獲得抗病原體之牡蠣的方法

獲得抗病原體之牡蠣的方法
【專利摘要】本發明涉及獲得抗病原體之牡蠣的方法以及所得的牡蠣。本發明的方法包括將抗所述病原體的地中海牡蠣食用牡蠣(Ostrea?edulis)與異性非抗性牡蠣雜交。特別地，本發明涉及抗病原體(例如牡蠣包拉米蟲(Bonamia?ostreae)和馬泰氏孢子蟲(Martelia?refringens))的養殖牡蠣在商業生產中的用途。
【專利說明】獲得抗病原體之牡蠣的方法
[0001]本申請是中國專利申請200880111381.3的分案，后者是2008年8月12日提交的PCT申請PCT/FR2008/001187于2010年4月13日進入中國國家階段的申請。
【技術領域】
[0002]本發明涉及獲得抗病原體之牡蠣的方法以及所得的牡蠣。
[0003]更特別地,本發明涉及抗病原體(例如牡販包拉米蟲(Bonamia ostreae)和馬泰氏孢子蟲(Martelia refringens))的養殖牡販在商業生產中的用途。
[0004]在下述說明書中，方括號([])內的數字指實施例后給出的參考文獻的序號。
【背景技術】
[0005]平牡蠣食用牡蠣(Ostrea edulis)是歐洲、美國以及加拿大養殖最多的牡蠣品種
之一 O
[0006]在1970-1980年間，寄生蟲馬泰氏孢子蟲和牡蠣包拉米蟲的出現導致牡蠣的產量顯著下降，因此迫使牡蠣養殖者們尋找對抗這些寄生蟲的手段。
[0007]已采取了數種方法來限制牡蠣的感染。所述方法之一是限制牡蠣從一處孵化場所向另一孵化場所遷移，并且限制牡蠣苗(naissain)從一個區域向另一區域遷移。
[0008]另一種方法是設法選擇抗寄生蟲牡販包拉米蟲的牡販(Nacir1-Graven等(1998) “Selecting the flat oyster Ostrea edulis(L.) for survival when infectedwith the parasite Bonamia ostreae^J.Exp.Mar Biol.Ecol., 224:91-107 [I])。這樣的選擇使得促進牡蠣耐受成為可能，而非抵抗所述寄生蟲，并且削弱了養殖牡蠣的遺傳多樣性以及有害的牡販近親(consanguinity)增加(N.Taris 等“Cons6quences genetiques de
la production des larves d^huftrfiS en ecloserie:etude des processus de deriveet de selection.”，Les actes du BRG,6(2006)521-541.[2])。
[0009]另一些研究利用來自大西洋的敏感型牡蠣苗鑒定用于養殖牡蠣的未感染區。這些研究之一是于80年代在科西嘉島的Etang de Diana(黛安娜湖)中進行的，根據有關調節水產養殖品的動物健康條件的歐洲議會指令91/67/CEE，遵照IFREMER的提案，將該池塘歸類為感染區。圍繞整個科西嘉島的區域I被歸類為無包拉米蟲病(bonamiose)并且無馬泰氏孢子蟲病(marteliose)的區域。
[0010]許多研究使得可繪制出受寄生蟲感染的區域圖，甚至在各區域選擇出更好地耐受寄生蟲的牡販，但是這削弱了它們的遺傳多樣性。
[0011]任何這些研究均不可能產生抗所述寄生蟲的牡蠣。
[0012]因此，實際上需要可獲得抗病原體之牡蠣的方法以克服現有技術中的不足、缺點和障礙，并且可降低工業生產的成本。該方法還必須易于實施。

【發明內容】

[0013]更明確地，本發明的目的在于通過提供用于獲得抗病原體之牡蠣的方法來滿足需求和克服上述缺點。
[0014]本發明方法的特征在于其包括將抗這些病原體的地中海牡蠣食用牡蠣與非抗性牡蠣進行雜交。
[0015]本發明還涉及可利用本發明方法獲得的抗病原體的牡蠣。
[0016]根據本發明，“抗性牡蠣”意指抗病原體的任何地中海牡蠣食用牡蠣。所述抗性地中海牡蠣食用牡蠣可以是抗病原體且來自地中海的任何野生型牡蠣。例如，所有未經人為來源的選擇壓力、也未經遺傳性污染(例如通過培養和/或對源自大西洋的培養品系的移植來實現)的地中海牡蠣食用牡蠣。可以利用等位酶標志物或微衛星標志物(Launey S.等“Geographic structure in the European flat oyster(Ostrea edulis L.)as revealedby Microsatellite polymorphism.，，J Hered.2002 9-10 月；93 (5):331-51.(2002) [3])或者RNA序列對品系進行分子分析來鑒定牡蠣的地中海來源。例如，可用于顯示地中海來源之牡蠣的分子標志物對應于品系的線粒體12s-rRNA基因的313對堿基序列，例如科學文獻 Diaz-Almela 等，“Reduced female gene flow in the European flat oyster Ostreaedulis”，J Hered.2004 年 11-12 月；95(6):510-6.(2004) [4]中所述的。
[0017]可選擇抗性牡蠣使其具有最適于雜交方法的優選的養殖生長品質和狀態指數，gp可食用肉占總重量的比例。例如，所述比例可以為0.10~0.20，優選大于0.15。例如，可對處于同年齡段且具有適宜的殼構造(指下半部的殼凸起)的最大牡蠣進行測量。例如，可在最初成熟的幼齡牡蠣(例如對于科西嘉島牡蠣而言，重量小于80g)中選擇抗性牡蠣，最大的牡蠣具有產生較大比例的殼的趨勢。其中，優選地可選擇凸起度(定義為厚度與平均直徑[(長度+寬度)/2]的比值)大于0.33的牡蠣。
[0018]可根據其表型特征例如大小、重量等來選擇抗性牡蠣。例如，優選地可選擇直徑大于60mm的抗性地中海牡蠣食用牡蠣。
[0019]還可根據有關其天然生長介質的場所來選擇抗性牡蠣。例如，就散布在沉積物表面上的游離形式和固定在其天然介質中的巖石上的牡蠣而言，游離形式的牡蠣是優選的，這是因為它們表現出更適于養殖的特征。
