以花絲為外植體誘導萱草紅朗姆愈傷組織的方法
【專利摘要】本發明提供一種以花絲為外植體誘導萱草‘Red?Rum’愈傷組織的方法，包括外植體的采集與滅菌、花絲的獲得與接種、愈傷組織的誘導培養、繼代增殖培養和生根培養的步驟。本發明解決了目前萱草分株繁殖效率低、周期長的缺點，且與常規的以花莖作為外植體的組培方法相比，具有取材量更大、節約成本、滅菌效果好、愈傷組織誘導效率更高的優點，其誘導率比花莖的誘導率高出一倍左右。本發明的方法可以為以萱草花絲為基礎的其他研究（例如體細胞胚的培養）等提供相關的技術支持。
【專利說明】以花絲為外植體誘導萱草紅朗姆愈傷組織的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及組織培養技術，具體地說，涉及一種以花絲為外植體誘導萱草‘RedRum’愈傷組織的方法。
【背景技術】
[0002]萱草為百合科萱草屬多年生花卉，是中國的傳統名花。萱草花葉兼美，花色花形豐富、觀賞性高、觀賞期長、適應性強，應用方式多樣，尤其是作為地被植物被廣泛用在花壇、花境等城市綠化和園林景觀建設中。隨著育種技術的不斷進步，萱草的新品種也層出不窮。萱草‘Red Rum’為荷蘭引進的品種，植株健壯，具有很高的觀賞性，6月中旬現蕾，六月底至七月中旬為盛花期，七月底至八月中旬為末花期。株高50cm左右，花葶高50cm，葉綠色，葉長60cm，寬3cm，著花平均20朵，紅色，艷麗，花徑IOcm左右。可以作為一種優良的地被廣泛地應用于城市園林綠化中。然而，‘Red Rum’自然結實率低，傳統的分株繁殖方法繁殖周期長、繁殖倍數低，難以滿足工廠化生產的需要，限制了其在園林綠化中的快速應用。組織培養作為一種快速繁殖技術，是解決這一問題的有效途徑。
[0003]近年來國內關于萱草的組培研究也較多，但組培方法大同小異，常用的外植體種類也多集中在莖段、花蕾等材料上(例如，何秋月等2011年已對‘御衣黃’的花蕾為外植體誘導出愈傷組織；李秀華、宋陽、蘭麗婷等通過莖段誘導出了愈傷組織)，少數可以通過新葉、子房、花瓣獲得愈傷組織，進而獲得組培幼苗(Zhiwu Li等2010年通過幼葉誘導出了愈傷；安鳳霞等2008年通過根段成功誘導出了紅花萱草的愈傷)。但萱草的組培階段極少對花絲進行研究。萱草中對花絲的研究多集中在體胚培養領域，在非胚性愈傷方面，高淑瀅等2009年對‘金娃娃’萱草的不同外植體的愈傷發生情況進行對比實驗，其中花絲在含有不同濃度6-BA、KT、IBA激素的培養基中培養一段時間以后，花絲雖然有膨大變形，但是都沒有愈傷組織產生，后逐漸枯 萎死亡。
[0004]目前尚未見關于通過萱草花絲獲得非胚性愈傷組織，進一步獲得組培幼苗的研究報道。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種以花絲為外植體誘導萱草‘Red Rum’愈傷組織的方法。
[0006]為了實現本發明目的，本發明的以花絲為外植體誘導萱草‘Red Rum’愈傷組織的方法，包括以下步驟:
[0007]I)外植體的采集與滅菌:采集長度為1.0~2.5cm的生長發育正常的萱草‘RedRum’花蕾，用毛筆蘸取低濃度的洗潔精溶液進行初步的表面清潔，然后用水沖洗，依次置于75%~85%酒精(優選75%酒精)中10~20s (優選15s)，l%NaC10溶液中8~15min (優選IOmin),進行滅菌,獲得無菌花蕾；
[0008]2)花絲的獲得與接種:在無菌環境下，切除上述無菌花蕾底部花托部分，剖開花被，取出花絲，同時去除花絲下部與花托相連接的部分以及花絲上部與花藥相連接的部分，取中段的花絲作為外植體；將作為外植體的花絲的形態學下端向下接種到誘導培養基中培養，將花絲下部約1/3的部分插入培養基中；
[0009]3)愈傷組織的誘導培養:上述誘導培養基為MS培養基中添加了濃度為O~
1.0mg/L的6-芐基嘌呤、0.5~2.0mg/L的二氯苯氧乙酸、30g/L的鹿糖和7.0g/L的瓊脂，pH值6.15，培養至愈傷組織出現；
[0010]4)繼代增殖培養:將愈傷組織轉移至增殖培養基中，進行增殖培養，每隔28~30天(優選30天)繼代一次，繼代一至三次(優選繼代三次)；
[0011]5)生根培養:將繼代增殖后生長良好的組培幼苗去除愈傷組織后轉入空白MS培養基中培養兩周后，再轉入生根培養基中進行生根培養。
[0012]其中，步驟3)-5)中培養條件為:23±1°C，光照強度2000-3000LX，光照周期16/8h。
[0013]步驟4)中增殖培養基為MS培養基中添加了濃度為0.5~2.0mg/L的6_芐基嘌呤、0.01~0.lmg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和7.0g/L的瓊脂，pH值6.15。
