一種僧帽牡蠣的人工繁育方法
【專利摘要】本發明公開了一種僧帽牡蠣的人工繁育方法。本發明通過采用形態與分子手段相結合鑒別親本，生態與室內相結合促熟性腺，自然排放與解剖方式相結合獲取配子，微充氣、不換水、不倒池培育子代等技術環節，成功培育健康僧帽牡蠣苗種，為其苗種生產、土著品種開發及其維護生物多樣性奠定了堅實的基礎。本發明顛覆了傳統貝類苗種繁育時大量換水、經常倒池、多種單胞藻同時投喂的習慣，大大節約了人力、物力、財力，創造了一種成本低廉、簡單高效的貝類苗種培育新模式。
【專利說明】一種僧帽牡蠣的人工繁育方法【技術領域】:
[0001]本發明屬于海洋農業中貝類苗種繁育【技術領域】，具體涉及一種僧帽牡蠣的人工繁育方法。
【背景技術】:
[0002]僧帽牡販Saccostrea cuculata分布于印度洋、太平洋及我國的華南沿海(福建、廣東、廣西、海南、香港、澳門)，從巖石、沙灘到紅樹林的潮間帶均有分布，是一個亞熱帶、熱帶類型的經濟種。
[0003]僧帽牡蠣作為我國華南沿海一個主要野生牡蠣類群，經常與熊本牡蠣Crassostrea sikamea、葡萄牙牡販C.angulata生活在一起，統稱為雜蛇。由于野生雜蟲毛味道鮮美，深受廣大消費者青睞，有較大的市場開發前景。其中，葡萄牙牡蠣苗種幾乎全部來自人工繁育，年產量在150萬噸左右，主要集中在福建地區；而熊本牡蠣人工育苗已經取得突破，學者們正在開展該產業的養殖示范推廣工作。由于我國牡蠣物種分類比較混舌L 一些學者們將葡萄牙牡販Crassotrea angulata俗稱為僧帽牡販S.cuculluta,導致出現了一些偽僧帽牡蠣的相關研究報道(張璽、樓子康，1957 ;陳和鵬，1992 ;林加涵、汪德耀，1983 ;曾志楠等，1994、1999 ;林琪等，2000 ;柯才煥等，2000)。然而，最近研究報道中，學者們雖然延用僧帽牡販的中文名稱，但是已經將拉丁文修訂為Crassostra angulata或者是 Crassostra gigas angulata (許菌等，2010 ;韓國棟等，2012 ;)。對此，Lam 和 Morton(2005，2006)、夏建軍(2008)及Wang et al.，(2010)等對我國僧帽牡蠣進行了重新定義，先前報道的僧帽牡蠣均為葡萄牙牡蠣，真正僧帽牡蠣S.cuculluta隸屬于小蠣屬，主要特點殼內緣具有柿齒，從鉸合部延伸到閉殼肌區域；而葡萄牙牡販C.gigas angulata殼內表面光滑無齒，兩類牡蠣是不同屬間的兩個物種，不可以將其混淆使用。
`[0004]根據夏建軍的研究報道(2008)，我國的僧帽牡蠣可以劃分為4種類型，分別為
S.cuculluta-B、S.cuculluta-D、S.cuculIuta-E 和 S.cuculluta-F。其中，S.cuculIuta-B和S.cuculluta-F較為常見，出現頻率較高。目前，該類群資源完全來自于野生采捕，尚無人工苗種養成。那么，作為小蠣屬的典型代表種能否進行人工繁育，采用何種技術手段可以成功的繁育出健康苗種成為本發明的創新點。
【發明內容】
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[0005]本發明的目的是為了擺脫華南沿海僧帽牡蠣資源完全依賴于野生采捕的窘境，解決當前沒有僧帽牡蠣人工苗種的現狀，而提供一種僧帽牡蠣苗種培育技術，即一種僧帽牡蠣的人工繁育方法，該方法具有操作簡便、成本低廉、實用性強、易于推廣等優點。