[0020]在天然場所中的牡蠣采樣區域優選那些包括最重要群體(意即具有最高生產力)的區域。對于生長在軟沉積物上的游離形式而言，可例如在密度大于I只個體/m2、優選大于2只個體/m2的群體中選擇牡蠣。
[0021]可在例如抗性地中海牡蠣食用牡蠣、來源于科西嘉島潟湖的牡蠣、來自摩洛哥納多爾的牡蠣、來自突尼斯加貝斯的牡蠣、來自利比亞的牡蠣、來自希臘的牡蠣、來自西班牙穆爾西亞的Mar Menor中的牡蠣、來自土耳其博斯普魯斯的愛琴海區域的牡蠣、來自巴利阿里群島的米諾卡島的牡蠣、來自烏克蘭塞瓦斯托波爾的牡蠣、來自紅海和/或波羅的海的牡蠣中選擇抗性牡蠣食用牡蠣。
[0022]優選地，為了實施本發明的方法，可在來自黛安娜湖、烏爾比諾湖(Etangd’ Urbino)、波爾圖維基奧(Porto Vecchio)海灣、Santa Manza海灣和撒丁島潟湖的野生型科西嘉島牡蠣食用牡蠣中選擇抗性牡蠣食用牡蠣。優選地，為了實施本發明的方法，所選抗性牡蠣食用牡蠣是來自黛安娜湖的野生型科西嘉島牡蠣食用牡蠣。
[0023]根據本發明，所述抗性 地中海牡蠣可以是來自古老的地中海種群的牡蠣。優選地，所述牡蠣是未經由移植或養殖引起的外部遺傳改變的野生型平牡蠣和/或來源于地理受限的地中海潟湖的牡蠣。長期生活在地中海潟湖的野生型種群具有適于改變的基因型、表型和養殖特征，所述改變特別是與其群落生境相關的適應特質，更特別地是溫度水平和幅度、鹽度水平和變化、介質的氧化作用、介質的營養特質、潮汐以及天然種群對著陸的可能抗性。例如，摩洛哥納多爾潟湖中牡蠣的天然種群可在高潮汐期間暴露數小時，并且經受亞熱帶地區的日光而不死亡。就本發明方法的實施方案而言，所述抗性牡蠣可以是來自納多爾的牡蠣，例如用以獲得適于在大西洋的潮間帶養殖的雜交體。
[0024]然而，來自具有低食物供應的開放群落生境的抗性地中海品系遺傳了常見的適應特征，其通常對雜交的品質不是非常有利。對來自希臘基克拉澤斯群島(Cyclades)、克羅地亞、卡拉布里亞(Calabre)、西西里島和卡馬爾格(Camargue)(羅if1]河畔圣路易港
(Port-Saiiil-Louis-tiu-khoiie))的抗性牡蠣而言，情形如此。[0025]可例如通過利用前述的等位酶標志物、微衛星標志物[3]或RNA序列[4]對所述品系進行分子分析來鑒定牡蠣的地中海來源。
[0026]根據本發明，所選的抗性牡蠣有利地具有適于雜交的碳水化合物儲備物質水平。由糖原組成的這種儲備物質將日益呈現出“富含脂肪的”牡蠣，這可使其生殖腺發育以及產生其配子。這種儲備物質可在春季用于產生配子以及在整個配子發生過程中使用；因此，產卵牡販(geniteurs)的營養決定了繁殖能力和產生后代(recrutement)。碳水化合物儲備物質有利于牡蠣表現出完全的繁殖能力，從而有利于實施本發明的方法。
[0027]根據本發明，優選選擇繁殖期(ige de reproduction)(尤其是第一繁殖期)的
抗性地中海牡蠣食用牡蠣。選擇第一繁殖期的牡蠣可保證用于進行雜交的配子具有最大存活率。
[0028]根據本發明，“非抗性牡蠣”意指易受病原體攻擊的任何敏感型牡蠣，無論其來源、屬或種如何。牡蠣對于病原體不具有抗性可表現為牡蠣生物學功能的任何改變，例如可引起牡蠣生長改變、減少或停止的生物學功能。對病原體不具有抗性還可導致牡蠣死亡。在包拉米蟲病的情形中，出現感染的最初指征常常進一步造成生長減慢、腮損傷、貝殼打開以及高死亡率，通常從最初性成熟開始出現。就馬泰氏孢子蟲病(也稱為“Aber病”)而言，在溺灣或其它潮間帶的養殖場中可出現下述臨床征兆:消瘦和糖原儲備耗竭、消化腺完全褪色、停止進食以及牡蠣逐漸衰弱，這些是隨后出現高死亡率的征兆。
[0029]換句話說，所述非抗性牡蠣可以是對養殖牡蠣的病理學敏感的任何牡蠣。例如，其可以是牡販科(0str6id6s)的雙殼牡販。
[0030]例如，所述非抗性牡販可以是對I型牡販皰疫病毒(Ostreid Herpesvirus-1,OsHV-1)敏感的牡蠣。
[0031]例如，所述非抗性牡蠣可以是由于以下環境因素改變而引起免疫防御下降的牡蠣:毒性元素、污染物或環境的物理化學因素(Gagnaire B.，2005) [10]。
[0032]例如，所述非抗性牡蠣還可以是通過遺傳漂變而對感染原敏感的牡蠣，所述遺傳漂變是由孵化場所中的培養措施或選擇壓力而引起的(Taris N.，2007) [15]。
[0033]根據本發明，可根據本發明方法進行雜交的非抗性牡蠣可選自從天然收集(collection)或孵化場所獲得的野生型牡蠣、養殖牡蠣，天然牡蠣品系，地中海本地牡蠣以及來源于地中海以外地區的牡蠣。例如，所述非抗性牡蠣可以是來自大西洋、太平洋和/或印度洋的牡蠣。
[0034]根據本發明，所述非抗性牡蠣可例如是由于牡蠣養殖而退化或者被來自大西洋、太平洋和/或印度洋的敏感型牡蠣和/或受污染牡蠣的遷移而污染的地中海牡蠣。
[0035]根據本發明，非抗性牡蠣可以是與所述抗性牡蠣食用牡蠣相同或不同的屬或種。其可以是例如平牡蠣或葡萄牙牡蠣。例如，可用于本發明中的非抗性牡蠣種類可屬于但不限于下述屬和/或種:食用牡販、扁牡販(Ostrea angasi)、奧林匹亞牡販(Ostreaconchaphila)、淺黃牡蟲厲(Ostrea Iurida)、密鱗牡蟲厲(Ostrea denselamellosa)、Ostreapuelchana、葉片牡販(Ostrea folium)、0strea permollis、0strea stentina、智利平牡蟲厲(Tiostrea chilensis)、美洲牡蟲厲(Crassoster virginica)、巨牡販(Crassostrea gasar)以及紅樹牡販(Crassostrea Rhizoporae)等。
[0036]所述非抗性牡蠣可選自例如巨牡蠣(其是紅樹、河口和西非紅樹的牡蠣)、紅樹牡販(Crassostrea Rhizophorae, 一種紅樹牡販)、印度洋-太平洋牡販等。
