一種含微量稀土的牛精液冷凍稀釋液及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種含微量稀土的牛精液冷凍稀釋液，所述牛精液冷凍稀釋液組分以市售卡蘇稀釋液為應用基質，其中還含有終濃度為0.03～3μmol/L的微量稀土CeCl3。本發明公開了所述冷凍稀釋液在冷凍保存牛精液中的應用。實驗證實，本發明的冷凍稀釋液與傳統冷凍稀釋液相比，評定精子質量的五個指標累計提高了29%，而且，稀釋液制備簡單，所用的CeCl3稀土來源有保障，總體效果顯著優于傳統冷凍稀釋液，值得推廣應用。
【專利說明】一種含微量稀土的牛精液冷凍稀釋液及其應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種用于冷凍保存的稀釋液及其應用，尤其涉及一種含微量稀土的牛精液冷凍稀釋液及其應用。
【背景技術】
[0002]在畜牧養殖業中，家畜精液冷凍保存技術的應用為高度集約化現代畜牧業的發展提供了重要、有效的技術基礎。精液冷凍技術具有諸多優點:(1)可以減少公畜的飼養量，節約成本；(2)采用冷凍精液人工授精不受地域和時間限制，可有效提高種公畜的利用率，并減少疾病傳播；(3)將精液冷凍技術與人工授精、體外授精、性別控制等現代生物技術手段有機結合，對家畜品種改良、提高家畜生產性能、保護優良品種資源、大力發展畜牧業、拉動經濟騰飛等具有巨大作用。例如，我國牛精液冷凍保存和應用已在全國各地普及，共有種公牛站和精液冷凍站100多個，分布在全國多個省、市，年生產凍精2000萬份以上，為牛的改良發揮了巨大作用。此外，精液冷凍保存技術還對研究人類生殖醫學、輔助生育等有重要意義。
[0003]精液冷凍保存是指通過人工采集人或動物的精液，經過一系列特殊處理后，將精液以凍結的形式冷凍保存在_196°C的超低溫環境中。精液冷凍保存的機理就是通過在低溫條件下抑制精子的代謝活動，使精子的生命在低溫條件下處于一種幾乎靜止的狀態，使其能長期保存，但溫度回升后又能復蘇，并且仍具有受精能力。所以，精液冷凍前需要加入含營養物、緩沖物、抗凍劑等組分的稀釋液，以降低精子在冷凍過程中受冰晶的損傷、維持精子結構的完整性、延長精子在體外的存活時間、維持或增強精子的受精能力。不同動物品種對用于冷凍保存稀釋液中各種組分的要求不同，選擇合適的稀釋液組分對精液冷凍保存效果和精子復蘇后的活性至關重要，所以優化用于冷凍保存精液稀釋液配方具有非常重要的應用價值。經檢索，含微量稀土 CeCl3的牛精液冷凍稀釋液及其應用還未見報道。
【發明內容】
[0004]針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種含微量稀土的牛精液冷凍稀釋液及其應用。
[0005]本發明所述含微量稀土的牛精液冷凍稀釋液，其特征在于:所述牛精液冷凍稀釋液組分以市售卡蘇稀釋液為應用基質，其中還含有終濃度為0.03~3μ mol/L的微量稀土
CeCl3O
[0006]其中:所述卡蘇稀釋液是購自法國卡蘇公司的OPTIXcell?稀釋液，具體是貨號為024385的稀釋液；所述CeCl3的終濃度優選是0.3 μ mol/L。
[0007]本發明所述含微量稀土的牛精液冷凍稀釋液在冷凍保存牛精液中的應用。
[0008]具體是:用冷凍稀釋液將牛精液稀釋到精子密度為8X IO7個/mL，然后分裝到細管中，采用程序冷凍儀降溫后置于液氮中保存，其中所述程序冷凍儀的降溫參數可為:4 °C ~-4 °C，4 °C / 每分鐘；-4 °C ~-100°C，40°C / 每分鐘；-100°C ~-140°C，100°C / 每分鐘。[0009]本發明公開的牛精液冷凍稀釋液中，添加了微量稀土元素CeCl3作為精子的冷凍保護物質。 申請人:經實驗發現，CeCl3有利于提高細胞膜的流動性，而膜流動性的增加對細胞膜有一定的保護作用，并可加速膜損傷部分的修復，還有利于除去精子表面的覆蓋物，改變膜的通透性，增加精子活動能力和穿透能力。實驗證實使用添加CeCl3的冷凍稀釋液能有效提高牛冷凍精子復蘇后的活力、存活時間、頂體完整率和膜完整率，降低牛冷凍精子的畸形率，從而使牛冷凍精子的質量得到綜合提高。CeCl3是一種稀土氯化物，稀土元素廣泛應用于農業和畜牧業生產中，且目前未發現對人體有副作用。
[0010]實驗證實，與傳統冷凍稀釋液相比，采用本發明的冷凍稀釋液冷凍保存的牛精液:
(I)精子活力明顯提高；(2)精子存活時間明顯增加；(3)精子頂體完整率明顯提高；(4)精子膜完整率明顯提高。(5)精子畸形率明顯下降。使用添加0.3μπι01/1 CeCl3的稀釋液與一般的卡蘇稀釋液相比，以上評定精子質量的五個指標累計提高了 29%，而且，稀釋液制備簡單，所用的CeCl3稀土來源有保障，總體效果顯著優于傳統冷凍稀釋液，值得推廣應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為實施例2中各組牛精子活力的結果。
[0012]圖2為實施例2中各組牛精子存活時間的結果。
[0013]圖3為實施例2中各組牛精子頂體完整率的結果。
[0014]圖4為實施例2中牛冷凍精子復蘇后精子頂體在熒光顯微鏡下的照片(Χ400)。
[0015]圖5為實施例2中各組牛精子膜完整率的結果。
[0016]圖6為實施例2中各組牛精子畸形率的結果。
【具體實施方式】
`[0017]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置六次重復實驗，結果取平均值。
[0018]牛精液:取自山東省農科院奶牛研究中心長清種公牛站。進口稀釋液:法國卡蘇公司，貨號:024385。精子頂體形態花生凝集素熒光標記(PNA-FITC)染色試劑盒:購自上海杰美基因醫藥科技有限公司，貨號:GMS14015.1.1。CeCl3 =Aladdin公司，貨號:C104761。
[0019]實施例1、牛精液冷凍稀釋液的制備
[0020]含不同濃度CeCl3的冷凍稀釋液制備方法:在卡蘇稀釋液中加入微量稀土 CeCl3,使其 CeCl3 的終濃度分別為 0.03 μ mol/L, 0.1 μ mol/L, 0.3 μ mol/L, I μ mol/L, 3 μ mol/L。
[0021]實施例2、牛精液的獲得和凍存
[0022]一、牛精液的獲得
[0023]試驗動物為山東省農科院奶牛研究中心長清種公牛站體格健壯、性欲旺盛的6頭荷斯坦奶牛。精液采集采用假陰道法，精液采集后取I滴精液用稀釋液稀釋，滴I滴稀釋后的精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于37°c恒溫載物臺，通過電視顯微裝置在熒光屏上觀察精子活力，精子活力在0.65以上、色澤為乳白色的精液即可選用。
[0024]二、牛精液的稀釋[0025]將采集的牛精液用精子密度儀測定精子密度，以確定稀釋倍數。進行精液稀釋前，精液與稀釋液均需在37°C水浴中進行同溫處理lOmin，然后用實施例1制備的含有不同濃度CeCl3的卡蘇稀釋液進行稀釋。先用等量的稀釋液與精液進行1:1混合，在37°C水浴中處理IOmin后再稀釋適當的倍數，最終將精子密度稀釋到8 X IO7個/mL。
[0026]三、牛精液的凍存
[0027]將稀釋后的牛精液分裝到0.25mL細管內(法國進口)，用卡蘇IS4四頭灌封機封口，置于4°C冰箱中平衡4h。然后置于程序冷凍儀中進行梯度降溫(程序冷凍儀降溫速率為:4°C~-4°C，4°C / 每分鐘；-4°C~-100°C，40°C / 每分鐘；-100°C~_140°C，100°C / 每分鐘)，降溫結束后將細管從程序冷凍儀中取出，迅速投入液氮中，在液氮中停留至少5inin后，即可裝入小紗布袋中轉移至液氮罐保存。 [0028]四、牛精液的解凍
[0029]迅速取出步驟三中在液氮中保存的細管，立即投入到38°C溫水的水浴中，輕輕攪動30s后，取出擦干細管外的水滴。
[0030]五、精子活力檢測
[0031]從步驟四解凍的細管中取一滴精液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于37°C恒溫載物臺，通過電視顯微裝置在熒光屏上觀察精子活力。每支細管重復測三次，每次至少觀察5個視野。
[0032]結果見圖1。結果表明，使用添加CeCl3的稀釋液與一般的卡蘇稀釋液相比，各組精子活力都有提聞，其中使用添加0.3 μ mol/L CeCl3的稀釋液精子活力提聞幅度最大，可達到4.1%。
[0033]六、精子存活時間檢測
[0034]從步驟四中解凍的細管中取200 μ L置于1.5mL印pendorf管中，放到4°C冰箱中，每隔8-lOh在室溫(25°C左右)檢查一次精子活力，直至精子全部死亡為止，所有間隔時間累加后減去最后2次間隔時間的一半即為精子存活時間，記錄精子存活時間。