[0006]本發明的僧帽牡蠣的人工繁育方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0007](a)親本采集:在華南沿海采集2-3齡野生僧帽牡蠣作為親本；
[0008](b)性腺促熟:將僧帽牡蠣采用吊養的方式在蝦池中進行生態促熟或室內人工升溫促熟；其中，促熟時間與親本本身性腺發育度正相關，如果親本本身性腺好促熟時間相對較短，否則會相應延長；
[0009]( c )受精孵化:當親本性腺成熟時，采用降溫、陰干和流水刺激進行人工催產、受精和孵化，控制孵化密度為30-60個/ml，發育得到D形幼蟲；或者對于尚未鑒別好的親本，采取現場解剖，發現右殼邊緣有半圈或者一圈櫛齒者為僧帽牡蠣，采取解剖配子方式，獲取大量成熟配子，之后進行受精、孵化，控制孵化密度為30-60個/ml，發育得到D形幼蟲；
[0010](d)子代培育:將發育正常的D形幼蟲按照2-3個/ml密度進行幼蟲培育，當30%幼蟲出現眼點、鰓原基、足向外伸時，投放附著基進行人工采苗，然后進入稚貝培育階段，經過培育，即可獲得健康的僧帽牡蠣苗種，在此期間，微充氣、不換水、不倒池、幼蟲期投喂一種單胞藻和酵母粉，稚貝期間以蝦池水作為生物餌料，所述的單胞藻為綠色巴夫藻或云尾藻。
[0011]所述的在華南沿海采集2-3齡野生野生僧帽牡蠣作為親本，優選在華南沿海采集野生牡蠣樣品，由于其經常與熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣等其他牡蠣種類有生活重疊區域，首先根據殼內緣是否有櫛齒及其櫛齒分布來確定僧帽牡蠣，剔除掉其他類牡蠣；同時結合分子手段進行物種鑒別，進一步確認是僧帽牡蠣，然后再以確定為僧帽牡蠣的作為親本。通過形態與分子手段相結合可以鑒別親本。
[0012]所述的采用降溫、陰干和流水刺激進行人工催產優選為放置于4°C海水中1.5h、陰干3h、流水刺激0.5h進行人工催產。
[0013]所述的發育正常的D形幼蟲是采用320目篩絹網對步驟(C)的D形幼蟲進行優選，得到發育正常的D形幼蟲，之后再用于后續的幼蟲培育。
[0014]所述的蝦池水是指養蝦土塘中海水，由于養蝦過程中要投喂大量餌料，會出現殘料及其蝦糞等有機質，使其海水富營養化較高，含有大量多元化的單胞藻類及有機顆粒，營養豐富，是牡蠣稚貝良好的天然餌料。
[0015]本發明通過采用形態與分子手段相結合鑒別親本，生態與室內相結合促熟性腺，自然排放與解剖方式相結合獲取配子，微充氣、不換水、不倒池培育子代等技術環節，成功培育健康僧帽牡蠣苗種，為其苗種生產、土著品種開發及其維護生物多樣性奠定了堅實的基礎。本發明顛覆了傳統貝類苗種繁育時大量換水、經常倒池、多種單胞藻同時投喂的習慣，大大節約了人力、物力、財力，創造了一種成本低廉、簡單高效的貝類苗種培育新模式。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0016]圖1:僧帽牡蠣親本及其子代，a、B-型僧帽牡蠣；b、D-型僧帽牡蠣，C、B-型僧帽牡蠣子代；d、D-型僧帽牡蠣子代。
【具體實施方式】:
[0017]以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0018]實施例1
