一種富集培養滑刃屬食真菌線蟲的方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，具體為一種富集培養滑刃屬食真菌線蟲的方法。具體包括：（1）滑刃屬食真菌線蟲的分離；（2）滑刃屬食真菌線蟲的鑒定；（3）滑刃屬食真菌線蟲的表面消毒；（4）滑刃屬食真菌線蟲的富集培養。本發明的方法簡單易行，滑刃屬食真菌線蟲繁殖成活率高，線蟲個體質量好，遺傳性變化小，管理方便，可以有效獲得大量純培養的滑刃屬食真菌線蟲，為研究滑刃屬食真菌線蟲在整個土壤食物鏈的關鍵作用及其與真菌的相互作用對植物生長的影響提供技術支持。
【專利說明】一種富集培養滑刃屬食真菌線蟲的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種土壤滑刃屬食真菌線蟲的富集培養方法。
【背景技術】
[0002]土壤中棲居的線蟲以自由生活線蟲占絕對優勢，而土壤自由生活線蟲又以食細菌線蟲和食真菌線蟲為主(兩者統稱為食微線蟲),約占自由生活線蟲的80%。很多研究表明，食微線蟲通過捕食土壤微生物，加速微生物繁殖，并通過代謝分泌和釋放微生物所固持的養分，進而影響土壤生態過程和植物生長。但這種作用會因不同的線蟲、微生物和植物的種類以及土壤基質的C/N營養狀況而異。目前，關于土壤食真菌線蟲與真菌的相互作用及其對植物生長的報道較少，尤其是污染土壤中的相關研究更是罕見報導。該類研究可以深入研究土壤食真菌線蟲的取食習性及其取食行為在土壤食物鏈和整個土壤養分循環中的重要地位，而純培養的土壤食真菌線蟲是研究的基礎。諸多研究表明滑刃屬食真菌線蟲(.Aphelenchoidessp.)對土壤污染具有較強的耐性,廣泛存在于各類污染土壤中,對其深入研究具有重大的意義。但是，目前鮮有關于土壤食真菌線蟲尤其是滑刃屬食真菌線蟲的富集培養方法。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于提供一種富集培養滑刃屬食真菌線蟲iAphelenchoides%.)的方法，該方法簡單易用， 滑刃屬食真菌線蟲的繁殖率高，可為高效制備大量純培養的滑刃屬食真菌線蟲提供技術保障。
[0004]本發明提供的一種富集培養滑刃屬食真菌線蟲的方法，具體步驟如下:
1、滑刃屬食真菌線蟲)的分離:從野外采集新鮮土壤。采用改進的淺盤法從土壤中分離線蟲。
[0005]2、滑刃屬食真菌線蟲)的鑒定:將燒杯中液體轉入培養皿，然后根據滑刃屬食真菌線蟲的特征在解剖鏡下用毛細管挑出該屬線蟲，再將其在光學顯微鏡下進行活體鑒定。
[0006]3、滑刃屬食真菌線蟲)的表面消毒:將線蟲轉入滅菌的離心管中，用硫酸鏈霉素和放線菌酮混合液對線蟲進行表面消毒；
4、滑刃屬食真菌線蟲)的富集培養:將真菌灰葡萄孢cinerea Pers.)接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，采用封口膜(Parafilm)將培養皿封口，以防止培養基水分蒸發與污染。然后將培養皿倒置放于恒溫培養箱，20-25°C黑暗培養，一周后，待灰葡萄孢大量繁殖時即將滑刃屬線蟲接入長滿均勻一致灰葡萄孢的培養皿中。采用封口膜(Parafilm)將培養皿封口，培養皿正面朝上放入大小合適的滅菌整理箱內，20-25°C黑暗培養，定期觀察培養皿是否受到其他真菌或者螨蟲的污染，幾個星期后，灰孢基本消失，線蟲大量繁殖。重復以上步驟可獲得大量的滑刃屬食真菌線蟲。其中，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的配方為:每1000 ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，土豆190-220 g，葡萄糖18-20 g，瓊脂15-20 g，其余為水，pH值自然。