[0014]步驟5)中生根培養基為1/2MS培養基中添加了濃度為O~0.2mg/L的吲哚丁酸、O~0.2mg/L的萘乙酸、30g/L的鹿糖和7.0g/L的瓊脂，pH值6.15。
[0015]步驟2)中接種使用的培養容器為直徑為12cm的培養皿，其中添加的培養基厚度為0.7~1.0cm;步驟3)-5)中使用的培養容器為IOOmL的錐形瓶，培養基厚度為0.7~ 1.0cm0
[0016]優選地，步驟3)中使用的誘導培養基為:MS+1.0mg/L6-芐基嘌呤+0.5mg/L 二氯苯氧乙酸+ 30g/L蔗糖+ 7.0g/L瓊脂，pH值6.15。
[0017]步驟4)中使用的增殖培養基為:MS+1.0mg/L6-芐基嘌呤+0.01mg/L萘乙酸+30g/L 蔗糖 +6.5g/L 瓊脂，pH 值 6.15 ;*MS+2.0mg/L6_ 芐基嘌呤+0.01mg/L 萘乙酸+30g/L 蔗糖+6.5g/L 瓊脂，pH 值 6.15。
[0018]步驟5)中使用的生根培養基為:l/2MS+0.lmg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂。
[0019]本發明中所述MS培養基為:
[0020]大量元素:NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2.2H20440mg/L,MgSO4.7H20370mg/L、KH2P04170mg/L ；
[0021 ]微量元素:ΚΙ0.83mg/L、Η3Β036.2mg/L、MnSO4.4Η2022.3mg/L、ZnSO4.7H208.6mg/L、Na2MnO4.2H200.25mg/L、CuSO4.5H200.025mg/L、CoCl2.6H200.025mg/L ；
[0022]鐵鹽:FeS04.7H2027.8mg/L、Na2-EDTA.2H2037.3mg/L ；
[0023]有機物質:肌醇100mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸紙卩多醇0.5mg/L、鹽酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸 2.0mg/Lo
[0024]本發明還提供用于以花絲為外植體誘導萱草‘Red Rum’愈傷組織的培養基，包括上述三種培養基，即愈傷組織的誘導培養基、繼代增殖培養基和生根培養基。
[0025]本發明針對國內萱草在花絲組培技術方面的空白，提供一種以花絲為外植體進行萱草‘Red Rum’愈傷組織誘導的方法，該方法具有取材量更大、節約成本、滅菌效果好、愈傷組織誘導效率更高的優點，其誘導率比花莖的誘導率高出一倍左右。
[0026]本發明所述的方法，是以萱草‘Red Rum’ 1.0~2.5cm花絲為外植體進行組織培養、獲得組培苗的方法，包括下述步驟:(I)外植體的采集與滅菌；(2)花絲的獲得與接種；
(3)愈傷組織的誘導培養；(4)愈傷組織的增殖培養；(5)組培苗的生根培養。
[0027]步驟(1)外植體的采集與滅菌:在六月下旬萱草‘Red Rum’開始現蕾的時候，選擇晴朗的中午，在田間采集長度在1.0~2.5cm左右的發育正常的花蕾，用毛筆在低濃度的洗潔精溶液中進行初步的表面清潔，然后用自來水沖洗2h，然后轉移到超凈工作臺上，采用75%酒精震蕩滅菌20s，無菌水沖洗2次，然后放入濃度為1.0%的NaClO中滅菌lOmin，采用上述組合滅菌方法，最終獲得無菌花蕾。
[0028]步驟(2)花絲的獲得與接種:在無菌環境下，用解剖刀將無菌花蕾底部花托部分切除，剖開花被，用鑷子小心取出花絲，同時要去除花絲下部與花托相連接的部分和花絲上部與花藥相連接的部分，得到相應的花絲作為外植體。將獲得的花絲小心接種到相應的誘導培養基上，接種時要注意將花絲的形態學下端向下插入到培養基中進行培養。將花絲下部約1/3的部分插入培養基中，不要全部插入。
[0029]步驟(3)愈傷組織的誘導培養:將上一步獲得的花絲接種在添加了濃度為O~
1.0mg/L的6-芐基嘌呤(6-ΒΑ)、0.5~2.0mg/L的二氯苯氧乙酸(2，4_D)、30g/L的蔗糖和
7.0g/L瓊脂的MS培養基中進行培養，60天以后即可有較多的愈傷組織出現。待花絲底部長出了較多的愈傷、且愈傷上有較多的芽點出現的時候，將愈傷組織轉移到增殖培養基上進行后續的增殖培養。
[0030]步驟(4)愈傷組織的增殖培養:將上一步獲得的花絲接種在添加了濃度為0.5~