[0037]所述非抗性牡蠣食用牡蠣可例如選自如下牡蠣:來自托湖(Etang deThau) “Bouzigues”的平牡蠣、來自威尼斯潟湖的牡蠣、來自威尼斯的平牡蠣、來自阿爾卡雄灣(Bassin d’Arcachon) “Gravettes”的平牡販、來自沙倫特河(Charente)和/或旺代(Vend6e)的平牡販、來自南布列塔尼(Brittany) “Belon”的起源于溺灣和莫爾比昂灣(golfe du Morbihan)的平牡販、來源于北布列塔尼和諾曼底的“Canceles”的牡販、來源于西班牙的加利西亞(Galice)的牡蠣、來源于葡萄牙的牡蠣、來源于大不列顛、康沃爾的牡蠣、來自南愛爾蘭和北愛爾蘭的牡蠣、來自荷蘭的牡蠣、來自丹麥的牡蠣、來自美國和加拿大、西大西洋(從佛羅里達到魁北克)的牡蠣、來自東太平洋的源于美國和加拿大海岸的牡蠣、來自加利福尼亞和阿拉斯加之間海岸的牡蠣。
[0038]為了實施本發明的方法，非抗性牡蠣可以是感染或未感染病原體的、耐受或不耐受病原體的。當在表現其所具有的病變之前可進行初次繁殖時，所述牡蠣是所述耐受型牡蠣。
[0039]根據本發明，為了實施本發明的方法，優選在性潛伏期(repos sexuel)之后選擇所述抗性地中海牡蠣食用牡蠣和非抗性牡蠣。該時期通常出現在冬季。然后，優選使這些抗性和非抗性牡蠣適應于雜交，例如在孵化池中，例如逐漸增加光周期。
[0040]根據本發明，可根據針對病原體的抗性或非抗性特征分別對所述牡蠣進行標記。可通過本領域技術人員公知的任何方法進行標記，例如通過劃痕或使用膠水(例如環氧樹脂膠)固定標簽來實現。對牡蠣進行這樣的單獨標記可形成雜交牡蠣苗的同源批次。
[0041]根據本發明，用于雜交的牡蠣是異性的。牡蠣屬的平牡蠣是非同步雙殼，具有節律性的連續性行為。通常是先雄后雌(protandrique)，其可在同一季節中數次改變性別，由于雄性和雌性品系同時存在，使得難于辨認性別。與牡蠣屬相關的這種特殊繁殖方式在大量繁殖的情形中妨礙對遺傳同一性的任何控制。因此，當雜交涉及牡蠣屬的抗性和非抗性牡蠣時，優選兩兩分離牡蠣。換句話說，由此優選兩兩分離牡蠣。從理論上講，所分離的每對牡蠣應當僅有一半機會是雄性-雌性配對的。有利地，在本發明中，70 %~80 %的配對發生受精。事實上，最早成熟的牡蠣的成熟可導致另一只牡蠣的性別朝相反方向發展。因此，本發明所獲得的雜交數目高于所假設的理論數目。
[0042]應當指出，牡蠣更通常是廣溫性和廣鹽性的。這種耐受有利于同步成熟和配子排出以及來源于不同地理介質的兩只牡蠣的雜交。
[0043]根據本發明，所述病原體可選自細菌、寄生蟲和病毒。
[0044]根據本發明，“病原體”意指一種病原體或幾種病原體，或者一種病原體與引起細菌性病變、病毒性病變、寄生蟲病或與此相關之病變的其它病原體的組合。
[0045]根據本發明，所述病原體可選自單孢子蟲(haplosporidies)、原生動物、馬泰氏孢子蟲(martelias)、寄生蟲以及啟動牡蠣中一般性細胞和/或體液免疫機制的外部污染病原體(例如牡蠣包拉米蟲和馬泰氏孢子蟲病原體)。
[0046]根據本發明，所述病原體可引起病變，例如包拉米蟲病、馬泰氏孢子蟲病、單孢子蟲病(haplosporidose)、小紅細胞癥(microcytose)、派琴蟲病(perkinsose)和 / 或irivovirose。優選地,所述病原體引起包拉米蟲病和/或馬泰氏孢子蟲病。
[0047]根據本發明，所述病原體可引起動物流行病、大規模的或反復的死亡綜合征，例如與諸如培養介質溫度升高和/或I型牡蠣皰疹病毒(OsHV-1))以及與機會致病性病原體(例如諾卡氏菌(Nocardia crassostreae))相關的夏季死亡。這些在對具有經濟效益的軟體動物中有所描述的病原體和/或機會致病性病原體總結于“Synopsis of InfectiousDiseases and Parasites of Commercially Exploited Shellfish，，(Bower 等，1994)[13]和(Bower&McGladerry, 2003) [14]中。
【具體實施方式】
[0048]下文描述用于 實施本發明方法的手段。
[0049]根據本發明，雜交可在本領域技術人員公知的能實施牡蠣雜交的任何池中進行。例如，所述池可以是育苗容器(bac d’ 6closion),養魚缸，由玻璃、木材、金屬、合成材料或磚石結構制得的任何池、容器或盆，或者任何合適的器皿。用于實施本發明方法的池的容積可例如是I~100升，優選5~20升。
[0050]根據本發明，所述池可包括水充氧裝置(moyens d’ oxygenation de I’ eau)。例如，可利用本領域技術人員公知的任何裝置向水充氧，例如能將空氣排放到池的水中的泵。也可以利用水循環來充氧。可在實施雜交的過程中調節水的充氧速率，優選地，無論本發明所需的溫度和鹽度水平如何，均以用溶解氧使水介質飽和為準。氧的水平可以是5mg/l至
Ilmg/1，優選高于6.5mg/l。根據本發明，包含待雜交之牡蠣的池可例如預先裝滿水，其通過水循環連續或間斷供應來實現。所述水循環速率可為O升/小時至100升/小時，優選為5升/小時至20升/小時。所述速率可根據牡蠣和幼體的呼吸和進食需求進行調整。
[0051]根據本發明，池與池之間的水循環可以是隔離的。更具體而言，水循環的隔離可避免對待雜交之牡蠣的外部影響，從而保證雜交幼體的純度。這種隔離可例如防止產生具有不期望之基因污染的雜交體。
[0052]根據本發明，本發明所用的水可以是適于實施雜交的任意水。適于實施本發明的水可例如是與非抗性牡蠣的原始介質和/或抗性牡蠣的原始介質之物理化學特性(例如鹽度、pH、溫度等)相同、不同或介于之間的水。
[0053]根據本發明，隨著本發明方法之步驟的變化，水可以具有不同的組成。
[0054]根據本發明，所用水的鹽度可為3%。~50%。，優選為12%。~38%。。其pH可為6.5~9，優選7~8.5。其溫度可為-8~+55°C，優選12~40°C。[0055]根據本發明，用于實施本發明的食物供應可由本領域技術人員公知的用于養殖牡蠣和/或雜交牡蠣的任何食物來源組成。所述食物供應可由例如單細胞藻類、浮游植物、用于提供食物微粒的水底細菌、組合食品、溶解的有機物質供應(例如碳水化合物、蛋白質、維生素等)或其組合組成。