[0007]上述步驟(1)所述的改進的淺盤法所需設備簡單，操作易行，具體如下:將10目的不銹鋼篩盤放入配套的淺盤中，在篩盤上放置兩層面巾紙，然后把土樣均勻鋪在紙上，往淺盤中加水直至浸沒土壤。再置于25°C溫度、黑暗條件下分離。48 h后，用400目篩收集線蟲于燒杯中。靜置過夜后，用真空泵緩慢吸取上層液體，盡量避免擾動下層液體。此時，下層液體聚集了大量的線蟲。
[0008]上述步驟(2)中滑刃屬食真菌線蟲的主要鑒定特征如下:①熱殺死后，雌蟲蟲體直到腹彎，雄蟲通常尾部向腹部彎成鉤狀整個蟲體呈“ J”形(如果活體無法鑒定，可將其殺死后確定，為活體鑒定提供參考)，活體線蟲多呈“S”形；②頭部通常略縊縮，頭架骨軟化，口針較細，基部膨大，長度通常為10-12 Mm，一般不超過20 Mm ;③食道前體部圓柱形，中食道球發達、卵圓形或者方圓形，中食道球瓣發達，后食道腺葉發達、覆蓋腸的背面；④排泄孔位于中食道球后水平處；⑤雌蟲尾呈圓錐形，尾端形態多樣:鈍圓或細圓，指狀或分叉或有一腹突，有或無尾尖突，尾尖突的形態多樣；⑥雄蟲尾呈圓錐形、向腹面彎成鉤狀；交合刺呈玫瑰刺形，基頂和基喙通常發達，無交合傘。
[0009]上述步驟(3)中，所述混合液中，硫酸鏈霉素的質量-體積濃度為0.80-1.20g.L-1 ;放線菌酮的質量體積濃度為0.015-0.02 g.L-1 ;對線蟲進行表面消毒的時間為15-20min。
[0010]本發明中，步驟(4)中的經滅菌的培養基是將培養基在高壓滅菌鍋中，121°C溫度下滅菌30 min得到。其富集培養后得到的滑刃屬食真菌線蟲的保存方法如下:采用封口膜(Parafilm)將培養皿封口，然后將培養皿保存在4°C冰箱內備用。每隔5_6個月，對滑刃屬食真菌線蟲進行繼代培養，時間過長則培養基水分蒸發以及食物資源的匱乏，線蟲會死亡，時間過短則是財力和勞力的浪費。其具體操作過程為，將培養皿從4°C冰箱取出，挑出一小塊長有線蟲的培養基，放入長滿均勻一致灰葡萄孢的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，將培養皿封口后放入大小合適的滅菌整理箱內，20-25°C黑暗培養，并定期觀察培養皿是否受到其他真菌或者螨蟲的污染，三周后將培養皿至于4°C冰箱內保存。
[0011]本發明的有益效果在于:其方法簡單易行，滑刃屬食真菌線蟲繁殖成活率高，線蟲個體質量好，遺傳性變化小，管理方便，可以有效獲得大量純培養的滑刃屬食真菌線蟲，為研究土壤中食真菌線蟲的取食行為以及整個土壤食物鏈提供技術支持。此外，滑刃屬食真菌線蟲在污染土壤中占有優勢，可利用其對真菌菌絲的取食行為，加速污染土壤中固執在菌絲或孢子內養分的礦化釋放，從而在農業生產上可以促進污染土壤中植物的生長，在污染土壤的修復方面則可以提高植物修復效率。
【具體實施方式】
[0012]下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0013]實施例1
1、滑刃屬食真菌線蟲的分離:從江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園)苗圃地采集新鮮土壤。采用改進的淺盤法從土壤中分離線蟲。具體方法描述如下。
[0014]將10目的不銹鋼篩盤放入配套的淺盤中，并在篩盤上放置兩層面巾紙，然后把土樣均勻鋪撒在紙上，往淺盤中加水直至浸沒土壤。將整個裝置放于培養箱中，在20~25°C溫度、黑暗條件下分離。由于線蟲的趨水性，再加上其自身重力的作用，線蟲陸續脫離土壤穿過面巾紙孔隙進入水中(適用于分離土樣中的活躍線蟲)。48-60 h后，將篩盤取出，將淺盤中的液體倒入400目篩盤，不斷用水沖洗篩盤后收集線蟲于燒杯中。燒杯靜置過夜后，用真空泵緩慢吸取上層液體，并盡量避免擾動下層液體。此時，下層液體聚集了大量的線蟲。