2.0mg/L的6-芐基嘌呤(6-BA)和0.01~0.lmg/L的萘乙酸(NAA)、30g/L的蔗糖和7.0g/L瓊脂的MS培養基中進行增殖培·養，每隔30天繼代一次。
[0031]步驟(5)組培苗的生根培養:將生長情況較好的組培幼苗去除愈傷組織后轉入空白MS培養基中培養兩周，以消除前攝激素的影響。然后轉入生根培養基中進行生根培養。
[0032]實驗證明，當選擇的激素濃度分別為6-BA1.0mg/L和2，4-D0.5mg/L時，獲得的愈傷組織的誘導率最高，因此步驟(3)中最佳誘導培養基為MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L2, 4-D + 30g/L 蔗糖+ 7.0g/L 瓊脂。
[0033]當選擇的激素濃度為6-BA1.0mg/L和0.0 lmg/L NAA時，或者6-BA2.0mg/L和0.0 lmg/L NAA時，可以獲得最高的增殖率。因此，步驟(4)中最佳增殖培養基為MS+1.0mg/L6-BA+0.0 lmg/L NAA+30g/L 蔗糖 +6.5g/L 瓊脂或 MS+2.0mg/L6_BA+0.0 lmg/L NAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂。步驟(5)中最佳生根培養基為1/2MS+NAA0.lmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L。
[0034]步驟(3)中，經過愈傷組織誘導的培養發現，在愈傷組織產生一段時間以后，會逐漸分化出芽點，后期芽點與愈傷組織同時生長，因此不需要進行單獨的叢生芽的分化的誘導，而可以直接進行叢生芽的增殖培養。
[0035]上述啟動培養階段，采用的培養基為固體培養基，培養容器為培養皿，培養基厚度在1.0cm左右；增殖培養階段，采用的培養基為固體無菌培養基，培養容器為IOOmL的錐形瓶。其余培養環境均為溫度23±1°C，光照強度2000-3000LX，光照周期16/8h。
[0036]發明人經過大量的實驗對比，通過對萱草‘Red Rum’進行不同激素、不同外植體的組培研究，摸索出了通過花絲進行愈傷組織誘導的一個新的萱草的組培途徑。
[0037]本發明的優點是取材量相對傳統的花莖來說，具有取材量更大、滅菌效果好、愈傷組織誘導效率更高的優點，其誘導率比花莖的誘導率高出一倍左右。同時，由于初期所需的培養基量更少，約為花莖所需培養基的1/12，減少了配置培養基與轉瓶的步驟，因此更為節省勞動力。同時，此技術可以為今后以萱草花絲為外植體的其他方面的組培研究提供參考借鑒。
[0038]本發明所述的方法，在步驟(5)之后還可進行進一步的煉苗移栽，由于這些部分已有研究，因此不在本發明中贅述。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0039]圖1-2為本發明萱草‘Red Rum’的花絲在啟動培養基中培養60天時候的生長狀況，可以看到花絲在培養基中都有不同程度的愈傷組織的產生，并有幼嫩芽的出現。
[0040]圖3為本發明田間采集的經愈傷組織誘導后發育形成的萱草‘Red Rum’的花枝。
【具體實施方式】
[0041]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0042]實施例1以花絲為外植體誘導萱草‘Red Rum’愈傷組織的方法
[0043]( I)外植體的采集與滅菌
[0044]在六月下旬萱草‘Red Rum’初花時期，選擇晴朗的中午，采取長度在I~2.5cm左右的發育正常的花蕾，在低濃度的洗潔精溶液中浸泡5分鐘左右，并用毛筆進行初步的表面清潔，然后將外植體置于瓶中，用自來水沖洗2~3h。完成初步清潔以后將花蕾轉移到超凈工作臺上，采用組合滅 菌方法，將5個花蕾一組，放入盛有80mL75%酒精的錐形瓶中，輕輕震蕩20s，倒出酒精，加入60mL無菌水沖洗2遍，倒出無菌水以后，然后想錐形瓶中加入80mLl.0%的NaClO溶液，滅菌lOmin，期間可以輕輕震蕩錐形瓶，以保證花蕾表面與溶液充分接觸。
[0045](2)花絲的獲得與接種
[0046]在無菌環境下，將上一步錐形瓶中的NaClO溶液倒出，用鑷子小心取出花蕾，注意花蕾不要接觸到錐形瓶口。將花蕾置于無菌濾紙之上，用解剖刀將花蕾底部花托部分切除，然后剖開花被，用鑷子小心取出花絲，得到相應的花絲作為外植體。要注意，盡可能取得完整的花絲，同時要去除花絲下部與花托相連接的部分和花絲上部與花藥相連接的部分。將獲得的花絲小心接種到相應的誘導培養基上，接種時要注意將花絲的形態學下端向下插入到培養基中。將花絲下部約1/3的部分插入培養基中即可，不要全部插入。每個直徑為12cm的培養皿中接種12根花絲。
