一種生命結合態有機酵母蛋白硒產品生產方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種生命結合態的有機酵母蛋白硒產品的生產方法和應用。本發明在發酵過程中所使用的硒源是納米硒。納米硒具有毒性低、比表面積大和生物活性高等優勢，可提高酵母菌對硒的耐受量和生物利用率；本發明在酵母發酵培養基中加入蛋白酶，以提高發酵原料的利用率，降低成本。相比以往通過酵母菌把無機硒轉化為有機硒的方法，本發明硒源采用納米硒，其具有毒性低、轉化率高、吸收率高、產品安全性能好、生物利用率高和便于大規模生產及收集等優點。
【專利說明】一種生命結合態有機酵母蛋白砸產品生產方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種酵母蛋白硒產品的生產方法及應用領域，具體為一種生命結合態的有機酵母蛋白硒產品生產方法和應用。
【背景技術】
[0002]硒是人和動物機體必需的一種微量元素，是機體內多種酶的重要組成成分，具有抗氧化、調節機體代謝、增強免疫力等性能。但硒在最佳濃度和致毒濃度之間的安全限度非常狹窄，因此開發低毒、高效的硒源一直是硒營養研究的重點。納米硒是一種新型的硒產品，具有毒性低、生物利用率高等特點。中華人民共和國農業部公告(第1226號)，飼料添加劑品種目錄(2008)，礦物元素及其絡(螯)合物中沒有納米硒，即納米硒不能作為飼料添加劑。酵母菌具有富集硒元素的能力，酵母蛋白硒是通過酵母生長過程中對高濃度納米硒硒的自主吸收和轉化，使硒與酵母體內的蛋白質和多糖結合，形成蛋白硒、氨基酸硒及多糖硒，即使硒元素以生命結合態的形式存在，從而消除硒元素對動物機體的傷害，并有利于機體的吸收利用。另外酵母中有豐富的營養成分，可以發揮協同作用。
[0003]當前，畜產品日趨豐富，市場對畜產品的需求已由以數量為主轉向質量和數量并重的消費格局。酵母蛋白硒能促進動物機體的吸收利用率，提高畜禽的抗氧化和免疫性能，改善肉品質，又提高畜禽的生產性能，減少畜禽排泄物中氮、磷和硒的排泄量，保護水體和土壤免受污染，因而酵母硒作為一種高效、無毒副作用和環保型的“綠色”飼料添加劑，在21世紀將有十分廣闊的應用前景。
[0004]中國專利ZL201210496430.8提供了一種簡單混合方法制備富硒生物菌肥的方法，沒有將無機硒轉化為有機硒，而且沒有具體絡和方法。中國專利ZL01100600.5提供了一種含有高生物量的富硒酵母及其生產方法，其每克富硒酵母細胞含有機硒量僅有500~1500微克。中國專利:201010191719.X使用亞硒酸鈉所得產品硒含量5000mg/kg。
[0005]然而，酵母硒產品在應用過程中很少能達到顯著效果；另外酵母硒很少能大生產。主要的問題:(1)酵母硒產品中硒含量較低；(2)酵母菌對無機硒的耐受量低；(3)酵母硒中有機硒含量低，一部分只是簡單的酵母和硒吸附；(4)培養基原料利用率低，成本高，且生產工藝復雜，重復性很差；(5)酵母硒產品的吸收率低、安全性低及生物利用率低。
【發明內容】
[0006]本發明目的在于提供一種生命結合態的有機酵母蛋白硒產品、其生產方法和應用。所述生產方法是指利用微生物發酵生產高硒含量的酵母蛋白硒的方法。
[0007]本發明具體技術方案為:
一種生命結合態有機酵母蛋白硒產品，它由如下方法制備而得:在酵母發酵培養過程中分批加入納米硒元素，通過酵母生長過程中對高濃度納米硒的自主吸收和轉化，使硒與酵母體內的蛋白質和多糖有機結合，形成蛋白硒、氨基酸硒及多糖硒，即得以生命結合態存在的有機酵母蛋白砸廣品。[0008]無機硒毒性較大，酵母很難在高硒的條件下生長，即使有生長，其生長速率和對硒的利用率也不高。因此本發明所采用的硒源為納米硒。納米硒具有低毒高效優勢，酵母菌對其具有較好耐受性能。
[0009]本發明所采用的納米硒粒徑主要在在20~IOOnm之間，是單質硒，呈紅色。