[0056]浮游植物、水底細菌以及單細胞藻類可來源于牡蠣的孵化場所和/或天然培養介質。微粒可以是天然或人工來源的，例如其可來源于有機廢棄物和/或水產養殖廢棄物。
[0057]單細胞藻類和/或浮游植物可例如通過離心濃縮成冷糊形式，所述食物微粒可例如采用混懸和/或乳劑形式，組合食物可例如是干燥的或水合的、可與甘油和/或脂質和/或蛋白質物質一起被擠出、標定或微囊化的。
[0058]生長在孵化場所和/或天然介質中的單細胞藻類可選自金藻(Isochrysisgalbana)、中肋骨條藻(Skeletonema costanum)、路氏杷夫藻(Pavlova lutheri)、|丐質角毛藻(Chaetoceros calcitrans)、扁藻(Tetraselmis sp.)等。例如，浮游植物可選自金藻、路氏杷夫藻、Chaetoceros forma pumilum等。所用的浮游植物和單細胞藻類的數量和質量優選地適于實施本發明的方法。營養是產卵牡蠣繁殖以及成功產生幼體和雜交牡蠣的重要因素。
[0059]在本申請中，“雜交”意指本領域技術人員公知的能實施上述至少一種抗性牡販與一種非抗性牡販雜交的任何方法。也可根據Lannan J.E, 1971, Experimentalself-fertilization of the Pacific oyster, Crassostrea gigas, utilisingcryopreserved sperm, Genetics, 68:599-601 [5]以及 Bougrier 和 Rabedomanana, 1986,Cryopreservation of spermatozoa of the Japanese oyster, Crassostreea gigas.Aquaculture, 58:227-280 [6]的研究中的精子冷凍保藏技術，或者通過使用Haffray等“Domestication et amelioration genetique des cheptels piscicoles dans Iecadre du SYSAAF”，INRA Prod.Anim.，2004，17 (3)，243-252 [7]的配子多種特異性保藏和清洗稀釋劑，利用上述抗性和/或非抗性牡蠣的配子直接實施雜交。養殖知識可通過性別控制、通過產卵牡蠣的個體成熟、通過產卵牡蠣之間的同步產卵和化學物質交換來控制所鑒定個體的人工繁殖。這些知識見于科學綜合刊物中:Gerard A., Nacir1-Graven
Y.，Boudry P.，Launey S.，Heutebise S.，Ledu C.，Phelipot P.， (1997).Coiltrolcde la gametogenese des Illlltrcs creuses et plates.1n:La production naturelleet COtttrdMe des Bivalves cultives en France, Devauchelle N., Barret J., SalaunG.，(1997), DRV/RA/RST97-11, Ifremer Brest,217 M [8]。
[0060]根據本發明的一個具體實施方案，雜交可包括下述步驟:
[0061]a)提供抗所述病原體的地中海牡蠣食用牡蠣；
[0062]b)提供不抗所述病原體的非抗性牡蠣，其性別與所述抗性牡蠣食用牡蠣相反；
[0063]c)將所述牡蠣一起放入含水的池中，所述水具有能夠進行雜交的鹽度；
[0064]d)使所述牡蠣在所述池中成熟，其中為所述成熟提供逐漸增加的光周期和充足的食物供應；
[0065]e)使用應用于所述牡蠣的誘導劑來誘導雄配子排出；
[0066]f)用步驟e)中排出的雄配子使雌配子受精；[0067]g)孵育步驟f)中所得的幼體8~10天；
[0068]h)向步驟g)中所得的幼體喂食浮游植物，從而得到有眼幼體(eyed larvae)；
[0069]i)收集所得的有眼幼體；以及
[0070]j)將所述幼體固定于發育支持物(support de d6veloppement)上,從而得到至少一個抗所述病原體的牡蠣。
[0071]根據本發明的方法，步驟a)中提供的抗病原體的地中海牡蠣食用牡蠣是上文所述的抗性牡蠣。
[0072]根據本發明的方法，步驟b)中提供的不抗病原體的牡蠣是上文所述的非抗性牡蠣。
[0073]根據本發明的方法，步驟c)是將步驟a)中所得的至少一只牡蠣與步驟b)中所得的至少一只牡蠣一起放入池中。例如，可將步驟a)中所得的若干只牡蠣與步驟b)的一只牡蠣一起放入池中；反之亦然。也可以將步驟a)中所得的若干只牡蠣與步驟b)中所得的若干只牡販一起放入池中。
[0074]優選地，在本發明方法的步驟c)中，本發明方法步驟a)和b)中提供的所述牡蠣兩兩分離，即每個池中僅包含兩只牡蠣，一只對應于步驟a)中所得的牡蠣，另一只對應于步驟b)中提供的牡蠣。
[0075]本發明方法中所用的池可以是上文所述的池。
[0076]可通過上述實施手段進行步驟d)~i)。這些手段可適用于本發明方法的每個步驟。
[0077]根據本發明的方法，本發明方法步驟d)中實施的成熟可通過本領域技術人員公知的使牡蠣成熟的任何方法來進行。優選地，通過逐漸增加光周期來使牡蠣成熟。這種增加可進行I周至6個月，優選I個月至3個月。最小光照時間為I小時至12小時，最大光照時間可以為12小時至23小時。該成熟步驟可能在實施本發明方法的任意溫度下進行。優選地，所述成熟可通過逐漸升高溫度直至優選20~30°C的溫度來進行。優選地，所述成熟在20~30°C的溫度下進行。更具體地，對最終成熟溫度的選擇取決于雜交方法中使用的品系及其對成熟的響應。可根據待雜交的牡蠣來調節溫度。可通過控制生殖腺的成熟和配子形成來控制此步驟中牡蠣的應答。牡蠣具有不同的成熟期，從0(相當于性潛伏期)至4b (相當于配子排出期)。可利用本領域技術人員公知的方法來控制成熟，例如使用氯化鎂(MgCl2)觀察麻醉浴中的殼打開。在本發明的方法中，當牡蠣的生殖腺成熟度達到第3期時，認為牡販已成熟。
