抗蟲棉花植物及其鑒定方法

抗蟲棉花植物及其鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供特定的轉(zhuǎn)基因棉花植物、植物材料和種子，其特征在于這些產(chǎn)品在棉花基因組的特定位置包含特定轉(zhuǎn)化事件。本發(fā)明也提供允許快速和明確鑒定生物樣品中的所述事件的工具。
【專利說明】抗蟲棉花植物及其鑒定方法
[0001]本申請是申請日為2008年3月31日、發(fā)明名稱為“抗蟲棉花植物及其鑒定方法”的中國專利申請200880010892.6 (國際申請?zhí)朠CT/EP2008/002667)的分案申請。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因棉花植物，植物材料及種子，其特征在于包含一個特定的轉(zhuǎn)化事件，特別是在棉花基因組的特定部位存在編碼可賦予昆蟲抗性的蛋白的基因。本發(fā)明的棉花植物組合了昆蟲抗性表型、農(nóng)學(xué)性狀、遺傳穩(wěn)定性、以及對不同遺傳背景的適應(yīng)性(等同于非轉(zhuǎn)化棉花系在無昆蟲狀況下)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了在生物樣品中鑒定特別包含了轉(zhuǎn)化事件EF-GH5的植物材料的存在的方法和試劑盒。
[0003]發(fā)明背景
[0004]植物中轉(zhuǎn)基因的表型表達(dá)取決于:基因本身的結(jié)構(gòu)，以及其在植物基因組中的位置。同時，在基因組的不同位置轉(zhuǎn)基因(外源DNA中)的存在將以不同的方式影響植物的整體表型。通過遺傳操作，在農(nóng)學(xué)上或工業(yè)上成功地將商業(yè)上感興趣的性狀引入到植物中是一個長期的過程，這取決于不同的因素。轉(zhuǎn)基因植物的實(shí)際轉(zhuǎn)化和再生僅僅是一系列選擇步驟的第一步，選擇步驟包括廣泛的遺傳 表征，育種，田間試驗(yàn)評價，最終實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品系的選擇。
[0005]棉纖維是全世界最重要的紡織原料。每年全球收獲大約80，000，000英畝棉花。就面積產(chǎn)量而言，棉花是美國第五大作物，2000年其種植超過了 15，000, 000英畝。
[0006]靠棉花為生的最具破壞性的昆蟲物種有:Helicoverpa zea (玉米果穗螟蛉或棉鈴蟲)、Helicoverpa armigera (美洲棉鈴蟲)、Heliothis virescens (煙青蟲)及Helicoverpa punctigera。
[0007]鑒于對新型食品和新型飼料的關(guān)注，GMO和非GMO產(chǎn)品的分開，以及對專利材料的鑒別，優(yōu)良事件的明確鑒定正變得愈加重要。理想的是，該鑒定方法既快又簡單，還不需要大量的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。此外，該方法應(yīng)提供不需專家解釋就能使優(yōu)良事件明確確定的結(jié)果，但是如果必要的話，在專家仔細(xì)審查下，結(jié)果被證明有效。本文描述了在生物樣品中鑒定優(yōu)良事件EF-GH5而用到的特定工具。
[0008]在開發(fā)抗蟲棉(Gossypium hirsutum)過程中，從轉(zhuǎn)基因棉花植物群體中將EE-GH5鑒定作為優(yōu)良事件，它包含編碼來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的殺蟲晶體蛋白的基因。轉(zhuǎn)基因棉花植物包含編碼Bt殺蟲晶體蛋白(如W003/093484所述)的嵌合基因，其處于植物可表達(dá)啟動子的控制之下。
[0009]包含抗蟲基因的棉花植物已經(jīng)在本領(lǐng)域中公開。但是，并沒有任何現(xiàn)有技術(shù)公開內(nèi)容教導(dǎo)或提示了本發(fā)明。
[0010]發(fā)明概述
[0011]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因棉花植物、或其種子、細(xì)胞或組織，其包含穩(wěn)定整合在其基因組中的表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含一個包含cryIAb基因編碼序列的抗蟲基因(如本文實(shí)施例1.1所述)，其為抗蟲的，在無昆蟲壓力下，該轉(zhuǎn)基因植物及其材料具有與非轉(zhuǎn)基因的等基因系基本上等同的農(nóng)學(xué)性能。在有昆蟲壓力下，該轉(zhuǎn)基因植物將具有比非轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)越的農(nóng)學(xué)表型。
[0012]根據(jù)本發(fā)明，棉花植物、或其種子、細(xì)胞或組織包含優(yōu)良事件EE-GH5。
[0013]更確切地說，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因棉花植物、其種子、細(xì)胞或組織，其基因組DNA的特征在于，當(dāng)用本文所述的PCR鑒定方法分析，使用兩個分別針對EE-GH5的5 ‘或3 ‘側(cè)翼區(qū)和外源DNA的引物時，得到特異于EE-GH5的片段。所述引物可以分別針對SEQ ID No:1的5 ‘側(cè)翼區(qū)和外源DNA內(nèi)，例如可以分別包含SEQ ID No:7和SEQ ID No:8的核苷酸序列或由其組成，得到100-700bp的DNA片段，優(yōu)選大約129bp。該引物也可以分別針對SEQID No:2內(nèi)的3 ‘側(cè)翼區(qū)和外源DNA，例如可以分別包含SEQ ID No:3和SEQ ID No:6的核苷酸序列或由其組成，得到300-700bp的DNA片段，優(yōu)選是大約369bp。