[0010]所述酵母發酵培養過程中，酵母菌發酵培養基組份為豆柏50~80g/L、麩皮20~40g/L、麥芽汁 15 ~40g/L 和 BOSAR 蛋白酶 0.1 ~0.3g/L。
[0011]優選地，所述酵母菌發酵培養基組份為豆柏70g/L、麩皮30g/L、麥芽汁20g/L和BOSAR 蛋白酶 0.2g/L。
[0012]優選地，所述酵母菌發酵培養基使用前進行以下預處理步驟:將培養基中的豆柏、麩皮、麥芽汁與BOSAR蛋白酶混合均勻后，在pH值為5.5~6.0、溫度為50~55°C的條件下，水解5~7小時，將培養基中的蛋白質分解為小分子物質后，采用濕熱法對液體培養基進行滅菌，即在121°C下，滅菌20~30min，然后冷卻到常溫。
[0013]優選地，所述酵母發酵培養過程具體包括如下步驟:
1)將酵母菌通過斜面菌種培養、一級液體種子培養、二級液體種子培養和發酵罐種子培養進行擴大培養；
2)將擴大培養后的酵母菌按5%接種量接種到滅菌的發酵培養基中，并采用分批次的加入納米硒，在發酵溫度26°C~32°C進行發酵，將酵母發酵液干燥，即得生命結合態的有機酵母蛋白硒。
[0014]優選地,所述步驟2)中加入的納米硒總量為120~150mg/L。
[0015]優選地，所述步驟2`)中的發酵溫度為31°C。
[0016]優選地，所述步驟2)中的干燥是噴霧干燥。
[0017]優選地，所述步驟2)中的干燥還可以是噴粉干燥、蒸汽壓力滾筒干燥或冷凍干燥。
[0018]本發明由上述方法制備而得的生命結合態的有機酵母蛋白硒產品，每kg產品中含硒10000~12000mg，其中有機硒含量占總硒的99.0~99.4%，可以應用于制備飼料。
[0019]本發明的主要特點有:
(O 本發明使用的納米硒具有粒徑小、比表面積龐大、活性中心多，表面臺階和粗糙度增加的特點，具有較強的低毒高效優勢；酵母菌對納米硒的耐受性能穩定，吸收利用率聞。所得的酵母蛋白砸廣品中含砸聞，其中有機砸含量聞達12000mg/kg。
[0020](2) 本發明生產高硒含量的酵母蛋白硒中的酵母可以有活性，而以前的技術生產的酵母硒中的酵母大多是沒有活性的。
[0021 ] ( 3 )本發明中發酵培養基經蛋白酶預處理后，為酵母菌提供了更多的游離氨基酸，提高原料利用率，促進酵母菌的生長繁殖、發酵速率，并減少菌體用于合成氨基酸等造成的底物流失和能耗。
[0022](4)本發明所述方法制備而得的生命結合態有機酵母蛋白硒產品可以用于動物飼料和植物飼料的制備。
【具體實施方式】
[0023]實施例1:
生產流程如下:斜面菌種培養一一級液體種子培養一二級液體種子培養一發酵罐種子培養一發酵罐培養一分離一干燥一包裝。
[0024](I)斜面菌種培養:將酵母菌劃線于蛋白胨5g/L、酵母膏15g/L、氯化鈉4g/L、葡萄糖10g/L、納米硒120mg/L、瓊脂20g/L、pH值為4.8~6.0固體平板上活化，31°C恒溫培養48小時，挑取單菌落斜面保存備用。
[0025](2)—級液體種子培養:挑取斜面上的酵母菌種I~4環接種于裝有100~500mL蛋白胨5g/L、酵母膏15g/L、氯化鈉4g/L、葡萄糖10g/L、納米硒120mg/L、pH值為4.8~6.0液體培養基的三角瓶中，在31 °C恒溫培養48小時。 [0026](3) 二級液體種子培養:將一級種子培養液按1%的接種量接種于裝有10~40L的蛋白胨5g/L、酵母膏15g/L、氯化鈉4g/L、葡萄糖10g/L、納米硒120mg/L、pH值為4.8~6.0的卡氏培養瓶中，在26°C~32°C培養18~48小時。
[0027](4)發酵罐種子培養:將二級種子培養液按5%的接種量接種到裝有I~15 m3的已預處理的發酵培養基中、納米硒120mg/L的種子發酵罐中，在26°C~32°C培養18~48小時。