[0078]在該成熟步驟中，可通過本領域技術人員公知的任何合適方法進行食物供應。其可以是例如先前所定義的食物供應。其可以是例如單細胞藻類、浮游植物、水底細菌、食物微粒等。
[0079]在一個具體實施方案中，其中在成熟步驟中向所述池提供水循環，池與池之間的所述循環可以是隔離的。此外，隔離的水循環可避免池與池之間的水交換，從而避免物質(例如蛋白質和/或病原體和/或由飼養在其它池中的成熟牡蠣排出的化學物質)的交換。這些物質可能決定產卵牡蠣的性別。飼養在其它池中的成熟牡蠣所排出配子的交換是實施本發明所不期望的，其可導致姐妹品系之間的不期望的自受精。
[0080]根據本發 明，本發明方法步驟e)中所定義的配子排出的誘導優選地針對成熟牡蠣來進行，例如生殖腺成熟度為3期的牡蠣。這些成熟牡蠣可例如是在本發明方法步驟
d)中所得的牡蠣。本發明方法步驟e)中所用的誘導劑可以是本領域技術人員公知的任何誘導手段，例如，至少一種熱休克和/或至少一種蛋白質(例如激素、化學物質或神經遞質(例如5-羥色胺))。
[0081]優選地，所述誘導劑可以是一次或幾次熱休克。其相當于相繼降低和升高溫度，其中溫度變化適于本發明方法的實施。例如，最高溫度可以為25~55°C，最低溫度為5~20。。。
[0082]誘導(例如熱休克)首先使雄配子排出，這刺激雌配子產出。對雌配子排出的誘導是雄配子通過化學方式來實現的。其可以例如是激素或神經遞質(例如5-羥色胺)。
[0083]對雌配子排出的誘導也可以通過本領域技術人員公知的誘導雌配子排出的任何物質來進行。例如，化學物質、激素或神經遞質(例如5-羥色胺)，例如含雄配子的水、含有配子的過濾水和/或含有來自冷凍保藏的活性精子的稀釋介質。
[0084]在一個具體實施方案中，誘導牡蠣配子排出的步驟e)優選在不具有任何水循環的池中進行，以防止所述配子分散。在該情形中，如果在先前步驟中進行了水循環，則在該步驟e)中將水循環關閉。
[0085]在步驟e)的另一具體實施方案中，池與池之間的水循環也可以是隔離的，從而防止物質(例如激素或雄配子)分散到其它池中。
[0086]根據本發明的方法，步驟f)對應于用雄配子使雌配子受精，所述雄配子先前被所述雌性牡蠣過濾。受精發生在牡蠣的外套腔(cavit6 palleale)中。實施該步驟的手段可以是先前所述的手段或者本領域技術人員公知的任何手段。當然，這些手段優選地適于實現受精。
[0087]根據本發明的方法，幼體的孵育(例如步驟g)中所定義的)可優選地在牡蠣的外套腔中進行。在該幼體孵育步驟中，實施該步驟的手段可以是先前所述的手段或者本領域技術人員公知的任何其它手段。這些手段優選地適于實現此種孵育。該孵育步驟可進行8~10天。在該孵育步驟中，可例如用上文所述的浮游植物或任何其它合適的食物飼喂牡蠣和幼體。該孵育期之后，將所述幼體放入所述介質中。
[0088]根據本發明的方法，對應于誘導產卵、受精和幼體孵育的步驟e)~g)可以在體外、雌性外套腔外或者在體內雌性外套腔內進行。當步驟g)在體內進行時，即在雌性牡蠣的外套腔中進行，配子在雌性牡蠣的外套腔中被過濾、受精并孵育。以可在步驟g)中排出幼體的方式進行孵育。
[0089]在體外，可通過劃開生殖腺(“剝離”技術)獲得配子，這可以計劃并控制發育和受精的時期。
[0090]根據本發明的方法，步驟h)對應于飼喂步驟g)中排出到介質中的幼體，以獲得有眼幼體。能飼喂幼體的浮游植物(如上文所述)可以是本領域技術人員公知的能實施該步驟的任何浮游植物。用于實施該步驟的手段可以是先前所述的手段或者本領域技術人員公知的任何手段。這些手段優選地適于進行幼體飼喂。
[0091]根據本發明的方法，步驟i)對應于收集步驟h)中獲得的有眼幼體。有眼幼體的收集可例如在幼體排出后8~10天進行。收集有眼幼體的手段可以是本領域技術人員公知的任何手段，例如濾器、具有能收集幼體之直徑的孔的篩。例如，篩的網眼尺寸可以為10μ m~180 μ m,優選50 μ m~150 μ m。可根據所排出幼體的大小來選擇網眼尺寸，并且網眼尺寸必須小于所排出幼體的大小。
[0092]根據本發明的方法，步驟j)對應于將所述幼體固定于發育支持物上。所述固定可在如上所述的池中實施。用于該步驟的實施手段可以是上文所述的手段或者本領域技術人員公知的任何手段。這些手段優選地適于實施受精。所述池的壁上可包含相同的或不同的發育支持物。幼體發育支持物可以是能夠實現本發明方法的任何支持物。例如，所述發育支持物可以是微粉碎的牡蠣殼或蛘殼或者微粉碎的玻璃和/或所篩出的例如250 μ m~500 μ m的任意物質，其能使通過本發明方法獲得的幼體進行演替(prOC6d6)并且獲得游離的牡蠣苗。
[0093]固定步驟之后，牡蠣苗進行發育，從而獲得至少一個雜交牡蠣。用于實施該發育步驟的手段可以是先前所述的手段或者本領域技術人員公知的任何其它手段。這些手段優選地適于幼體發育。
[0094]根據本發明，可例如僅在一個繁殖季節進行雜交，例如在最初成熟當年的6個月期間。可選擇溫度和飼喂條件，從而使每只牡蠣在其最初成熟期間數次改變性別。所述牡蠣能以10~70天的間隔排出新配子。
[0095]有利地，在最初成熟當年實施本發明的方法可獲得質量最佳的配子和源于幼牡蠣的幼體。
[0096]根據本發明方法獲得的雜交牡蠣是“同胞兄弟(plein-fdres) ”類型，它們僅來源于具有特定遺傳多態性的親本，所述遺傳多態性是由通過雜合方式使它們獨特及互補的地理特征和生態特性結合起來而導致的。這種雜交和雜交體的形成可獲得具有抗病原體之特性的雜交體。
[0097]本發明方法的雜交不會在自然界中發生，更特別地，這是由牡蠣屬的繁殖生物學特性以及遺傳學上不同的野生型種群之間的地理距離所致。所述養殖系統通常僅使用Fl雜交體，這是因為，由于牡販特別容易發生近親退化(d6g6n6rescence consanguine),雜交特征在后代中很快丟失。因此，本發明的方法可獲得第一代抗性牡蠣。
