多倍體芒的誘導方法
【專利摘要】本發明公開了一種多倍體芒的誘導方法，利用芒帶芽點愈傷組織進行多倍體誘變，誘變劑是含有Ca2+和甘露醇的水溶液，該水溶液中還含有已過濾滅菌的安磺靈或諾考達唑，通過多倍體鑒定，最終得到多倍體誘變率可達35.19%，周期2-3個月，與常規育種相比，誘變時間大大縮短，誘導率大幅提高，成本也大為降低；為芒新品種選育提供了一條新途徑。
【專利說明】多倍體芒的誘導方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物細胞遺傳學領域，涉及植物組織培養技術，具體地說是多倍體芒的誘導技術。
【背景技術】
[0002]芒(Miscanthussinensis)隸屬于禾本科芒屬(Miscanthus Andresson),多年生高大草本，除西北、西藏外，在全國各地均有分布。由于其廣泛的生態適應性、能源效益高效性、經濟用途多樣性以及具有很強的環保功能，使其成為備受關注的生物質能源之一。而要將其投入產業化生產，除了要打破相關的技術壁壘，原材料的品質和數量也是重中之重。由于植物多倍體具有形態巨大、抗逆性強、化學物質含量較高等特點而受到育種學家的廣泛重視，目前國內外對芒屬植物中的三倍體一奇崗(二倍體的芒X四倍體的荻)研究得較為深入。若能利用多倍體育種手段培育出四倍體，不僅能直接作為新品種加以運用，而且還能為后續的育種工作提供優良的親本，開發出更多具有實用價值的新品種。
[0003]采用化學試劑進行多倍體誘導，多是利用所選試劑對植物微管蛋白的結合作用來有效阻止微管聚合，從而抑制紡錘體的形成，達到誘導染色體加倍的效果。秋水仙素是一種常用的多倍體誘變劑，但在芒的多倍體誘變過程中發現，其對芒的愈傷組織毒害很大，誘變處理后，胚性細胞常因微管聚合異常死亡，導致多倍體誘變率低；此外，秋水仙素的價格昂貴，價格通常是1000元/g左右，在大規模工廠化誘導多倍體的時候，增加了誘變成本。諾考達唑有使微管解聚的作用，是一種紡錘體形成抑制劑，其在抑制小鼠胚胎成纖維細胞紡錘體形成時，能使細胞不經有絲分裂而進行再復制形成多倍體細胞；與秋水仙素相比，有一定價格優勢，價格通常是30元/g左右。安磺靈常用作除草劑，在玉米、小麥多倍體育種中效果較好，在部分植物中離體多倍體誘導程度比秋水仙素高，藥害程度較秋水仙素輕；與秋水仙素相比，有極大的價格優勢，價格通常是I元/g左右。
[0004]此外，本發明人發現甘露醇的使用，能夠保證薄壁細胞的成活率，進而導致對于最終的誘導成功率有很大的影響。而且在植物多倍體誘導過程中，環境溫度和Ca2+濃度由于對微管聚合的調控也成為影響多倍體誘導率的重要因素。本發明綜合不同誘變劑及濃度，不同甘露醇濃度、不同處理溫度和Ca2+濃度等因素，通過設計相應的實驗方案對芒的愈傷進行不同處理，探討以上因素在芒多倍體誘導過程中的作用，找到多倍體芒的誘導最佳的處理組合方案。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種誘導率高、成本低的多倍體芒的誘導方法。
[0006]多倍體芒的誘導方法，該方法包括如下步聚: [0007]將帶芽點的愈傷組織浸泡于多倍體誘導劑中處理，所述的多倍體誘導劑是含有Ca2+和甘露醇的水溶液，該水溶液中還含有已過濾滅菌的安磺靈或諾考達唑。
[0008]安磺靈濃度為5-15 μ M0[0009]諾考達唑濃度為2.5-10 μ M0
[0010]甘露醇濃度為20-25g/L ；Ca2+ 濃度 1.02-4.0mM。
[0011]上述方法中浸泡處理溫度為5-25°C、浸泡處理時間為10-20min。