[0028](5)發酵罐培養:將發酵罐種子培養液按5%的接種量接種到裝有15~180m3的已預處理的發酵培養基中、納米硒120mg/L的發酵罐中(納米硒的加入方式為分批次加入)，在26°C~32°C培養14~36小時。
[0029]發酵培養基預處理:將豆柏70g/L、麩皮30g/L、麥芽汁20g/L和BOSAR蛋白酶
0.2g/L，混合均勻，在pH值為5.5~6.0、溫度為50~55°C的條件下水解5~7小時，將培養基中大分子物質酶解為小分子物質后，加入磷酸氫氨6g/L,調pH值為4.8~6.0,采用濕熱法對液體培養基進行滅菌，即在121°C下，滅菌20~30min，然后冷卻到常溫，接種。
[0030](6)分離:采用疊片式分離機分離，再用真空轉鼓過濾或者用板框壓濾。
[0031](7)干燥:采用噴霧干燥法干燥，干燥的產品具有活性；采用噴粉干燥或者蒸汽壓力滾筒干燥，干燥產品沒有活性，是粉狀或小片狀；也可以采用冷凍干燥法干燥。
[0032](8)包裝:可以采用多種形式的包裝成為高硒含量的富硒酵母產品。硒含量達到10000mg/kg，有機蛋白硒含量達到99.4%。
[0033]實施例2:
生產流程如下:斜面菌種培養一一級液體種子培養一二級液體種子培養一發酵罐種子培養一發酵罐培養一分離一干燥一包裝。
[0034](I)斜面菌種培養:將酵母菌劃線于蛋白胨5g/L、酵母膏15g/L、氯化鈉4g/L、葡萄糖10g/L、納米硒150mg/L、瓊脂20g/L、pH值為4.8~6.0固體平板上活化，31°C恒溫培養48小時，挑取單菌落斜面保存備用。
[0035](2)—級液體種子培養:挑取斜面上的酵母菌種I~4環接種于裝有100~500mL蛋白胨5g/L、酵母膏15g/L、氯化鈉4g/L、葡萄糖10g/L、納米硒150mg/L、pH值為4.8~6.0液體培養基的三角瓶中，在31 °C恒溫培養48小時。
[0036](3) 二級液體種子培養:將一級種子培養液按1%的接種量接種于裝有10~40L的蛋白胨5g/L、酵母膏15g/L、氯化鈉4g/L、葡萄糖10g/L、納米硒150mg/L、pH值為4.8~
6.0的卡氏培養瓶中，在26°C~32°C培養18~48小時。
[0037](4)發酵罐種子培養:將二級種子培養液按5%的接種量接種到裝有I~15 m3的已預處理的發酵培養基中、納米硒150mg/L的種子發酵罐中，在26°C~32°C培養18~48小時。
[0038](5)發酵罐培養:將發酵罐種子培養液按5%的接種量接種到裝有15~180m3的已預處理的發酵培養基中、納米硒150mg/L的發酵罐中(納米硒的加入方式為分批次加入)，在26°C~32°C培養14~36小時。
[0039]發酵培養基預處理:將豆柏70g/L、麩皮30g/L、麥芽汁20g/L和BOSAR蛋白酶
0.2g/L，混合均勻，在pH值為5.5~6.0、溫度為50~55°C的條件下水解5~7小時，將培養基中大分子物質酶解為小分子物質后，加入磷酸氫氨6g/L,調pH值為4.8~6.0,采用濕熱法對液體培養基進行滅菌，即在121°C下，滅菌20~30min，然后冷卻到常溫，接種。
[0040](6)分離:采用疊片式分離機分離，再用真空轉鼓過濾或者用板框壓濾。
[0041](7)干燥:采用噴霧干燥法干燥，干燥的產品具有活性；采用噴粉干燥或者蒸汽壓力滾筒干燥，干燥產品沒有活性，是粉狀或小片狀；也可以采用冷凍干燥法干燥。
[0042](8)包裝:可以采用多種形式的包裝成為高硒含量的富硒酵母產品。硒含量達到12000mg/kg，有機蛋白硒含量達到99.0%。
[0043]對比例I
生產流程如下:斜面菌種培養一一級液體種子培養一二級液體種子培養一發酵罐種子培養一發酵罐培養一分離一干燥一包裝。