[0015]2、滑刃屬食真菌線蟲的鑒定
目前鮮有食真菌線蟲，尤其是滑刃屬食真菌線蟲純培養的報道，難點之一也在于線蟲的鑒定，特別是富集培養過程中，需要將線蟲活體鑒定；鑒定方法具體如下:將燒杯中液體轉入直徑5 cm的培養皿。靜置5 min后，根據滑刃屬線蟲的形態學特征在解剖鏡下用毛細管挑出該屬線蟲，然后將其在奧林巴斯光學顯微鏡下活體鑒定。
[0016]鑒定滑刃屬食真菌線蟲時依據的主要鑒定特征如下:①熱殺死后,雌蟲蟲體直到腹彎，雄蟲通常尾部向腹部彎成鉤狀整個蟲體呈“J”形，活體線蟲多呈“S”形；(如果活體無法鑒定，可將其殺死后確定，為活體鑒定提供參考)，②頭部通常略縊縮，頭架骨軟化，口針較細，基部膨大，長度通常為10-12 Mm，一般不超過20 Mm ;③食道前體部圓柱形，中食道球發達、卵圓形或者方圓形，中食道球瓣發達，后食道腺葉發達、覆蓋腸的背面；④排泄孔位于中食道球后水平處；⑤雌蟲尾呈圓錐形，尾端形態多樣:鈍圓或細圓，指狀或分叉或有一腹突，有或無尾尖突，尾尖突的形態多樣；⑥雄蟲尾呈圓錐形、向腹面彎成鉤狀；交合刺呈玫瑰刺形，基頂和基喙通常發達，無交合傘。
[0017]3、滑刃屬食真菌線蟲的表面消毒:將線蟲轉入滅菌的50 ml離心管中，用質量-體積濃度為1.0 g L—1的硫酸鏈霉素和質量-體積濃度為0.02 g L—1的放線菌酮混合液對線蟲進行表面消毒20 min, 5000 r mirT1離心5 min,除去上清液,再用無菌水反復清洗6次。每次清洗時充分震蕩，5000 r mirT1離心5 min,棄去上清液。
[0018]4、滑刃屬食真菌線蟲的富集培養:食真菌線蟲在土壤中主要以取食真菌為生，因而在純培養過程中需要給其提 供合適的食物來源。真菌種類不正確，則滑刃屬食真菌線蟲不愿取食，線蟲大量死亡；培養基類型和配方不正確，則真菌繁殖欠佳導致滑刃屬食真菌線蟲不能正常生長繁殖；培養溫度、光照等條件不正確，則真菌顏色發黃、生長緩慢、易衰老，線蟲不易取食；線蟲接種到培養基上的時機不正確，則影響線蟲食物來源的數量與質量；發明人對真菌的種類，培養基的類型和配方以及培養條件等進行了一系列的摸索。確定方法如下。
[0019]采用常規方法制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，其培養基配方為:每1000 ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，土豆220 g,葡萄糖18 g,瓊脂18 g,其余為水，pH值自然。培養基配好后，在高壓滅菌鍋中121°C滅菌30 min。待培養基冷卻后，將其倒入直徑為9 cm的培養皿,厚度為0.7- 1.0 cm ο將真菌灰葡萄孢cinerea Pers.)接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，采用封口膜(Parafilm)將培養皿封口，以防止培養基水分蒸發與污染，然后將培養皿倒置放于恒溫培養箱，20-25°C黑暗培養，一周后，真菌大量繁殖。此時，將滑刃屬線蟲接入長滿均勻一致灰葡萄孢的培養皿中，接種方法為，用吸管接種50-100 μ?無菌水于培養基表面，無菌水中包含有200條左右經表面消毒的食真菌線蟲。將培養皿采用封口膜(Parafilm)封口，以防止培養基水分蒸發與污染。以上過程均在無菌操作臺上進行。最后，將培養皿正面朝上放入合適大小的滅菌整理箱，然后置于培養箱，20-25°C黑暗培養，三個星期后，灰葡萄孢基本消失，線蟲大量繁殖。每個培養皿滑刃屬食真菌線蟲數量約為12000條，繁殖率約為60倍，個體長約0.75 mm，體長/最大體寬約為35.6，口針長約為11.2 μιη0