[0098]抗性雜交牡蠣可在多種條件下生長。根據所獲得的雜交性能，它們可在親本的原始環境中生長。例如，科西嘉島抗性牡蠣食用牡蠣與來自大西洋的非抗性牡蠣雜交得到能在大西洋沿岸以及地中海沿岸生長的抗病原體的雜交體。本發明的這一方面相對于現有技術具有很大的優勢，已知所述抗性科西嘉島牡蠣不能在大西洋沿岸生長，因為科西嘉島牡販不適應例如潮汝現象，并因此不適應“浸沒和浮出(d’ immersion et d’ 6mersion) ”現象、介質(例如鹽度、溫度)改變。
[0099]通過雜交獲得的抗性牡蠣由于其抗性及其對介質的適應能力可降低成本并且顯著提高被病原體感染之牡蠣養殖場中的牡蠣產量。
[0100]利用本發明方法獲得的抗性牡蠣還具有適應天氣變化(例如培養介質溫度升高)的特性。
[0101]此外，與其來源的親本相比，雜交體每天生長可提高多達30 %。該方面增加了在牡蠣養殖場中利用所述抗性雜交體的意義。
[0102]這些通過雜交獲得的抗性牡蠣還可使被輸入性病原體感染的區域或者并非通過人為養殖受感染之牡蠣而感染的區域復原，以及能夠恢復海洋生態系統。[0103]這些通過雜交獲得的抗性牡蠣還可重新建立在牡蠣養殖場中生長的近親性(consanguinite)越來越嚴重的品系的生物多樣性。所述近親性是品系退化的根源以及牡蠣養殖場產率降低的原因。
[0104]牡蠣的近親性可導致牡蠣對病原體的抗性降低，這是因為從二十世紀二十年代以來已在牡蠣養殖場中觀察到動物流行病現象成倍增加[16]。
[0105]根據本發明獲得的抗性雜交牡蠣具有對本領域技術人員而言公知的病毒性、細菌性和/或寄生蟲性病原體的抗性增強。抗性增強可以是例如細胞和體液免疫應答提高，就血細胞防御而言尤為如此。這些性質可例如由雜合性引起的遺傳多樣性而導致[15]。
[0106]根據本發明獲得的抗性雜交牡蠣可解決牡蠣養殖場中反復性的動物流行病問題，例如由于水溫升高引起的動物流行病或者由于I型牡蠣皰疹病毒(OsHV-1)引起的動物流行病。事實上，與近親牡蠣相比，根據本發明方法獲得的牡蠣的遺傳多樣性使得它們適應性更強(rUSticit6)并且具有更高的免疫力，從而可抵抗由于環境改變以及更特別地由于天氣變化而引起的偶發性感染[10]。
[0107]對于本領域技術人員而言，通過閱讀下文中作為示例給出的實施例，其它優點也將顯現。
[0108]實施例
[0109]實施例1:來自科西嘉島黛安娜湖的抗性牡蠣食用牡蠣
[0110]從黛安娜湖(普遍認為該湖從二十世紀八十年代起被寄生蟲牡蠣包拉米蟲和馬泰氏孢子蟲污染)收集野生型牡蠣，在孵化場所中成功繁殖。生長至0.2g的牡蠣苗可在該湖中獲得良好品質的實驗產量。從該成功可得出以下結論:
[0111]-在被牡蠣包拉米蟲和馬泰氏孢子蟲污染的區域中不存在市場規模(tailledecommercialisation)的發病,這表明平牡販食用牡販的科西嘉島品系特有的遺傳多態性具有針對寄生蟲病的抗性。
[0112]-在第18個月獲得了第一批大小為n°1~n° O的0.2g的牡蠣苗，表明科西嘉島品系具有高生長潛力。與大西洋中Belon平牡蠣的生長周期相比，科西嘉島品系的生長周期縮短了超過50%。
[0113]-狀態指數(indicede condition)是16% (可食用肉的重量相比于總重量)，這高于南布列塔尼的Belon牡蠣的狀態指數。味覺滿意度測試證實了科西嘉島品系具有從商業角度看的優異品質。
[0114]然后，測試了所述品系的健康狀態以及對病原體的抗性。這些測試根據
0.1.E.(世界動物衛生組織(Organisation Mondiale de la Sante Animale),針對包拉米蟲病和馬泰氏孢子蟲病)的方案進行:
[0115]-利用顯微鏡對心室和腿的組織照片(empreintetissulaire)進行細胞學檢查:著色后，未觀察到血細胞內存在2~5 μ m的小的球形或卵形生物(包拉米蟲)。
[0116]-利用顯微鏡對腮、消化腺、經固定并著色的生殖腺的組織樣品進行組織病理學檢查。未觀察到游離狀態的或血細胞內的2~5 μ m的寄生蟲細胞(包拉米蟲)。未觀察消化腺異常，也未觀察到表明馬泰氏孢子蟲存在的20~30 μ m的球形生物。
[0117]-使用單克隆抗體免疫熒光技術的檢測表明科西嘉島品系對存在于自然環境中的寄生蟲包拉米蟲和馬泰氏孢子蟲具有抗性。[0118]-聚合酶鏈式反應(PCR):利用靶向馬泰氏孢子蟲ITSl區域的特異性DNA探針，未檢測到該寄生蟲。
[0119]-PCR-RFLP分析(限制性片段長度多態性):從牡蠣組織中提取的、靶向寄生蟲牡蠣包拉米蟲特征性片段SSU rDNA的DNA為陰性結果，表明科西嘉島品系中不存在污染。
[0120]-分子原位雜交技術(ISH):將牡蠣包拉米蟲之片段SSUrDNA的DNA特異性探針和馬泰氏孢子蟲之片段ITSl的DNA特異性探針與牡蠣組織的組織學樣品接觸。利用顯微鏡觀察得到的陰性結果表明，科西嘉島品系的組織中不存在牡蠣包拉米蟲和馬泰氏孢子蟲。這一研究顯示，來自黛安娜湖的平牡蠣野生種群在該自然環境下與牡蠣包拉米蟲和馬泰氏孢子蟲接觸后，不被這些寄生蟲所感染。
[0121]將這些寄生蟲進行人工接種測試。
[0122]-將來自科西嘉島的平牡蠣與被牡蠣包拉米蟲嚴重污染的牡蠣一起限制于池中數月。所述牡蠣沒有發生疾病，并且對上述檢測試驗呈陰性。
[0123]-將含有5X IO6個活寄生蟲牡蠣包拉米蟲(根據Mialhe等人(1988)的方法進行分離)的50 μ I過濾海水注射到科西嘉島牡蠣的外套腔中。預先在3.5% MgCl2-6H20溶液中對牡蠣進行麻醉浴，以使其打開殼。
[0124]將污染劑量的接種體注射到外套腔中后，將牡蠣在水外保持I小時，然后放回充滿海水的培養池中，其中通過吹泡向所述海水充氣。培養I個月后，未觀察到死亡，并且所述牡蠣對上文所述的牡蠣包拉米蟲檢測試驗呈陰性。在缺乏直接水平傳遞該寄生蟲的情況下，通過浸浴或 通過注射進外套腔的該實驗性感染技術不能用于測試針對馬泰氏孢子蟲的抗性。