[0044]I)斜面菌種培養:將耐高 硒的富硒酵母菌種接種到含糖量為5~25重量％、硒(硒酸鹽或亞硒酸鹽)濃度為300 μ g/mL、pH值為4~6.5的麥芽汁固體斜面上，在26~35°C培養24~48小時。
[0045]2)—級液體種子培養:將斜面的酵母菌種接種I~4環到裝有100~500mL的含糖量為5~25重量％、硒(硒酸鹽或亞硒酸鹽)濃度為300 μ g/mL、pH值為4~6.5的麥芽汁專用培養瓶中，在26~35°C培養24~48小時。
[0046]3) 二級液體種子培養:將一級液體種子培養液接種到裝有10~40L的含糖(麥芽汁或糖蜜或麥芽汁和糖蜜的混合物)量為5~25重量％、硒(硒酸鹽或亞硒酸鹽)濃度為300 μ g/mL、pH值為4~6.5的卡氏培養瓶中，在26~35°C培養15~48小時。
[0047]4)發酵罐種子培養:將二級種子培養液接種到裝有I~15m3的含糖(麥芽汁或糖蜜或麥芽汁和糖蜜的混合物)量為5~25重量％、硒(硒酸鹽或亞硒酸鹽)濃度為300 μ g/mL、加I~5重量％磷酸氫氨、pH值為4~6.5的種子發酵罐中，在26~35°C培養18~48小時。
[0048]5)發酵罐發酵培養:將發酵罐種子培養液接種到15~180m3的含糖(淀粉水解糖或糖蜜或淀粉水解糖和糖蜜的混合物)量為5~25重量％、硒(硒酸鹽或亞硒酸鹽)濃度為300 μ g/mL、加I~5重量％磷酸氫氨、pH值為4~6.5的發酵罐中,所用的營養源采用流加方式，硒分批次加入，在26~35°C培養14~36小時。
[0049]6)分離:采用疊片式分離機分離，再用真空轉鼓過濾或者用板框壓濾。
[0050]7)干燥:采用60~140°C沸騰式干燥，干燥的產品具有活性；采用100~180°C噴粉干燥或者用3~6Kpa的蒸汽壓力滾筒干燥，干燥產品沒有活性是粉狀或小片狀；也可以采用冷凍干燥法干燥。
[0051]8)包裝:可以采用多種形式的包裝成為高硒含量的富硒酵母產品。硒含量達到7900mg/kg，其中有機硒含量占總硒的90.1重量％。[0052]對比例2
1、培養基
麥芽汁為培養基中的主要碳源，添加的糖度為90g/L~110g/L，蛋白胨和酵母膏為培養基中的氮源；亞硒酸鈉為培養基中的無機硒，種子培養基的初始添加量為50mg/L，發酵培養基的初始添加量為100mg/L，流加補硒的亞硒酸鈉濃度為10g/L。
[0053]種子培養基按照如下方法制備:將含糖量90g/L的麥芽汁、蛋白胨、酵母膏和無水亞硒酸鈉混合得到種子培養基，蛋白胨在種子培養基中的濃度為15g/L，酵母膏在種子培養基中的濃度為8g/L，亞硒酸鈉在種子培養基中的初始添加濃度為50mg/L，該種子培養基初始PH值為5.5。
[0054]發酵培養基按照如下方法制備:將含糖量110g/L的麥芽汁、蛋白胨、酵母膏和無水亞硒酸鈉混合得到種子培養基，蛋白胨在發酵培養基中的濃度為15g/L，酵母膏在發酵培養基中的濃度為8g/L，亞硒酸鈉在發酵培養基中的初始添加濃度為100mg/L，該發酵培養基初始PH值為6。
[0055]2、富硒酵母產品
(I)斜面菌株培養
將富硒酵母S1204 CCTCC N0:M2012216接種于含葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，瓊脂20g/L，亞硒酸鈉30ug/mL的斜面培養基(18*180mm試管)。28°C培養16h。
[0056](2)搖瓶一級 種子培養
吸取6mL無菌水至18*180mm的試管斜面，洗脫斜面菌株制成菌懸液(3X IO7個/mL)，然后再按2%的接種量接種至含有80mL的種子培養基的500mL搖瓶中，8層紗布封口，28°C振蕩培養(220r/min) 16h，得到一級種子培養液(種子液的0D600nm=50)。
[0057](3) 二級種子培養
將一級種子培養液按1% (體積百分含量)的接種量移種至含20L種子培養基的50L全自動發酵罐，28°C，pH5.5培養16h，得到搖瓶二級種子培養液(種子液的0D600nm=70)。