[0035]結果見圖2。結果表明，使用添加CeCl3的稀釋液與一般的卡蘇稀釋液相比，各組精子存活時間均有所增加，其中使用添加I μ mol/L CeCl3的稀釋液精子存活時間增幅最大，可達到4.4% ;使用添加0.3 μ mol/L CeCl3的稀釋液精子存活時間增加3.5%。
[0036]七、精子頂體完整率檢測
[0037]從步驟四中解凍的細管中取精液，按精子頂體形態花生凝集素熒光標記(PNA-FITC)染色試劑盒說明書上的步驟進行操作，制片后蓋上蓋玻片，無色指甲油封片后，盡快用400X熒光顯微鏡觀察精子頂體形態。濾波器激發波長350nm、發射波長460nm可見藍色熒光，表明死亡精子細胞。濾波器激發波長488nm、發射波長530nm可見綠色熒光，表明精子頂體區域。根據染色結果可區分出四種不同類型的精子:1)整個頂體激發出均勻明亮綠色熒光，為頂體完整精子；2)頂體前激發出雜亂的綠色熒光，為頂體部分破壞精子；3)僅在赤道區有綠色熒光，為頂體前帽缺失精子；4)無熒光，為頂體完全破壞精子。每次檢測時，每張制片至少計數200個精子。
[0038]結果見圖3和圖4。結果表明，使用添加0.3 μ mol/L CeCl3的稀釋液與一般的卡蘇稀釋液相比，精子頂體完整率提高了 10.4%。
[0039]八、精子膜完整率檢測[0040]從步驟四中解凍的細管中取少量精液，用果糖一檸檬酸鈉低滲液(0.6756g果糖和0.3676g 二水檸檬酸鈉溶于50mL雙蒸水中)稀釋，調整精子密度為I~2 X 106/mL，37°C孵育30分鐘后,取20 μ L精子懸液于血細胞計數板上,400 X倒置顯微鏡下觀察不同部位的至少5個視野，每次至少觀察200個精子，計算彎尾精子的百分率。
[0041]結果見圖5。結果表明，使用添加0.3 μ mol/L CeCl3的稀釋液與一般的卡蘇稀釋液相比，精子膜完整率提高了 4.8%。
[0042]九、精子畸形率檢測
[0043]1、抹片:從步驟四中解凍的細管中取20μ L精液，滴于載玻片的左端，用另一張邊緣光滑的載玻片呈35°角自右面接觸液滴，拉向另一側，制成抹片。自然風干5~lOmin。
[0044]2、固定:在風干抹片上滴I~2mL福爾馬林磷酸鹽固定液，固定15min后用清水緩緩沖去固定液，吹干或自然干燥。
[0045]3、染色:將干燥的固定后的抹片反扣在帶有平槽的有機玻璃板面上，把姬姆薩染色液滴于槽和抹片之間，讓其充滿平槽并使抹片接觸染液，染色1.5h后用清水緩緩沖去染液，晚干待檢。
[0046]4、鏡檢:在400 X顯微鏡下觀察至少200個精子，統計畸形的精子數和正常的精子數，計算精子畸形率。
[0047]結果見圖6。結果表明，添加0.3 μ mol/L CeCl3后，精子畸形率降低了 6.3%。
[0048]綜上所述，本例中以使用添加0.3 μ mol/L CeCl3的稀釋液與一般的卡蘇稀釋液相t匕，以上評定精子質量的`五個指標累計提高了 29%，而且，稀釋液制備簡單，所用的CeCl3稀土來源有保障，總體效果好，值得推廣應用。
【權利要求】
1.一種含微量稀土的牛精液冷凍稀釋液，其特征在于:所述牛精液冷凍稀釋液組分以市售卡蘇稀釋液為應用基質，其中還含有終濃度為0.03~3 μ mol/L的微量稀土 CeCl3。
2.如權利要求1所述的含微量稀土的牛精液冷凍稀釋液，其特征在于:所述卡蘇稀釋液是購自法國卡蘇公司的OPTIXcell?稀釋液，具體是貨號為024385的稀釋液；所述CeCl3的終濃度是0.3 μ mol/L。
3.權利要求1或2所述含微量稀土的牛精液冷凍稀釋液在冷凍保存牛精液中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于:用冷凍稀釋液將牛精液稀釋到精子密度為8X 107個/mL，然后分裝到細管中，采用程序冷凍儀降溫后置于液氮中保存，其中所述程序冷凍儀的降溫參數可為:4°C~-4°C，4°C /每分鐘；-4°C~-100°C，40°C /每分鐘；-100°C~-140°C, 100℃/ 每分鐘。
【文檔編號】A01N1/02GK103704205SQ201410018551
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】孔維華, 仲躋峰, 何乃森, 王長法, 張尚立, 彭正華 申請人:山東大學, 山東省農業科學院奶牛研究中心