[0014]包含本發(fā)明的優(yōu)良事件的參考種子已經(jīng)保藏在ATCC，保藏號為PTA-8171。本發(fā)明的一個實(shí)施方案是，以ATCC保藏號PTA-8171保藏的包含優(yōu)良事件EE-GH5的種子，它可以長成對昆蟲(特別是對Helicoverpa sp.或Heliothis sp.)有抗性的棉花植物。ATCC保藏號為PTA-8171的種子是一個種子庫，其中包含的至少大約95%的轉(zhuǎn)基因籽粒對于所述轉(zhuǎn)基因是純合的，包含本發(fā)明的優(yōu)良事件，這些種子可以長成抗蟲植物，因而這些植物也可以是草銨膦耐受植物。可播種種子，且生長的植物可以用本文所述的草銨膦處理，從而得到含有本發(fā)明的優(yōu)良事件的百分之百耐受草銨膦的植物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及由以保藏號PTA-8171保藏在ATCC的種子長成的包含本發(fā)明的優(yōu)良事件的植物而來的細(xì)胞，組織及子代和后代。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過以保藏號PTA-8171保藏在ATCC的種子長成的包含本發(fā)明的優(yōu)良事件的棉花植物的繁殖和/或育種可以得到的植物。本發(fā)明也涉及包含優(yōu)良事件EE-GH5的棉花植物。
[0015]本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定包含優(yōu)良事件EE-GH5的轉(zhuǎn)基因植物、或其細(xì)胞或組織的方法，該方法是基于對轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)胞或組織中的特征DNA序列或由該DNA序列編碼的氨基酸的存在進(jìn)行鑒定。根據(jù)`本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，這樣的特征DNA序列是15bp的序列，優(yōu)選是20bp，最優(yōu)選是30bp或更多，這些序列包含該事件的插入位點(diǎn)，即部分外源DNA和部分與之相鄰的棉花基因組(5 ‘或3 ‘側(cè)翼區(qū))，這使得優(yōu)良事件可以被特別鑒定。
[0016]本發(fā)明進(jìn)一步涉及在生物樣品中鑒定優(yōu)良事件EE-GH5的方法，該方法基于可以特異識別EE-GH5的5 ‘和/或3 ‘側(cè)翼序列的引物或探針。
[0017]更確切地說，本發(fā)明涉及包括擴(kuò)增生物樣品中存在的核酸序列的方法。該方法使用至少兩個引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，一個識別EE-GH5的5 ‘或3 ‘側(cè)翼區(qū)，另一個識別外源DNA內(nèi)的序列，優(yōu)選得到一個100-500bp的DNA片段。該引物可以分別識別EE-GH5的5 ‘側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列(SEQ ID N0.1的1-98位的序列，或SEQ ID N0.16的1-563位的序列)或EE-GH5的3 ‘側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列(SEQ ID N0.2的41-452位的互補(bǔ)序列)，以及外源DNA內(nèi)的序列(SEQ ID N0.1的99-334位的互補(bǔ)序列，或SEQ ID N0.2的1_40位的序列)。識別5 ‘側(cè)翼區(qū)的引物可以包含SEQ ID N0.7或SEQ ID N0.17的核苷酸序列，識別外源DNA內(nèi)的序列的引物可以包含本文所述的SEQ ID N0.8, SEQ ID N0.18或SEQ ID N0.19的核苷酸序列。識別3 ‘側(cè)翼區(qū)的引物可以包含本文所述的SEQ ID N0.6的核苷酸序列，識別外源DNA內(nèi)的序列的引物可以包含本文所述的SEQ ID N0.3的核苷酸序列。
[0018]本發(fā)明更特別地涉及鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH5的方法，該方法包括利用分別具有SEQ ID N0.3和6的核苷酸序列的兩個引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增生物樣品中的核酸序列，得到大約369bp的DNA片段。
[0019]目前的優(yōu)良事件包含一個外源DNA序列，與最初用于轉(zhuǎn)化程序的DNA相比，該序列發(fā)生了輕微的重排。這一重排對于優(yōu)良事件EE-GH5是獨(dú)特的。因此，本發(fā)明還涉及鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH5的方法，該方法包括通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得到一個大約262bp的DNA片段，所用的引物位于EE-GH5中外源DNA的獨(dú)特重排區(qū)的兩側(cè)，例如包含或具有SEQID N0.10或SEQ ID N0.11的核苷酸序列的引物。
[0020]本發(fā)明進(jìn)一步涉及本文所述的EE-GH5的特異側(cè)翼序列，其可以用來開發(fā)特定的鑒定方法來鑒定生物樣品中的EE-GH5。此類特定的側(cè)翼序列在鑒定試驗(yàn)中也可以用作參考對照材料。更特別的是，本發(fā)明涉及可以用來開發(fā)如本文進(jìn)一步所述的特異引物和探針的EE-GH5的5 ‘和/或3 ‘側(cè)翼區(qū)。本發(fā)明也涉及跨越EE-GH5的外源DNA內(nèi)的特定重排的核酸分子，例如，包含SEQ ID N0.12的52-88位核苷酸序列的核酸分子，或包含SEQ ID N0.12的序列的核酸分子。也適合作為參考材料的是優(yōu)選為大約369bp的核酸分子，其包含可以被具有SEQ ID N0.3和6的核苷酸序列的引物擴(kuò)增的序列。
[0021]本發(fā)明進(jìn)一步涉及，基于這些特異引物和探針的使用，從而對生物樣品中EE-GH5的存在進(jìn)行鑒定的方法。引物可以由17至大約200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成，其選自SEQ ID N0.1的1-98位核苷酸的核苷酸序列、SEQ ID N0.16的1_563位核苷酸的核苷酸序列、或者SEQ ID N0.2的41-452位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列，與由17至大約200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成的引物相組合，所述引物選自SEQ ID N0.1的99-334位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列，及SEQ ID N0.2的1-40位核苷酸的核苷酸序列。引物也可以包含定位在3 ‘末端的核苷酸序列，進(jìn)一步包含無關(guān)序列，或來源于所述核苷酸序列但包含錯配的序列。