[0019](a)親本采集: 于2013年4月初在深圳東涌潮間帶采集2_3齡野生僧帽牡蠣樣品，解剖發現該類牡蠣右殼邊緣有半圈櫛齒，右殼表面無棘刺，確認為僧帽牡蠣，同時采用按照 Lam & Morton (Lam, K., Morton.Morphological and mitochondrial-DNA analysisof the indo-west pacific rock oysters(Ostreidae:Saccostrea speices)[J].Journalof Molluscan Studies, 2006，72:235-245)及夏建軍(夏建軍，華南近海牡蠣種類鑒定、分布和香港巨牡蠣微衛星開發及群體遺傳學研究[D].中國科學院南海海洋研究所博士學位論文，廣州，2008)的分類標準利用線粒體測序方法進一步確認為D-型僧帽牡蠣。對所采集到的120個樣品進行活體鑒定，發現有87個為僧帽牡蠣，25個為熊本牡蠣，8個為葡萄牙牡蠣。以僧帽牡蠣作為親本。
[0020](b)性腺促熟:將鑒別好的僧帽牡蠣親本裝鮑魚框中，采用吊養的方式在深圳市龍科源海產品有限公司的蝦池中進行室內促熟。微充氣，以小球藻、云尾藻、扁藻作為生物餌料，投喂量以水中微微泛綠為標準，保證親本有足夠的餌料。每天檢查親本生存狀態，將死亡的親貝移走。經過23天促熟，親本性腺成熟。在此期間，水溫由20.2逐漸升至25.6°C，鹽度維持在28-30ppt。
[0021](c)受精孵化:共獲得72個性腺成熟的親貝，將其放置于4°C海水中1.5h、陰干3h、流動的海水沖刷刺激0.5h進行人工催產，將處理好的親貝放置于盛滿100L新鮮海水的白桶中大量充氣處理，大約經過1.2h，親本開始產卵排精，獲得了 9600萬受精卵；將受精卵倒入盛滿1.6m3新鮮海水的玻璃鋼水槽中，受精卵周圍有3-5個精子即可，孵化密度60個/mL。期間，海水溫度為26.4°C，鹽度為30ppt，發育得到D形幼蟲。
[0022](d)子代培育:利用320目篩絹網進行D形幼蟲選育(選取殼高大于320目孔徑的)，獲得9000萬D形幼蟲，之后按照2-3個/ml密度將幼蟲培育在4個IOm3水泥池中；當30%左右幼蟲出現眼點、鰓原基、足向外伸時適時投放貝殼串作為附著基進行人工采苗；繼續培育7d之后，90%幼蟲都已經附著變態，進入稚貝培育期。在此期間，微充氣、不換水、不倒池、幼蟲期投喂一種單胞藻云尾藻及酵母粉；稚貝期間以蝦池水作為生物餌料，餌料投喂量根據具體情況而定。從受精開始，一共經過56d培育，獲得殼高在3-8_的健康僧帽牡蠣苗種1200萬， 單位水體出苗量30萬/m3。
[0023]實施例2
[0024](a)親本采集:于2013年6月初在湛江硇洲島潮間帶采集2_3齡野生僧帽牡蠣樣品，解剖發現該類牡蠣右殼邊緣有一圈櫛齒，右殼表面有棘刺，初步確認為僧帽牡蠣，同時采用按照Lam & Morton (2006)及夏建軍(2008)的分類標準利用線粒體測序方法進一步確認為B-型僧帽牡蠣，共采集了 360個B-型僧帽牡蠣個體作為親本。
[0025](b)性腺促熟:將僧帽牡蠣親本裝扇貝籠中，采用吊養的方式在恒星863基地的蝦池中進行生態促熟。微充氣，以小球藻、云尾藻、扁藻作為生物餌料，投喂量以水中微微泛綠為標準，保證親本有足夠的餌料。每天檢查親本生存狀態，將死亡的親貝移走。經過9天促熟，親本性腺成熟。在此期間，水溫由26.5逐漸升至28.2 °C，鹽度維持在27-30ppt。