[0012]安磺靈濃度優選為10 μ Μ，Ca2+濃度優選為1.02mM,甘露醇濃度優選為25g/L，浸泡溫度優選5°C，處理優選15min。
[0013]諾考達唑濃度優選為5 μ Μ，Ca2+濃度優選為1.02mM,甘露醇濃度優選為20g/L，浸泡溫度優選15°C，處理優選20min。
[0014]上述方法將愈傷組織浸泡后取出，接種到無激素基本MS培養基進行暗培養；然后取出愈傷組織洗去殘存的誘變劑，接種到愈傷分化增殖生根培養基中光照培養。多倍體誘導劑浸泡處理后的無激素暗培養溫度為5-25°C;時間為36-48h。暗培養后將愈傷組織從無激素培養基中取出，用25g/L的甘露醇溶液洗去殘留的誘變劑，清洗3-5次，每次2-5分鐘，在無菌濾紙上晾干后，再接種到愈傷分化增殖生根培養基中光照培養。
[0015]本發明所述多倍體芒的誘導方法，其具體操作步驟如下:
[0016]1、多倍體的誘變:將諾考達唑或安磺靈過濾滅菌，分別將帶芽點的愈傷組織浸泡于已過濾滅菌的不同濃度諾考達唑或安磺靈的水溶液中，并添加不同濃度的鈣離子和甘露醇，在不同的誘變溫度下，處理不同時間，各設5次重復；
[0017]安磺靈濃度為5、10、15μΜ ;
[0018]諾考達唑濃度為2.5、5、10μΜ ;`[0019]甘露醇濃度為20、25g/L ;
[0020]Ca2+ 濃度 1.02、2.99、4.0mM ;
[0021]上述方法中浸泡處理溫度為5、15、25°C ；
[0022]浸泡處理時間為10、15、20min。
[0023]2、將愈傷取出，接種到無激素基本MS培養基進行暗培養溫度為5-25°C ;時間為36-48h ;然后取出愈傷組織用25g/L的甘露醇溶液洗去殘存的誘變劑，清洗3_5次，每次2-5分鐘，在無菌濾紙上晾干后，再接種到愈傷分化增殖生根培養基中光照培養。
[0024]3、多倍體鑒定:切取植株根尖包含有分生區部位的部分，進行染色體核型鑒定。染色體數目以染色體組為單位成倍增加的即為多倍體。
[0025]在上述試驗的多個處理中，多倍體芒誘導率都達到了 20%以上，誘導率最高組合為安磺靈濃度10 μ Μ，溫度5°C, 1.02mM Ca2+，處理15min，其誘導率為35.19%。
[0026]本發明提出的多倍體芒的誘導方法，通過誘變劑浸泡愈傷組織，愈傷組織分化成苗，多倍體鑒定，最終得到多倍體材料，周期2-3個月，為芒新品種選育提供了一條新途徑，而且該方法誘導率高、對愈傷組織毒害小，成本低廉。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1為本發明的各培養階段培養物的照片:A.種子誘導愈傷；B.誘變劑處理前的愈傷；C.用安磺靈處理后的愈傷；D.用安磺靈處理后的愈傷；E.用諾考達唑處理后愈傷；F.芒的叢生芽；G.再生植株；H.種植于溫室；1.二倍體(左)與四倍體(右)植株；
[0028]圖2為芒的對照株(2X )和誘變株(4X )染色體核型圖(1000X )。【具體實施方式】
[0029]以下結合實施例進一步說明本發明，而不是限制本發明。
[0030]實施例1
[0031]取材:芒(M.sinensis) 02178，采集自湖南懷化，保存于湖南農業大學芒屬植物資源圃。
[0032]1、誘變材料的準備:挑選已誘導得到的帶芽點的致密胚性愈傷組織，收集到50ml的三角瓶中備用；
[0033]2、多倍體的誘變:將胚性愈傷組織浸泡在誘變劑中，誘變劑成分包括25g/L甘露醇、1.02mM Ca2+和10 μ M安磺靈，溶劑為水；處理溫度5°C，處理15min，設置5個重復；將愈傷取出，接種到無激素基本培養基，5°C暗培養，處理36h。