[0020]挑出一小塊長有線蟲的培養基，放入長滿均勻一致灰葡萄孢的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，將滑刃屬食真菌線蟲進行擴繁，如此重復獲得大量純培養的滑刃屬食真菌線蟲。
[0021]實施例中，滑刃屬食真菌線蟲的富集培養時，還采用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基配方包括:每1000 ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，土豆190 g，葡萄糖19 g，瓊脂19 g，其余為水，pH值自然。通過上述配方也獲得滑刃屬食真菌線蟲；此配方下，每個培養皿線蟲數量約為11000條，繁殖率約為55倍，個體長約0.68 mm，體長/最大體寬約為36.2，口針長約為 11.0 Mm。
[0022]另外還采用如下配方:每1000 ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，其余為水，pH值自然。通過上述配方也獲得滑刃屬食真菌線蟲，此配方下，每個培養皿線蟲數量約為12500條，繁殖率約為62.5倍，個體長約0.70 mm,體長/最大體寬約35.2，口針長約10.8 Mm。
[0023]上述配方條件下均獲得了大量純培養的滑刃屬食真菌線蟲。
[0024]5、滑刃屬食真菌線蟲的繼代保存:線蟲的繁殖速度較快，每2周產生一代，在此過程中消耗大量的真菌菌絲與孢子，此外培養基的養分與水分也有一定的期限，因而線蟲的保存時間也是一個難點。本發明所涉及的保存方法如下。采用封口膜(Parafilm)將培養皿封口，然后將培養皿正面朝上保存在4°C冰箱內備用。每隔5-6個月，對滑刃屬食真菌線蟲進行繼代培養，具體操作過程為，將培養皿從4°C冰箱取出，挑出一小塊長有線蟲的培養基，放入長滿均勻一致灰葡萄孢 的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，將培養皿封口后正面朝上放入大小合適的滅菌整理箱內，25°C黑暗培養，并定期觀察培養皿是否受到其他真菌或者螨蟲的污染，三周后將培養皿至于4°C冰箱內保存。
[0025]6、滑刃屬食真菌線蟲的應用:將培養皿從4°C冰箱取出，用消毒的牛角勺將培養皿內培養基刮出，放入篩盤內，依次進行線蟲的分離和表面消毒步驟獲得大量純培養的滑刃屬食真菌線蟲。
[0026]將滑刃屬食真菌線蟲與叢枝菌根真菌同時接種入砷污染土壤，研究滑刃屬食真菌線蟲與叢枝菌根真菌的相互作用以及對煙草生長的影響。
[0027]結果表明，雙接種后，滑刃屬食真菌線蟲數量增加了 1110%，叢枝菌根真菌的菌絲量提高了 25%，菌根侵染率也有一定數量的提高；與不接種滑刃屬食真菌線蟲與叢枝菌根真菌的處理對照相比，滑刃屬食真菌線蟲與叢枝菌根真菌的相互作用顯著提高砷污染土壤中煙草的生物量(地下部分干重提高了 40%，地上部分干重提高了 66%)以及體內的砷累積量(地上部分砷累積量提高了 16%)。說明滑刃屬食真菌線蟲在As污染土壤中有優勢，促進污染土壤中植物的生長，將其應用于在污染土壤的修復方面時，則可以提高植物修復效率。
【權利要求】