[0125]這些實驗表明，來自科西嘉島和撒丁島(更特別地來自黛安娜湖、烏爾比諾湖、波爾圖維基奧海灣和Santa Manza海灣、撒丁島潟湖)的野生型平牡蠣能100%抵抗寄生蟲牡蠣包拉米蟲(一種單孢子蟲家族的原生動物)。這些實驗與現有的以下科學知識是非常矛盾的:食用牡蠣的本地品系會被原生動物引起的疾病大量殺死，這種錯誤的記載可見于文獻(MINICONI R.，2000，Les fruits de mer des cfitCS de Corse, Editions AlainPiazzola, P.90[9])中，其實際上是指從大西洋輸入的無抗性和/或被感染的牡蠣苗試驗培養物。
[0126]對來自科西嘉島的平牡蠣進行的所有研究的交叉驗證表明，野生型品系對啟動雙殼類動物之細胞免疫(血細胞)和體液免疫一般機制的單孢子蟲、原生動物、馬泰氏孢子蟲(martelias)、寄生蟲、機會性致病病原體以及外部污染物具有抗性，其免疫系統是非獲得性的，即無任何免疫記憶。
[0127]根據前述方案測試了來自地中海的其它野生型平牡蠣種群，結果顯示所有種群都能抵抗寄生蟲牡蠣包拉米蟲和馬泰氏孢子蟲。這涉及了來自科西嘉島、摩洛哥(納多爾潟湖)、突尼斯(加貝斯海灣)、利比亞(鄰接突尼斯邊界和希臘的潟湖)的野生型種群。
[0128]實施例2:來自科西嘉島黛安娜湖的抗性牡蠣食用牡蠣
[0129]從黛安娜湖(該區域被病原體牡蠣包拉米蟲和馬泰氏孢子蟲污染)收集野生型牡蠣，在孵化場所中繁殖。所述野生型牡蠣直接取自天然場所，并且對病原體具有抗性。
[0130]所取野生型牡蠣的直徑大于60mm，并且處于第一繁殖期。
[0131]一經取得樣品，便將牡蠣置于容積為20L、充滿20L海水的容器中并送至孵化場所，所述海水的鹽度為37%。，溫度為13°C，pH為8.1。在進行包裝之前，使用環氧樹脂膠粘貼的標簽對所得牡蠣進行標記。
[0132]實施例3:非抗性牡蠣
[0133]在該實施例中，從天然收集物中選擇Belon品質的未成熟牡販(“Quiberon”品系，南布列塔尼)，其大小為60mm。用于實施本發明方法的牡蠣是未表現出發病的牡蠣。
[0134]實施例4:用于受精的牡蠣的成熟
[0135]在對實施例2和3中待雜交的牡蠣取樣之后，將它們分離并兩兩組合，這意味著敏感型牡蠣與抗性牡蠣相組合。從而組成20對。然后將所述配對置于20個預先充滿的池中，每個池的單元容積為20L。每個池預先充滿20升鹽度為37%。的海水。水的pH為8.1。水的初始溫度為13°C，并在2周內升至20°C。通過泵系統向每個池的水中充氧氣，氣流速度為20L/小時。[0136]在成熟期間，通過封閉水循環來供水，并且每個池的水循環是隔離的。在整個成熟期間，水的物理化學特性保持恒定。
[0137]通過將光周期從9小時提高到15小時，并且將水溫逐漸升高至20~30°C，經15~90天使牡販成熟。
[0138]在該成熟期中，通過向介質中添加來源于孵化場所的單細胞藻類品系金藻、中肋骨條藻、路氏杷夫藻、鈣質角毛藻或者來自SATMAR公司之冷凍濃縮糊來提供食物。隨意供應食物，一日三次，只要觀察到牡蠣進食即可。通過添加有機物質(更特別地來源于幼魚飼養池的廢棄物)來同時補充食物供應。
[0139]利用本領域技術人員公知的技術在使用氯化鎂(MgCl2)的麻醉浴中通過觀察生殖腺成熟期來檢查成熟度。Gagnaire B., 2005, “Etude des effets de polluants surIes parametres hemocytaires de FHUltre creuse Crassostrea gigas—Interactionsentre environnement, mecanismes de defense, et maladies infectieuses，，，f専dri侖文，La Rochelle University,412 頁[10]。
[0140]當生殖腺成熟度達到3期時，就誘導配子產生而言，牡蠣是成熟的。
[0141]實施例5:誘導配子排出和配子受精
[0142]對根據實施例4已成熟的牡蠣進行誘導配子排出。
[0143]利用與實施例4同樣的條件、手段和同樣的牡蠣對進行誘導配子排出。
[0144]在誘導之前，停止水循環以避免配子在培養介質中分散。
[0145]通過熱休克來誘導配子排出。溫度在最低值23~30°C和最高值30~37°C之間交替降低和升高4~7°C。
[0146]雄性首先產生配子，其通過化學方式誘導雌性牡蠣的雌配子排出。
[0147]釋放在介質中的精子被雌性過濾。受精發生在其外套腔中，在所述外套腔中孵育幼體8~10天，然后幼體被排出。每只雌性排出以百萬計之數量的幼體。
[0148]在外套腔中孵育幼體的步驟期間，再次使水循環起來。用浮游植物飼喂幼體。用于飼喂所述幼體的浮游植物由來源于孵化場所以外的池中培養物(cultures en masse)的金藻、路氏杷夫藻、Chaetoceros forma pumilum組成；必要時,補充來自SATMAR公司的藻類濃縮糊。對于第一階段的幼體而言，所用浮游植物的尺寸為20~40 μ m ;對于成體階段變形后而言，所用浮游植物的尺寸為50~200 μ m。每天向介質中隨意添加浮游植物，同時在進食過程中中止水循環來觀察池中的食物循環。
[0149]實施例6:幼體的收集和固定
[0150]通過篩來收集實施例5的介質中排出的幼體。所述幼體的收集和固定條件與實施例3中的相同。所用篩的直徑為120μπι。使用篩可收集培養介質中存在的幼體。依據它們的親本，將它們歸類到同源批次中。在池中進行分組，所述池的底部覆蓋有微粉碎的牡蠣殼和蛘殼，通過250 μ m~500 μ m的篩來標定所述殼。
[0151]所述池的容積為2~5m3。所述池內充滿鹽度37%。、pH8.2、溫度20~25°C的水。用泵以2~5m3/小時的氣流速度向封閉循環中的池充氧。孵育8~10天后，將幼體固定在發育支持物上。固定幼體的方法是用于將幼體固定在支持物上的常規方法，更特別地是描述于 IFREMER 的技術文獻(Ifremer, 2007, Datasheet on aquaculture, 2007 年 3 月 17 日，