[0034]3、叢生芽誘導或增殖:將處理后的愈傷組織取出，用滅菌過的濃度為25g/L的甘露醇溶液沖洗3次，I次2分鐘；清洗后，用滅菌過的濾紙吸干殘留溶液；將愈傷組織轉入分化增殖生根培養基中，使其分化增殖成苗。
[0035]4、多倍體鑒定:切取植株根尖包含有分生區部位的部分，進行染色體核型鑒定。染色體數目以染色體組為單位成倍增加的即為多倍體。
[0036]結果表明，多倍體芒02178的誘導率為35.19%。
[0037]實施例2
[0038]取材:芒(M.sinensis) 00051，采集自四川樂山，保存于湖南農業大學芒屬植物資
源圃。`
[0039]1、誘變材料的準備:挑選已誘導得到的帶芽點的致密胚性愈傷組織，收集到50ml的三角瓶中備用；
[0040]2、多倍體的誘變:將胚性愈傷組織浸泡在誘變劑中，誘變劑成分包括20g/L甘露醇、1.02mM Ca2+和5 μ M諾考達唑，溶劑為水；處理溫度15°C，處理20min，設置5個重復；將愈傷取出，接種到無激素基本培養基，15°C暗培養，處理48h。
[0041]3、叢生芽誘導或增殖:將處理后的愈傷組織取出，用滅菌過的濃度為20g/L的甘露醇溶液沖洗5次，I次I分鐘；清洗后，用滅菌過的濾紙吸干殘留溶液；將愈傷組織轉入分化增殖生根培養基中，使其分化增殖成苗。
[0042]4、多倍體鑒定:切取植株根尖包含有分生區部位的部分，進行染色體核型鑒定。染色體數目以染色體組為單位成倍增加的即為多倍體。
[0043]結果表明，多倍體芒00051的誘導率為26.92%。
[0044]實施例3
[0045]取材:芒(M.sinensis) 02178，采集自湖南懷化，保存于湖南農業大學芒屬植物資源圃。
[0046]1、誘變材料的準備:挑選已誘導得到的帶芽點的致密胚性愈傷組織，收集到50ml的三角瓶中備用；
[0047]2、多倍體的誘變:將胚性愈傷組織浸泡在誘變劑中，誘變劑成分包括25g/L甘露醇、2.99mM Ca2+和5 μ M諾考達唑，溶劑為水；處理溫度25°C，處理15min，設置5個重復；將愈傷取出，接種到無激素基本培養基，25 °C暗培養，處理36h。
[0048]3、叢生芽誘導或增殖:將處理后的愈傷組織取出，用滅菌過的濃度為25g/L的甘露醇溶液沖洗3次，I次2分鐘；清洗后，用滅菌過的濾紙吸干殘留溶液；將愈傷組織轉入分化增殖生根培養基中，使其分化增殖成苗。
[0049]4、多倍體鑒定:切取植株根尖包含有分生區部位的部分，進行染色體核型鑒定。染色體數目以染色體組為單位成倍增加的即為多倍體。
[0050]結果表明，多倍體芒02178的誘導率為20.48%。
[0051]實施例4
[0052]取材:芒(M.sinensis) 04158，采集自湖北赤壁，保存于湖南農業大學芒屬植物資源圃。
[0053]1、誘變材料的準備:挑選已誘導得到的帶芽點的致密胚性愈傷組織，收集到50ml的三角瓶中備用；
[0054]2、多倍體的誘變:將胚性愈傷組織浸泡在誘變劑中，誘變劑成分包括20g/L甘露醇、4.0mMCa2+和15 μ M安磺靈，溶劑為水；處理溫度15°C，處理15min，設置5個重復；將愈傷取出，
[0055]接種到無激素基本培養基，15°C暗培養，處理48h。
[0056]3、叢生芽誘導或增殖:將處理后的愈傷組織取出，用滅菌過的濃度為20g/L的甘露醇溶液沖洗4次，1次2分鐘；清洗后，用滅菌過的濾紙吸干殘留溶液；將愈傷組織轉入分化增殖生根培養基中，使其分化增殖成苗。
[0057]4、多倍體鑒定:切取植株根尖包含有分生區部位的部分，進行染色體核型鑒定。染色體數目以染色體組為單位成倍增加的即為多倍體。