[0026](c)受精孵化:共獲得305個性腺成熟得親貝，為了進一步確保親本準確性，采用現解剖現取樣的原則，共解剖了 105個個體，通過顯微鏡鏡檢，發現雌性82個，雄性23個。從中選出60個性腺發育較好的雌性做為母本，利用牙簽劃取卵子，通過260目篩絹網過濾，500目篩絹網洗卵，獲得5400萬成熟卵子。將其放置于盛滿1.Sm3新鮮海水的玻璃鋼桶中，浸泡30min之后，加入活力十足的精子，標準為每個卵子周圍有3-5個精子即可。孵化密度為30個/mL。期間，海水溫度為28.4°C，鹽度為30ppt，發育得到D形幼蟲。
[0027](d)子代培育:利用320目篩絹網進行D形幼蟲選育(選取大于320目孔徑的)，獲得4860萬發育正常的D形幼蟲，之后按照2-3個/ml密度將幼蟲培育在2個12m3水泥池中；當30%左右幼蟲出現眼點、鰓原基、足向外伸時適時投放貝殼串作為附著基進行人工采苗；繼續培育6d之后，90%幼蟲都已經附著變態，進入稚貝培育期。在此期間，微充氣、不換水、不倒池、幼蟲期投喂綠色巴夫藻及酵母粉；稚貝期間以蝦池水作為生物餌料，餌料投喂量根據具體情況而定。從受精開始，一共經過60d培育，獲得殼高在4-9_的健康僧帽牡蠣苗種768萬，單位水體出苗 量32萬/m3。
【權利要求】
1.一種僧帽牡蠣的人工繁育方法，其特征在于，包括以下步驟: Ca)親本采集:在華南沿海采集2-3齡野生僧帽牡蠣作為親本； (b)性腺促熟:將僧帽牡蠣采用吊養的方式在蝦池中進行生態促熟或室內人工升溫促熟； (c )受精孵化:當親本性腺成熟時，采用降溫、陰干和流水刺激進行人工催產、受精和孵化，控制孵化密度為30-60個/ml，發育得到D形幼蟲；或者對于尚未鑒別好的親本，采取現場解剖，發現右殼邊緣有半圈或者一圈櫛齒者為僧帽牡蠣，采取解剖配子方式，獲取大量成熟配子，之后進行受精、孵化，控制孵化密度為30-60個/ml，發育得到D形幼蟲； (d)子代培育:將發育正常的D形幼蟲按照2-3個/ml密度進行幼蟲培育，當30%幼蟲出現眼點、鰓原基、足向外伸時，投放附著基進行人工采苗，然后進入稚貝培育階段，經過培育，即可獲得健康的僧帽牡蠣苗種，在此期間，微充氣、不換水、不倒池、幼蟲期投喂一種單胞藻和酵母粉，稚貝期間以蝦池水作為生物餌料，所述的單胞藻為綠色巴夫藻或云尾藻。
2.根據權利要求1所述的人工繁育方法，其特征在于，所述的在華南沿海采集2-3齡野生僧帽牡蠣作為親本是在華南沿海采集野生牡蠣樣品，首先根據殼內緣是否有櫛齒及其櫛齒分布來確定僧帽牡蠣，剔除掉其他類牡蠣；同時結合分子手段進行物種鑒別，進一步確認是僧帽牡蠣，然后再以確定為僧帽牡蠣的作為親本。
3.根據權利要求1所述的人工繁育方法，其特征在于，所述的采用降溫、陰干和流水刺激進行人工催產具體是放置 于4°C海水中1.5h、陰干3h、流水刺激0.5h進行人工催產。
4.根據權利要求1所述的人工繁育方法，其特征在于，所述的發育正常的D形幼蟲是采用320目篩絹網對步驟(c)的D形幼蟲進行優選，得到發育正常的D形幼蟲。
【文檔編號】A01K61/00GK103798167SQ201410036013
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月24日 優先權日:2014年1月24日
【發明者】張躍環, 肖述, 張揚, 喻子牛 申請人:中國科學院南海海洋研究所