[0022]本發(fā)明進(jìn)一步`涉及鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH5的試劑盒，所述試劑盒包含至少一個可以特異識別EE-GH5的5 ‘或3 ‘側(cè)翼區(qū)或者可以特異識別EE-GH5中外源DNA序列內(nèi)的特異重排的引物或探針。
[0023]除了可以特異識別EE-GH5的5 ‘或3 ‘側(cè)翼區(qū)的引物外，本發(fā)明的試劑盒可以包含第二個特異識別EE-GH5的外源DNA內(nèi)的序列的引物，以便用在PCR鑒定方案中。本發(fā)明的試劑盒可以包含至少兩個特異引物，一個識別EE-GH5的5‘側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，另一個識別外源DNA內(nèi)的序列。識別5‘側(cè)翼區(qū)的引物可以包含SEQ ID N0.3的核苷酸序列，識別轉(zhuǎn)基因的引物可以包含SEQ ID N0.6的核苷酸序列或本文所述的任何其它的引物。
[0024]本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH5的試劑盒。所述的試劑盒包含具有SEQ ID N0.3和6的核苷酸序列的PCR引物，用于本文所述的EE-GH5PCR鑒定方案中。本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH5的試劑盒。所述的試劑盒包含具有SEQ ID N0.10和11的核苷酸序列的PCR引物。
[0025]本發(fā)明也涉及鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH5的試劑盒。該試劑盒包含特異探針，其具有相應(yīng)于(或互補(bǔ)于)與EE-GH5的特定區(qū)域具有80-100%序列同一性的序列。優(yōu)選地，該探針的序列相應(yīng)于包含部分EE-GH5的5 ‘或3 ‘側(cè)翼區(qū)部分的特定區(qū)域，或者相應(yīng)于對應(yīng)于EE-GH5特異的外源DNA的重排的區(qū)域。最優(yōu)選地，該特異探針具有(或互補(bǔ)于)與SEQ ID N0.1的78-119位核苷酸序列、SEQ ID N0.2的20-61位核苷酸序列或SEQ ID N0.12的52-88位核苷酸序列有80-100%的序列同一性的序列。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，公開的DNA序列包含了事件的插入位點(diǎn)，以及足夠長的棉花基因組DNA和外源DNA (轉(zhuǎn)基因)的多核苷酸，以至于可以用作引物或探針來檢測EE-GH5。此類序列，在插入位點(diǎn)的每一側(cè)，可以分別包含棉花基因組DNA的至少9個核苷酸以及EE-GH5的外源DNA (轉(zhuǎn)基因)的相似數(shù)量的核苷酸。最優(yōu)選地，此類DNA序列包含棉花基因組DNA的至少9個核苷酸以及外源DNA的相似數(shù)量的核苷酸(與SEQ ID N0.1或2的插入位點(diǎn)相鄰)。
[0027]本發(fā)明所包括的方法和試劑盒可以用在不同的目的，例如，但不僅限于下列:鑒定植物，植物材料或產(chǎn)品(例如但不僅限于:包含或源于植物材料的新鮮或加工的食品或飼料)中是否存在EE-GH5 ;另外地或備選地，本發(fā)明的方法和試劑盒可用來鑒定轉(zhuǎn)基因植物材料，目的在于將轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因材料分離；另外地或備選地，本發(fā)明的方法和試劑盒可以用來確定包含EE-GH5的植物材料的品質(zhì)(即純材料的百分比)。
[0028]本發(fā)明進(jìn)一步涉及EE-GH5的5 ‘和/或3 ‘側(cè)翼區(qū)，還涉及從EE-GH5的5 ‘和/或3 ‘側(cè)翼序列開發(fā)的特異引物和探針。本發(fā)明也涉及EE-GH5特定的重排區(qū)域，還涉及根據(jù)此區(qū)域設(shè)計(jì)的特異引物或探針。
[0029]本發(fā)明也涉及從包含優(yōu)良事件EE-GH5的植物中得到的基因組DNA。在進(jìn)行本文所述的鑒定試驗(yàn)時，該基因組DNA可以用作參考對照材料。
[0030]附圖簡沭
[0031]下面的實(shí)施例，不是為了將本發(fā)明限制于所述的特定實(shí)施方案，而是可以結(jié)合著附圖(并入本文作為參考)來理解。這些圖中:
[0032]圖1通過圖示了引用的核苷酸序列與引物之間的關(guān)系。黑色條形:外源DNA ;帶條紋的黑色條形:EE-GH5特異的外源DNA中的重排；淺色條形:植物來源的DNA ;帶條紋的淺色條形:預(yù)插入靶位點(diǎn)缺失；箭頭:寡核苷酸引物，條形下的數(shù)字代表核苷酸位置；(c)代表的是所指的核苷酸序列的互補(bǔ)序列。
[0033]圖2顯示為EE-GH5開發(fā)的接合性評分PCR方案得到的結(jié)果。凝膠的上樣順序:泳道1:分子量標(biāo)記(IOObp序列梯)；泳道2-3:來自包含雜合形式的轉(zhuǎn)基因事件EE-GH5的棉花植物的DNA樣品；泳道4:失?。挥镜?:來自野生型棉花植物的對照DNA樣品；泳道6_7:來自包含純合形式的轉(zhuǎn)基因事件EE-GH5的棉花植物的DNA樣品；泳道8:無模板DNA對照；泳道9:分子量標(biāo)記。
[0034]發(fā)明詳沭
[0035]在植物基因組中摻入重組DNA分子典型地是由細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)的。摻入的特定位點(diǎn)通常是由于“隨機(jī)”整合決定的。