[0058](4)三級種子培養
將二級種子培養液按5% (體積百分含量)的接種量移種至含250L種子培養基的500L全自動發酵罐，培養溫度28°C，pH6.0，培養16h，得到搖瓶三級種子培養液(種子液的0D600nm=75)。
[0059](5)發酵培養
將三級種子培養液按12% (體積百分含量)的接種量移種至5m3發酵罐(裝液量為45%) 28 V，溶氧控制50~70%,含糖量控制1.0~2.0g/100mL, pH維持5.5~6.0，發酵12h后在發酵產物中補加終濃度為200mg/L的亞硒酸鈉，再發酵培養22h，發酵菌濃達到0D600nm=135,收集發酵產物。富硒酵母產品中的有機硒濃度(有機硒含量)達8899mg/kg。
[0060]應用實驗 實施例3
在飼料廠生產肥育豬飼料25噸，飼糧中添加的酵母硒產品的量為40mg/kg，180頭體重65kg左右的杜長大肥育豬按飼養要求分為6組，每組3個重復，每個重復10頭，進行了為期45天的養殖試驗。
[0061]表1肥育豬肉品質表
【權利要求】
1.一種生命結合態的有機酵母蛋白硒產品生產方法，其特征在于，包括如下步驟:在酵母發酵培養過程中分批加入納米硒元素，通過酵母生長過程中對硒的自主吸收和轉化，使硒與酵母體內的蛋白質和多糖有機結合，形成蛋白硒、氨基酸硒及多糖硒，即得以生命結合態存在的有機酵母蛋白砸廣品。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述納米硒是粒徑在20~IOOnm之間的紅色單質硒。
3.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述納米硒添加量是120~150mg/L。
4.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述酵母發酵培養過程中，發酵培養基組份為豆柏50~80g/L、麩皮20~40g/L、麥芽汁15~40g/L和BOSAR蛋白酶0.1~0.3g/L。
5.根據權利要求4所述方法，其特征在于，所述酵母菌發酵培養基組份為豆柏70g/L、麩皮30g/L、麥芽汁20g/L和 BOSAR蛋白酶0.2g/L。
6.根據權利要求4所述方法，其特征在于，所述酵母菌發酵培養基使用前進行以下預處理步驟:混合均勻后，在pH值為5.5~6.0、溫度為50~55°C的條件下，水解5~7小時后，采用濕熱法對液體培養基進行滅菌，即在121°C下，滅菌20~30min，然后冷卻到常溫。
7.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述酵母發酵培養過程具體包括如下步驟: 1)將酵母菌通過斜面菌種培養、一級液體種子培養、二級液體種子培養和發酵罐種子培養進行擴大培養； 2)將擴大培養后的酵母菌按5%接種量接種到滅菌的發酵培養基中，并采用分批次的加入納米硒，在發酵溫度26°C~32°C進行發酵，將酵母發酵液噴霧干燥，即得生命結合態的有機硒，發酵溫度優選為31°C。
8.根據權利要求7所述方法，其特征在于，所述步驟2)中納米硒添加量是120~150mg/Lo
9.根據權利要求1所述方法制備而得的生命結合態有機酵母蛋白硒產品。
10.根據權利要求12所述有機酵母蛋白硒產品，其特征在于，每kg產品中含硒10000~12000mg，其中有機硒含量占總硒的99.0~99.4%。
【文檔編號】A23K1/16GK103756922SQ201310747684
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月31日 優先權日:2013年12月31日
【發明者】劉東霞, 杜景德 申請人:廣州市博仕奧生物科技有限公司