[0058]結果表明，多倍體芒04158的誘導率為20.99%。
[0059]對比例1:
[0060]取材:芒(M.sinensis) 02178，采集自湖南懷化，保存于湖南農業大學芒屬植物資源圃。
[0061]1、誘變材料的準備:挑選已誘導得到的帶芽點的致密胚性愈傷組織，收集到50ml的三角瓶中備用；
[0062]2、多倍體的誘變:將胚性愈傷組織浸泡在誘變劑中，誘變劑成分包括25g/L甘露醇、4mMCa2+和2.48mM秋水仙素，溶劑為水；處理溫度5°C，處理lOmin，設置5個重復；將愈傷取出，接種到無激素基本培養基，5°C暗培養，處理36h。
[0063]3、叢生芽誘導或增殖:將處理后的愈傷組織取出，用滅菌過的濃度為25g/L的甘露醇溶液沖洗3次，I次2分鐘；清洗后，用滅菌過的濾紙吸干殘留溶液；將愈傷組織轉入分化增殖生根培養基中，使其分化增殖成苗。
[0064]4、多倍體鑒定:切取植株根尖包含有分生區部位的部分，進行染色體核型鑒定。染色體數目以染色體組為單位成倍增加的即為多倍體。
[0065]結果表明，多倍體芒02178的誘導率為2.48% ;而且本對比例秋水仙素的使用量遠高于本發明所使用的諾考達唑或安磺靈。
[0066]對比例2:
[0067]取材:芒(M.sinensis) 02178，采集自湖南懷化，保存于湖南農業大學芒屬植物資源圃。
[0068]1、誘變材料的準備:挑選已誘導得到的帶芽點的致密胚性愈傷組織，收集到50ml的三角瓶中備用；
[0069]2、多倍體的誘變:將胚性愈傷組織浸泡在誘變劑中，誘變劑成分包括20g/L甘露醇、
[0070]1.02mM Ca2+和1.24mM秋水仙素，溶劑為水；處理溫度5°C，處理15min，設置5個重復；將愈傷取出，接種到無激素基本培養基，5°C暗培養，處理36h。
[0071]3、叢生芽誘導或增殖:將處理后的愈傷組織取出，用滅菌過的濃度為25g/L的甘露醇溶液沖洗3次，I次2分鐘；清洗后，用滅菌過的濾紙吸干殘留溶液；將愈傷組織轉入分化增殖生根培養基中，使其分化增殖成苗。
[0072]4、多倍體鑒定:切取植株根尖包含有分生區部位的部分，進行染色體核型鑒定。染色體數目以染色體組為單位成倍增加的即為多倍體。
[0073]結果表明，多倍體芒02178的誘導率為18.18%，接近于本發明的最低誘導率，但仍然低于本發明；而且關鍵是秋水仙素的成本要遠高于諾考達唑或安磺靈；此外，發明人發現在其他條件與本發明相同情況下，本對比例秋水仙素的濃度比對比例I減小會使誘導率增加，但隨著秋水仙素使用量繼續減少，并不能使誘導率繼續升高，當減少到μ M級別時，則誘導率幾乎為零。[0074]對比例3
[0075]取材:芒(M.sinensis) 00051，采集自四川樂山，保存于湖南農業大學芒屬植物資源圃。
[0076]1、誘變材料的準備:挑選已誘導得到的帶芽點的致密胚性愈傷組織，收集到50ml的三角瓶中備用；
[0077]2、多倍體的誘變:將胚性愈傷組織浸泡在誘變劑中，誘變劑成分包括15 μ M安磺靈，溶劑為水；處理溫度25°C，處理lOmin，設置5個重復；將愈傷取出，接種到無激素基本培養基，25°C暗培養，處理36h。
[0078]3、叢生芽誘導或增殖:將處理后的愈傷組織取出，用滅菌過的濃度為20g/L的甘露醇溶液沖洗5次，I次I分鐘；清洗后，用滅菌過的濾紙吸干殘留溶液；將愈傷組織轉入分化增殖生根培養基中，使其分化增殖成苗。
[0079]4、多倍體鑒定:切取植株根尖包含有分生區部位的部分，進行染色體核型鑒定。染色體數目以染色體組為單位成倍增加的即為多倍體。