[0036]通過用重組DNA或“轉(zhuǎn)化DNA”轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織而引入到植物基因組中并源于該轉(zhuǎn)化DNA的DNA在下文中稱為“外源DNA”，它包含一個或多個“轉(zhuǎn)基因”。本發(fā)明文中的“植物DNA”指的是源于被轉(zhuǎn)化植物的DNA。植物DNA通常見于相應(yīng)野生型植物的相同的基因座。外源DNA可通過在植物基因組中重組DNA分子的摻入位點(diǎn)處的位置和結(jié)構(gòu)來表征。植物基因組中重組DNA插入的位點(diǎn)也稱為“插入位點(diǎn)”或“靶位點(diǎn)”。重組DNA插入到被稱為“預(yù)插入植物DNA”的植物基因組的區(qū)域與植物DNA的缺失相關(guān)，稱之為“靶位點(diǎn)缺失”。本文使用的“側(cè)翼區(qū)”或“側(cè)翼序列”指的是不同于引入的DNA的至少20bp的DNA序列，優(yōu)選是至少50bp，多可至5000bp ;優(yōu)選地，源于植物基因組的DNA，它要么位于外源DNA的緊上游區(qū)并與之相鄰，要么位于外源DNA的緊下游區(qū)并與之相鄰。導(dǎo)致外源DNA隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)化程序會產(chǎn)生具有不同側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)化體，這些側(cè)翼區(qū)對每個轉(zhuǎn)化體而言是特征性的且是獨(dú)特的。當(dāng)通過傳統(tǒng)雜交將重組DNA引入到植物中時，其在植物基因組中的插入位點(diǎn)，或其側(cè)翼區(qū)一般不再改變。本文使用的“插入?yún)^(qū)”所指的區(qū)域?qū)?yīng)于至少40bp的區(qū)域，優(yōu)選是至少lOObp，多可至lOOOObp，該區(qū)域包含在包含植物基因組中外源DNA的上游和/或下游側(cè)翼區(qū)的序列內(nèi)?？紤]到由于種內(nèi)突變而引起的微小差異，插入?yún)^(qū)當(dāng)雜交到同種植物中時將會保持與轉(zhuǎn)化植物中包含外源DNA的上游和下游側(cè)翼區(qū)的序列有至少85%的序列同一性，優(yōu)選是90%，更優(yōu)選是95%，最優(yōu)選是100%序列同一性。
[0037]事件的定義是:(人工)基因座，由于基因工程方法，其攜帶了包含至少一個拷貝的目的基因的轉(zhuǎn)基因。事件的典型的等位狀態(tài)是外源DNA的存在或不存在。事件在表型上的特征是轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在基因水平上，事件是植物的基因組成的一部分。在分子水平上，事件的特征在于限制圖譜(比如可以通過Southern印跡法確定)，轉(zhuǎn)基因的上游和/或下游側(cè)翼區(qū)，以及轉(zhuǎn)基因的分子標(biāo)記的位置和/或分子結(jié)構(gòu)。通常，用包含至少一個目的基因的轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化植物可以得到一個轉(zhuǎn)化體群體，其包含大量獨(dú)立的事件，其中每個都是獨(dú)特的。
[0038]本文使用的優(yōu)良事件，是選自一組事件的事件。該事件的獲得是基于轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和穩(wěn)定性以及與包含優(yōu)良事件的植物的最優(yōu)農(nóng)學(xué)性狀的相容性，用相同的轉(zhuǎn)化DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化或用轉(zhuǎn)化得到的植物進(jìn)行回交。因此，優(yōu)良事件選擇標(biāo)準(zhǔn)為一個或多個，優(yōu)選地兩個或多個，優(yōu)選地所有下列標(biāo)準(zhǔn):
[0039]a)外源DNA的存在不損害植物的其它期望的特征，例如那些與農(nóng)學(xué)性能或商業(yè)價值相關(guān)的特征；
[0040]b)事件的特征在于穩(wěn)定遺傳的明確的分子結(jié)構(gòu)，并可為其開發(fā)出合適的鑒定對照的工具；
[0041]c)在事件的雜`合的(或半合子的)和純合的條件下，并在環(huán)境條件范圍內(nèi)的商業(yè)可接受的水平上(其中攜帶該事件的植物可能用在正常的農(nóng)業(yè)環(huán)境中)，目的基因顯示出正確的，適當(dāng)?shù)暮头€(wěn)定的時空表型表達(dá)。
[0042]外源DNA優(yōu)選與植物基因組中的一個位置相關(guān)，這可允許其輕易地漸滲入到期望的商業(yè)性遺傳背景中。
[0043]作為優(yōu)良事件的事件狀態(tài)，通過將優(yōu)良事件漸滲入到不同的相關(guān)遺傳環(huán)境中并觀察其與上述標(biāo)準(zhǔn)(例如a，b, c)中的一個，兩個或所有的符合來進(jìn)行確認(rèn)。
[0044]因此，“優(yōu)良事件”指的是一個包含外源DNA的基因座，其符合上述標(biāo)準(zhǔn)。植物，植物材料或其子代(例如種子)在其基因組中含有一個或多個優(yōu)良事件。
[0045]開發(fā)出來用于鑒定優(yōu)良事件，或包含優(yōu)良事件的植物，植物材料，或由包含優(yōu)良事件的植物材料生產(chǎn)的產(chǎn)品的工具，是基于優(yōu)良事件的特定基因組特征，例如包含外源DNA的基因組區(qū)、分子標(biāo)記或外源DNA的側(cè)翼區(qū)序列特定的限制性圖譜。
[0046]一旦外源DNA的一個或兩個側(cè)翼區(qū)已經(jīng)測序，借助分子生物學(xué)技術(shù)，可以設(shè)計(jì)出特異識別樣品的核酸(DNA或RNA)中的這個(些)序列的引物和探針。例如，可開發(fā)PCR方法鑒定生物樣品(例如植物，植物材料，或包含植物材料的產(chǎn)品)中的優(yōu)良事件。這種PCR方法是基于至少兩個特異“引物”，一個識別優(yōu)良事件的5 ‘或3 ‘側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，另一個識別外源DNA內(nèi)的序列。優(yōu)選地,引物具有一個15-35個核苷酸的序列,其在優(yōu)化的PCR條件下，分別可以“特異識別”優(yōu)良事件的5 ‘或3 ‘側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列和該優(yōu)良事件的外源DNA，從而可以從包含該優(yōu)良事件的核酸樣品中擴(kuò)增出特異片段(“整合片段”或鑒別擴(kuò)增子)。這意味著，在優(yōu)化PCR條件下，只可以擴(kuò)增出靶向整合片段，而不會擴(kuò)增出植物基因組內(nèi)的其它序列或外源DNA。
[0047]適于本發(fā)明的PCR引物可以是下面的:
[0048]-具有17nt至大約IOOnt長度的寡核苷酸，在其3‘末端包含至少17個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其選自5 ‘側(cè)翼序列(SEQ ID Nol的1-98位核苷酸的核苷酸序列，或SEQ ID Nol6的1-563位核苷酸的核苷酸序列)(識別5 ‘側(cè)翼序列的引物)；或