1.一種富集培養滑刃屬食真菌線蟲的方法，其特征在于，具體步驟如下:(1)滑刃屬食真菌線蟲的分離:從野外采集新鮮土壤，采用改進的淺盤法從土壤中分離線蟲；(2)滑刃屬食真菌線蟲的鑒定:根據滑刃屬食真菌線蟲的特征，在解剖鏡下用毛細管挑出該屬線蟲，再將其在光學顯微鏡下進行活體鑒定；(3)滑刃屬食真菌線蟲的表面消毒:將線蟲轉入滅菌的離心管中，用硫酸鏈霉素和放線菌酮混合液對線蟲進行表面消毒；(4)滑刃屬食真菌線蟲的富集培養:將真菌灰葡萄孢cinereaPers.)接種到經滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，采用封口膜將培養皿封口，然后將培養皿倒置放于恒溫培養箱內，20-25°C黑暗培養；一周后，待真菌大量繁殖時即將滑刃屬線蟲接入長滿均勻一致灰葡萄孢的培養皿中；培養皿用封口膜封口后，置于滅菌整理箱內，20-25 V黑暗培養，定期觀察，直至灰孢基本消失，線蟲大量繁殖；重復以上步驟獲得大量的滑刃屬食真菌線蟲；其中，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的配方為:每1000 ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，土豆190-220 g，葡萄糖18-20 g，瓊脂15-20 g，其余為水，pH值自然。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中所述改進的淺盤法具體如下:將10目的不銹鋼篩盤放入配套的淺盤中，在篩盤上放置兩層面巾紙，然后把土樣均勻鋪在紙上，往淺盤中加水直至浸沒土壤；再置于20-25°C溫度、黑暗條件下分離；48-60 h后，用400目篩收集線蟲于燒杯中；靜置過夜后，用真空泵緩慢吸取上層液體，并盡量避免擾動下層液體，此時，下層液體收集到線蟲。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述混合液中，硫酸鏈霉素的質量-體積濃度為0.80-1.20 g.L—1 ;放線菌酮的質量-體積濃度為0.015-0.02 g.L—1 ;對線蟲進行表面消毒的時間為15-20 min。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中鑒定滑刃屬食真菌線蟲，其依據的鑒定特征如下:①熱殺死后，雌蟲蟲體直到腹彎，雄蟲通常尾部向腹部彎成鉤狀整個蟲體呈“J”形，活體線蟲多呈“S”形；②頭部通常略縊縮，頭架骨軟化，口針較細，基部膨大，長度通常為10-12 Mm，一般不超過20 Mm ;③食道前體部圓柱形，中食道球發達、卵圓形或者方圓形，中食道球瓣發達，后食道腺葉發達、覆蓋腸的背面；④排泄孔位于中食道球后水平處；⑤雌蟲尾呈圓錐形，尾端形態多樣:鈍圓或細圓，指狀或分叉或有一腹突，有或無尾尖突，尾尖突的形態多樣；⑥雄蟲尾呈圓錐形、向腹面彎成鉤狀；交合刺呈玫瑰刺形，基頂和基喙通常發達，無交合傘。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的經滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基是將培養基在高壓滅菌鍋中，121 °C溫度下，滅菌30 min得到的。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)富集培養后得到的滑刃屬食真菌線蟲的保存方法如下:將其置于培養皿中，封口后正面朝上置于4°C冰箱內保存；每隔5-6個月，將滑刃屬食真菌線蟲繼代培養；具體操作過程為，將培養皿從4°C冰箱取出，挑出一小塊長有線蟲的培養基，放入長滿均勻一致灰葡萄孢的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，將培養皿封口后放入滅菌整理箱內，20-25°C黑暗培養，并定期觀察，三周后將培養皿至于4°C冰箱內保存。
【文檔編號】A01K67/033GK103688908SQ201310696738
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】華建峰, 殷云龍 申請人:江蘇省中國科學院植物研究所