蒸餾水浸泡溶脹后，水浴加熱溶解形成質量濃度為10~20%w/v的明膠溶液；另取與明膠等量的阿拉伯膠，加蒸餾水，水浴加熱至80°C，緩慢攪拌溶解形成質量濃度為10~20%w/v的阿拉伯膠溶液；所述明膠溶液與阿拉伯膠溶液均在40°C下保溫備用； SI所述爪哇棒孢霉菌分生孢子純粉與S2所述明膠和阿拉伯膠總和的質量比為0.5~1.5:10 ； 53.微I父囊制備 40°C條件下，將10~20% w/v明膠溶液與菌懸液混合，緩慢攪拌均勻；反應5min后向上述混合液中加入與明膠等質量的10~20% w/v阿拉伯膠溶液，繼續攪拌使之充分混合，得到水包油乳液； 將水包油乳液不斷攪拌，轉速600~800轉/min，滴加10%醋酸調節pH值至3.6~4.0，溶液冷卻至35~38°C，進行成囊反應，反應時間為12~18min ； 成囊反應后置于冰浴中，繼續攪拌至10°C以下，加入轉谷氨酰胺酶作為固化劑，繼續攪拌15min，再用10% NaOH溶液調其pH值至8~9，繼續攪拌20min，觀察至有膠囊析出為止，靜置待微囊沉降。
5.權利要求1至4任一項所述方法制備得到的爪哇棒孢霉菌分生孢子微膠囊。
【文檔編號】A01P7/04GK103975919SQ201410185758
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月5日 優先權日:2014年5月5日
【發明者】胡瓊波, 尹飛, 鐘國華, 翁群芳, 董廷艷 申請人:華南農業大學