[0049]-具有17nt至大約200nt長度的寡核苷酸，在其3‘末端包含至少17個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，選自3 ‘側(cè)翼區(qū)(SEQ ID No2的41-452位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列)(識別3 ‘側(cè)翼序列的引物)；
[0050]-具有17nt至大約200nt長度的寡核苷酸，在其3‘末端包含至少17個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個核苷酸的核苷酸序列，選自插入DNA序列(SEQ ID Nol的99-334位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列)(識別外源DNA的引物)；
[0051]-具有17nt至大約40nt長度的寡核苷酸，包含至少17個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個核苷酸的核苷酸序列，選自插入DNA序列(SEQ ID No2的1-40位核苷酸的核苷酸序列)。
[0052]引物當(dāng)然可以比提到的17個連續(xù)核苷酸更長，例如，可以是20，21，30，35，50，75，100, 150，200nt的長度或更長。引物可以完全由選自提到的側(cè)翼序列和外源DNA序列的核苷酸序列所組成。但是，引物的核苷酸序列在5 ‘末端(即位于3 ‘端的17個連續(xù)核苷酸之外)是不太關(guān)鍵的。所以，引物的5 ‘序列可以由選自側(cè)翼序列或外源DNA的核苷酸序列所組成，但是還可以適當(dāng)?shù)匕恍?例如1，2，5，10個)錯配。引物的5 ‘序列甚至可以完全由與側(cè)翼序列或外源DNA無關(guān)的核苷酸序列所組成，例如，代表限制性酶識別位點(diǎn)的核苷酸序列。優(yōu)選地，這種具有錯配的不相關(guān)序列或側(cè)翼DNA序列應(yīng)該優(yōu)選不長于100個核苷酸，更優(yōu)選地，不長于50或甚至25個核苷酸。
[0053]此外，如果所述的3 ‘末端的17個連續(xù)核苷酸不只是源自外源DNA或SEQ ID Nol或2中的植物衍生序列，則合適的引物在其3 ‘末端可以包含跨越植物DNA衍生序列和外源DNA序列之間的連接區(qū)域(位于SEQ ID Nol的98-99位核苷酸和SEQ ID No2的40-41位核苷酸)的核苷酸序列或由該核苷酸序列組成。
[0054]對于熟練的技術(shù)人員來說，立刻就可以明白的是，適當(dāng)選擇的PCR引物對不應(yīng)該包含互相互補(bǔ)的序列。
[0055]出于本發(fā)明的目的，“SEQ ID No:X代表的核苷酸序列的互補(bǔ)序列”是這樣的核苷
酸序列，其是根據(jù)ChargafT ‘s規(guī)則將核苷酸用互補(bǔ)核苷酸替換(A#T; G0C)而從所
代表的核苷酸序列得到的核苷酸序列，并沿著5 ‘_3 ‘的方向閱讀，即所代表的核苷酸序列的反方向。
[0056]合適的引物的例子有:SEQ ID No7或SEQ ID Nol7的寡核苷酸序列(識別5 ‘側(cè)翼序列的引物)，SEQ ID No8, SEQ ID Nol8或SEQ ID Nol9的寡核苷酸序列(識別外源DNA的引物，與識別5‘側(cè)翼序列的引物一起使用)，SEQ ID No3的寡核苷酸序列(識別外源DNA的引物，與識別3 ‘側(cè)翼序列的引物一起使用)，SEQ ID No4, SEQ ID No5，SEQ ID N06的寡核苷酸序列(識別3 ‘側(cè)翼序列的引物)，以及SEQ ID NolO和11的寡核苷酸序列(識別EE-GH5中的特定外源DNA重排的引物)。
[0057]合適的寡核苷酸引物的其他例子在其3 ‘末端包括下列序列或由這些序列組成:
[0058]a.識別5 ‘側(cè)翼序列的引物:
[0059]-SEQ ID Nol的58_77位核苷酸的核苷酸序列
[0060]-SEQ ID Nol6的85-104位核昔酸的核昔酸序列
[0061]-SEQ ID Nol6的150-166位核昔酸的核昔酸序列
[0062]-SEQ ID No 16的150-171位核苷酸的核苷酸序列
[0063]-SEQ ID No 16的154-171位核苷酸的核苷酸序列
[0064]-SEQ ID No 16的87-104位核苷酸的核苷酸序列
[0065]-SEQ ID No 16的189-206位核苷酸的核苷酸序列
[0066]b.識別外源DNA序列的引物，與識別5 ‘側(cè)翼序列的引物一起使用:
[0067]-SEQ ID Nol的149-170位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0068]-SEQ ID Nol的169-186位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
`[0069]-SEQ ID Nol的193-212位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0070]-SEQ ID Nol的161-178位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0071]-SEQ ID Nol的194-211位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0072]-SEQ ID Nol的193-211位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0073]-SEQ ID Nol的163-185位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0074]-SEQ ID Nol的194-210位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0075]-SEQ ID Nol的193-210位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0076]-SEQ ID Nol的193-209位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列c.識別3 ‘側(cè)翼序列的引物:
[0077]-SEQ ID No2的149-168位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0078]-SEQ ID No2的154-173位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0079]-SEQ ID No2的140-159位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0080]-SEQ ID No2的141-160位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0081]-SEQ ID No2的147-166位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0082]-SEQ ID No2的148-167位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0083]-SEQ ID No2的149-167位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0084]-SEQ ID No2的153-172位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0085]-SEQ ID No2的154-174位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0086]-SEQ ID No2的160-177位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0087]-SEQ ID No2的232-251位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0088]-SEQ ID No2的140-160位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0089]-SEQ ID No2的141-161位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0090]-SEQ ID No2的147-165位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0091]-SEQ ID No2的149-166位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列[0092]-SEQ ID No2的148-166位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0093]-SEQ ID No2的147-167位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0094]-SEQ ID No2的148-168位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0095]-SEQ ID No2的153-173位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0096]-SEQ ID No2的154-175位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0097]-SEQ ID No2的156-175位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0098]-SEQ ID No2的232-250位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0099]-SEQ ID No2的140-157位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0100]-SEQ ID No2的140-161位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0101]-SEQ ID No2的141-162位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0102]-SEQ ID No2的148-165位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0103]-SEQ ID No2的149-165位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0104]-SEQ ID No2的147-168位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0105]-SEQ ID No2的148-169位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0106]-SEQ ID No2的156-174位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0107]-SEQ ID No2的153-174位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0108]-SEQ ID No2的232-249位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0109]-SEQ ID No2的234-251位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0110]-SEQ ID No2的141-163位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0111]-SEQ ID No2的148-164位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0112]-SEQ ID No2的147-169位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0113]-SEQ ID No2的153-175位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0114]-SEQ ID No2的156-177位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0115]-SEQ ID No2的181-198位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0116]-SEQ ID No2的181-202位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0117]-SEQ ID No2的234-250位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0118]-SEQ ID No2的140-162位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0119]-SEQ ID No2的181-203位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