iiLes ecloseries:cas de V\\nitre creuse，，[ll])中的方法以及Helm，M.M.,Bourne,N.，Lovatelli,A., (comp./ed.)Ecloseries de bivalves,Un manuel pratique.FAO documenttechnique sur Ies plches No471.Rome, FA0.2006.184 頁[12]的方法。
[0152]實施例7:抗性和非抗性牡蠣
[0153]下文表中示出用于本發明方法的抗性和非抗性牡蠣的其它實例。
[0154]表1:抗性地中海牡蠣食用牡蠣
[0155]表2:抗性地中海牡蠣食用牡蠣
[0156]表3:非抗性地中海牡蠣食用牡蠣
[0157]表4:非抗性牡蠣食用牡蠣
[0158]表5:其它非抗性牡蠣
[0159]表1:抗性地中海牡蠣食用牡蠣
[0160]
【權利要求】
1.獲得抗病原體之牡蠣的方法，其特征在于包括將抗所述病原體的地中海牡蠣食用牡販(Ostrea edulis)與異性非抗性牡販雜交。
2.根據權利要求1的方法,其中所述病原體選自細菌、寄生蟲和病毒。
3.根據權利要求1-2中任一項的方法，其中所述非抗性牡蠣選自以下物種:食用牡蟲厲(Ostrea edulis)、扁牡蟲厲(Ostrea angasi)、奧林匹亞牡蟲厲(Ostrea conchaphila)、淺黃牡販(Ostrea Iuridea)、密鱗牡販(Ostrea denselamellosa)、Ostrea puelchana、葉片牡蟲厲(Ostreafolium)、Ostrea stentina、智利平牡販(Tiostrea chilensis)、美洲牡蟲厲(Crassostera virginica)、巨牡販(Crassostera gasar)和紅樹牡販(CrassostreaRhizophorae)。
4.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述病原體引起選自以下的疾病:包拉米蟲病、馬泰氏孢子蟲病、單孢子蟲病、小紅細胞癥、派琴蟲病和/或irivovirose。
5.根據權利要求1-3中任一項的方法，其中所述病原體引起包拉米蟲病和/或馬泰氏孢子蟲病。
6.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述雜交包括下述步驟: a)提供抗所述病原體的地中海牡蠣食用牡蠣； b)提供不抗所述病原體的非抗性牡蠣，其性別與所述抗性牡蠣食用牡蠣相反； c)將所述牡蠣一起放入含水的池中，所述水具有能夠進行雜交的鹽度； d)使所述牡蠣在所述池中成熟，其中為所述成熟提供逐漸增加的光周期和充足的食物供應； e)使用應用于所述牡蠣的誘導劑來誘導雄配子排出； f)用步驟e)中排出的雄配子使雌配子受精； g)孵育幼體8~10天； h)向步驟g)中所得的幼體喂食浮游植物，從而得到有眼幼體； i)收集所得的有眼幼體；以及 j)將所述幼體固定于發育支持物上，從而得到至少一個抗所述病原體的牡蠣。
7.根據權利要求6的方法，其中所述步驟e)至g)在體外進行，通過劃開生殖腺獲得所述配子。
8.根據權利要求6的方法，其中所述步驟e)至g)在體內進行，使步驟e)中排出配子受精的步驟f)在配子于雌性牡蠣外套腔中過濾后進行，步驟g)的孵育在雌性牡蠣外套腔中進行從而實現幼體排出。
9.根據權利要求6-8中任一項的方法，其中向所述池連續供應所述水循環，其中對于實施步驟e)而言，所述水循環關閉。
10.根據權利要求9的方法，其中所述水循環是隔離的。
11.根據權利要求6-10中任一項的方法，其中所述步驟d)的成熟在20~30°C之間的溫度下進行。
12.根據權利要求6-11中任一項的方法，其中所述池是孵化池。
13.根據權利要求6-12中任一項的方法，其中例如步驟e)中所定義的誘導手段是熱休克和/或至少一種蛋白質。
14.根據權利要求13的方法，其中所述熱休克通過相繼降低和升高溫度至5~55°C之間來進行。
15.根據權利要求6-14中任一項的方法，其中所述食物供應由孵化場所中生長的活的單細胞藻類組成。
16.根據權利要求15的方法,其中所述單細胞藻類選自金藻(Isochrysisgalabana)、中肋骨條藻(Skeletonema costanum)、路氏杷夫藻(Pavlova lutheri)、鈣質角毛藻(Chaetoceros calcitrans)、扁藻(Tetraselmis sp.)。
17.根據權利要求6-16中任一項的方法，其中步驟i)在幼體排出后8~10天進行。
18.根據權利要求6-17中任一項的方法，其中步驟i)的發育支持物選自250μm~500 μ m的微粉碎的殼和/或過篩材料。
19.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述抗性牡蠣食用牡蠣具有適于雜交的碳水化合物儲備物質水平。
20.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述地中海抗性牡蠣食用牡蠣處于第一繁殖期且直徑大于60mm。
21.根據前述權利要求中任一項的方法，其中在性潛伏期之后選擇所述抗性牡蠣食用牡蠣和所述非抗性牡蠣。
22.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述雜交僅在一個養殖季節進行。
23.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述非抗性牡蠣是來自大西洋、太平洋或印度洋的牡蠣品系。
24.根據權利要求1-23中任一項的方法獲得的牡蠣。
【文檔編號】A01K61/00GK103891646SQ201310741384
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2008年8月12日 優先權日:2007年8月14日
【發明者】居伊·勒布倫 申請人:居伊·勒布倫