[0080]結果表明，多倍體芒00051的誘導率為4.35%。
[0081]對比例4
[0082]取材:芒(M.sinensis) 00051，采集自四川樂山，保存于湖南農業大學芒屬植物資源圃。
[0083]1、誘變材料的準備:挑選已誘導得到的帶芽點的致密胚性愈傷組織，收集到50ml的三角瓶中備用；
[0084]2、多倍體的誘變:將胚性愈傷組織浸泡在誘變劑中，誘變劑成分包括10 μ M諾考達唑，
[0085]溶劑為水；處理溫度25°C，處理lOmin，設置5個重復；將愈傷取出，接種到無激素基本培養基，25 °C暗培養，處理36h。
[0086]3、叢生芽誘導或增殖:將處理后的愈傷組織取出，用滅菌過的濃度為20g/L的甘露醇溶液沖洗5次，I次I分鐘；清洗后，用滅菌過的濾紙吸干殘留溶液；將愈傷組織轉入分化增殖生根培養基中，使其分化增殖成苗。
[0087]4、多倍體鑒定:切取植株根尖包含有分生區部位的部分，進行染色體核型鑒定。染色體數目以染色體組為單位成倍增加的即為多倍體。
[0088]結果表明，多倍體芒00051的誘導率為5.97%。
[0089]由對比例3和4可見未添加鈣離子和甘露醇對于誘導率也是有巨大影響的。
[0090]由實施例及對比例可見，諾考達唑或安磺靈配組鈣離子和甘露醇誘導效果都明顯優于秋水仙素誘變劑配組，且秋水仙素誘導劑的用量在同比條件下比前兩者高近1000倍，加上秋水仙素單價的昂貴，顯而易見，諾考達唑和安磺靈的誘變劑配組更適用于規模化生產。
【權利要求】
1.多倍體芒的誘導方法，其特征在于，該方法包括如下步聚: 將帶芽點的愈傷組織浸泡于多倍體誘導劑中處理，所述的多倍體誘導劑是含有Ca2+和甘露醇的水溶液，該水溶液中還含有已過濾滅菌的安磺靈或諾考達唑。
2.根據權利要求1所述的多倍體芒的誘導方法，其特征在于，安磺靈濃度為5-15μ M。
3.根據權利要求1所述的多倍體芒的誘導方法，其特征在于，諾考達唑濃度為2.5_10 u Mo
4.根據權利要求1或2或3所述的多倍體芒的誘導方法，其特征在于，甘露醇濃度為20-25g/L ；Ca2+ 濃度 1.02-4.0mM。
5.根據權利要求4所述的多倍體芒的誘導方法，其特征在于，浸泡處理溫度為5-25°C、浸泡處理時間為10-20min。
6.根據權利要求1所述的多倍體芒的誘導方法，其特征在于，安磺靈濃度為10μ M，Ca2+濃度為1.02mM，甘露醇濃度為25g/L，浸泡溫度5°C，處理15min。
7.根據權利要求1所述的多倍體芒的誘導方法，其特征在于，諾考達唑濃度為5μ M，Ca2+濃度為1.02mM,甘露醇濃度為20g/L，浸泡溫度15°C，處理20min。
8.根據權利要求1所述的多倍體芒的誘導方法，其特征在于，將愈傷組織浸泡后取出，接種到無激素基本MS培養基進行暗培養；然后取出愈傷組織洗去殘存的誘變劑,接種到愈傷分化增殖生根培養基中光照培養。
9.根據權利要求8所述`的多倍體芒的誘導方法，其特征在于，多倍體誘導劑浸泡處理后的無激素暗培養溫度為5-25°C ;時間為36-48h。
10.根據權利要求9所述的多倍體芒的誘導方法，其特征在于，暗培養后將愈傷組織從無激素培養基中取出，用25g/L的甘露醇溶液洗去殘留的誘變劑，清洗3-5次，每次2-5分鐘，在無菌濾紙上晾干后，再接種到愈傷分化增殖生根培養基中光照培養。
【文檔編號】A01H4/00GK103718968SQ201410017763
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】陳智勇, 易自力, 劉清波 申請人:湖南農業大學