[0120]d.識別外源DNA序列的引物，與識別3 ‘側(cè)翼序列的引物一起使用:
[0121]-SEQ ID No2的30-49位核苷酸的核苷酸序列
[0122]-SEQ ID No2的30_48位核苷酸的核苷酸序列
[0123]-SEQ ID No2的32_48位核苷酸的核苷酸序列
[0124]-SEQ ID No2的32_49位核苷酸的核苷酸序列
[0125]-SEQ ID No2的31_49位核苷酸的核苷酸序列
[0126]-SEQ ID No2的31_48位核苷酸的核苷酸序列
[0127]-SEQ ID No2的30_46位核苷酸的核苷酸序列
[0128]本文所用的“SEQ ID N0.Z的X-Y位核苷酸的核苷酸序列”表不的是包括兩個核苷酸端點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列。
[0129]優(yōu)選地，擴(kuò)增的片段具有50-500個核苷酸的長度，優(yōu)選是100-350個核苷酸的長度。特異引物可以具有分別與優(yōu)良事件的5‘或3‘側(cè)翼區(qū)及其外源DNA內(nèi)的序列有80-100%的同一性的序列，條件是在優(yōu)化的PCR條件下利用這些引物，錯配仍可以使優(yōu)良事件得到特異鑒定。但是，允許錯配的范圍可以容易地通過實(shí)驗(yàn)確定并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。
[0130]下表列舉了運(yùn)用選擇的PCR引物對所得到的預(yù)期的DNA擴(kuò)增子(或整合片段)的大小。
[0131]
【權(quán)利要求】
1.鑒定生物樣品中優(yōu)良事件的方法，所述優(yōu)良事件包含外源DNA，該外源DNA包含處于地下三葉草矮化病毒S7啟動子控制下的SEQ ID N0.20的經(jīng)修飾crylab基因的編碼序列，其中包含所述事件的參考種子以保藏號PTA-8171保藏在ATCC，所述方法包括 a)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用至少兩種引物從存在于所述生物樣品中的核酸擴(kuò)增100到500bp的DNA片段，所述引物中一種識別所述優(yōu)良事件的5‘側(cè)翼區(qū)或所述優(yōu)良事件的3‘側(cè)翼區(qū)，所述5 ‘側(cè)翼區(qū)具有SEQ ID Nol的1-98位核苷酸的核苷酸序列或SEQ ID No 16的1- 563位核苷酸的核苷酸序列；所述的3 ‘側(cè)翼區(qū)具有SEQ ID No2的41-452位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列，所述引物中另一種引物識別外源DNA內(nèi)的序列，該外源DNA具有SEQ ID Nol的99-334位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或SEQ ID No2的1_40位核苷酸的核苷酸序列；或 b)將生物樣品的核酸與所述優(yōu)良事件的特異探針雜交，其中所述特異探針的序列與包含所述優(yōu)良事件的5 ‘側(cè)翼序列或3 ‘側(cè)翼序列和與之相鄰的外源DNA序列的部分的序列有至少80%序列同一性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述識別5‘側(cè)翼區(qū)的引物由在其3 ‘最末端包含SEQ IDN0.6的核苷酸序列的核苷酸序列組成，并且其中所述識別外源DNA內(nèi)序列的引物由在其最3 ‘末端包含SEQ ID N0.3的核苷酸序列的核苷酸序列組成。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述方法包括使用所述優(yōu)良事件的鑒定方案擴(kuò)增約369bp的片段。
4.用于鑒定生物樣品中優(yōu)良事件的試劑盒，所述優(yōu)良事件包含外源DNA，該外源DNA包含處于地下三葉草矮化病毒S7啟動子控制下的SEQ ID N0.20的經(jīng)修飾crylab基因的編碼序列，其中包含所述事 件的參考種子以保藏號PTA-8171保藏在ATCC，所述試劑盒包含一種識別SEQ ID Nol的1-98位核苷酸的核苷酸序列或SEQ ID Nol6的1-563位核苷酸的核苷酸序列的引物或一種識別SEQ ID No2的41-452位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列，和一種識別SEQ ID Nol的99-334位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或SEQ ID No2的1_40位核苷酸的核苷酸序列的引物。
5.權(quán)利要求4的試劑盒，其包含一種由在其3‘最末端包含SEQ ID N0.6的核苷酸序列的核苷酸序列組成的引物和一種由在其最3 ‘末端包含SEQ ID N0.3的核苷酸序列的核苷酸序列組成的引物。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述特異探針的序列與SEQID Nol的78-119位核苷酸序列或SEQ ID No2的20-61位核苷酸序列或所述序列的互補(bǔ)序列有至少80%序列同一性。
7.用于鑒定生物樣品中優(yōu)良事件的試劑盒，所述優(yōu)良事件包含外源DNA，該外源DNA包含處于地下三葉草矮化病毒S7啟動子控制下的SEQ ID N0.20的經(jīng)修飾cryIab基因的編碼序列，其中包含所述事件的參考種子以保藏號PTA-8171保藏在ATCC，所述試劑盒包含能夠特異雜交EE-GH5的特定區(qū)域的特異探針，其中所述特異探針的序列與包含EE-GH5的5‘側(cè)翼序列或3 ‘側(cè)翼序列和與之相鄰的外源DNA序列的部分的序列有至少80%序列同一性。
8.權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述特異探針的序列與SEQID Nol的78-119位核苷酸或SEQ ID No2的20-61位核苷酸或所述序列的互補(bǔ)序列有至少80%序列同一性。
9.確認(rèn)種子純度的方法，所述方法包括用如權(quán)利要求1定義的特異引物或如權(quán)利要求8中定義的特異探針檢測如權(quán)利要求1中表征的優(yōu)良事件特異的區(qū)域，所述引物或探針特異識別種子樣品中所述優(yōu)良事件的5 ‘或3 ‘側(cè)翼區(qū)。
10.篩選種子中如權(quán)利要求1表征的優(yōu)良事件的存在的方法，所述方法包括用如權(quán)利要求I中定義的特定引物或如權(quán)利要求8中定義的特異探針檢測所述優(yōu)良事件特異的區(qū)域，所述引物或探針特異識別種子批次的樣品中所述優(yōu)良事件的5 ‘或3 ‘側(cè)翼區(qū)。
11.確定包含如權(quán)利要求1表征的優(yōu)良事件的植物，植物材料或種子的接合性狀態(tài)的方法，所述方法包括利用至少三種引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從存在于所述生物樣品中的核酸擴(kuò)增100-500bp的DNA片段，所述引物的兩種特異識別預(yù)插入的植物DNA，例如所述優(yōu)良事件的5 ‘側(cè)翼區(qū)或所述優(yōu)良事件的3 ‘側(cè)翼區(qū)，所述5 ‘側(cè)翼區(qū)具有SEQ ID Nol的1_98位核苷酸的核苷酸序列或SEQ ID Nol6的1-563位核苷酸的核苷酸序列,所述3‘側(cè)翼區(qū)具有SEQ ID No2的41-452位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或所述的預(yù)插入DNA具有SEQ IDNol5的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列，所述引物的第三種識別外源DNA內(nèi)的序列，該外源DNA具有SEQ ID Nol的99-334位核苷酸的互補(bǔ) 序列的核苷酸序列或SEQ ID No2的1_40位核苷酸的核苷酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述的第一種引物由在其3‘最末端包含SEQ IDN0.6的核苷酸序列的核苷酸序列組成，所述的第二種引物由在其最3 ‘末端包含SEQ IDN0.9的核苷酸序列的核苷酸序列組成，并且所述的第三種引物在其最3 ‘末端包含SEQ IDN0.3的核苷酸序列的核苷酸序列組成。
13.通過與互補(bǔ)的經(jīng)標(biāo)記核酸探針雜交來檢測生物樣品中如權(quán)利要求1表征的優(yōu)良事件的存在的方法，其中探針:靶核酸的比值通過靶核酸序列的回收而增大，所述方法包括: a)將所述的靶核酸序列與包含SEQID Nol的99-116位核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的第一核酸寡核苷酸雜交，或與包含SEQ ID No2的23-40位核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的所述的第一核酸寡核苷酸雜交； b)將所述的靶核酸序列與包含SEQID Nol的81-98位核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的第二核酸寡核苷酸雜交，或與包含SEQ ID No2的41-58位核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的所述經(jīng)標(biāo)記的核酸探針雜交；其中所述的第一和第二寡核苷酸重疊至少一個核苷酸，并且其中所述第一或第二寡核苷酸被標(biāo)記為所述經(jīng)標(biāo)記的核酸探針； c)用酶僅僅切割探針:靶核酸序列雙鏈體內(nèi)經(jīng)標(biāo)記的探針，所述酶引起選擇性探針切害I]，導(dǎo)致雙鏈體解離，留下完整的靶序列； d)通過重復(fù)步驟(a)到(c)回收靶核酸序列； e)檢測被切割的經(jīng)標(biāo)記探針，從而確定所述靶核酸序列的存在。
14.鑒定生物樣品中如權(quán)利要求1中定義的優(yōu)良事件的方法，所述方法包括使用由在其3 ‘最末端包含SEQ ID N0.10的核苷酸的核苷酸序列組成的引物和由在其3 ‘最末端包含SEQ ID N0.11的核苷酸的核苷酸序列組成的引物擴(kuò)增約262bp的DNA片段。
15.試劑盒，其包含兩種寡核苷酸引物，其中一種引物由在其3‘最末端包含SEQ IDN0.10的核苷酸的核苷酸序列組成，并且一種引物由在其最3 ‘末端包含SEQ ID N0.11的核苷酸的核苷酸序列組成。
16.分離的核酸分子，其包含SEQID Nol的78-119位核苷酸或SEQ ID No2的20-60位核苷酸的核苷酸序列，或所述序列的互補(bǔ)序列。
17.DNA分子，其可以使用一組引物從包含如權(quán)利要求1中定義的優(yōu)良事件的棉花的核酸樣品擴(kuò)增，所述引物中一種識別所述優(yōu)良事件的5 ‘側(cè)翼區(qū)或所述優(yōu)良事件的3 ‘側(cè)翼區(qū)，所述5‘側(cè)翼區(qū)具有SEQ ID Nol的1-98位核苷酸的核苷酸序列或SEQ ID No 16的I 一 563位核苷酸的核苷酸序列；所述的3‘側(cè)翼區(qū)具有SEQ ID No2的41-452位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列，所述引物中另一種引物識別外源DNA內(nèi)的序列，該外源DNA具有SEQ ID No I的99-334位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或SEQ ID No2的1_40位核苷酸的核苷酸序列。`
【文檔編號】A01H5/00GK103773863SQ201410015341
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2008年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2007年4月5日
【發(fā)明者】L·特落林德爾, S·莫昂, D·佩林克, V·哈貝克斯, H·范赫克 申請人:拜爾作物科學(xué)公司