[0047]( 3)愈傷組織的誘導培養
[0048]將上一步獲得的花絲接種在添加了不同濃度的6-芐基嘌呤(6-BA)(濃度分別為Omg/L、1.0mg/L)、二氯苯氧乙酸(2，4-D)(濃度分別為 0.5mg/L、l.0mg/L、2.0mg/L)和萘乙酸(NAA)(濃度分別為0mg/L、0.2mg/L)的培養基中，進行培養。愈傷組織誘導培養基中添加的激素如表1所示。
[0049]表1愈傷組織誘導培養基中添加的激素含量
[0050]
【權利要求】
1.以花絲為外植體誘導萱草‘Red Rum’愈傷組織的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)外植體的采集與滅菌:采集長度為1.0~2.5cm的生長發育正常的萱草‘Red Rum’花蕾，用毛筆蘸取低濃度的洗潔精溶液進行初步的表面清潔，然后用水沖洗，依次置于75%~85%酒精中10~20s，l%NaC10溶液中8~15min，進行滅菌，獲得無菌花蕾； 2)花絲的獲得與接種:在無菌環境下，切除上述無菌花蕾底部花托部分，剖開花被，取出花絲，同時去除花絲下部與花托相連接的部分以及花絲上部與花藥相連接的部分，取中段的花絲作為外植體；將作為外植體的花絲的形態學下端向下接種到誘導培養基中培養，將花絲下部約1/3的部分插入培養基中； 3)愈傷組織的誘導培養:上述誘導培養基為MS培養基中添加了濃度為O~1.0mg/L的6-芐基嘌呤、0.5~2.0mg/L的二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和7.0g/L的瓊脂，pH值6.15，培養至愈傷組織出現； 4)繼代增殖培養:將愈傷組織轉移至增殖培養基中，進行增殖培養，每隔28~30天繼代一次，繼代一至三次； 5)生根培養:將繼代增殖后生長良好的組培幼苗去除愈傷組織后轉入空白MS培養基中培養兩周后，再轉入生根培養基中進行生根培養。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)-5)中培養條件為:23±1°C，光照強度2000~3000Lx，光照周期16/8h。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中增殖培養基為MS培養基中添加了濃度為0.5~2.0mg/L的6-芐基嘌呤、0.01~0.lmg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和7.0g/L的瓊脂，pH值6.15。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)中生根培養基為1/2MS培養基中添加了濃度為O~0.2mg/L的吲哚丁酸、O~0.2mg/L的萘乙酸、30g/L的鹿糖和7.0g/L的瓊脂，pH值6.15。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中接種使用的培養容器為直徑為12cm的培養皿，其中添加的培養基厚度為0.7~1.0cm ;步驟3) -5)中使用的培養容器為IOOmL的錐形瓶，培養基厚度為0.7~1.0cm0
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中使用的誘導培養基為:MS+1.0mg/L6-芐基嘌呤+0.5mg/L 二氯苯氧乙酸+ 30g/L蔗糖+ 7.0g/L瓊脂，pH值6.15。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中使用的增殖培養基為:MS+1.0mg/L6-芐基嘌呤 +0.0 lmg/L 萘乙酸 +30g/L 蔗糖 +6.5g/L 瓊脂，pH 值 6.15 ;或MS+2.0mg/L6-芐基嘌呤 +0.0 lmg/L 萘乙酸 +30g/L 蔗糖 +6.5g/L 瓊脂，pH 值 6.15。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)中使用的生根培養基為:1/2MS+0.lmg/L 萘乙酸 +30g/L 鹿糖 +6.5g/L 瓊脂。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述MS培養基為:
大量元素:NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2.2H20440mg/L、MgSO4.7H20370mg/L、KH2PO4170mg/L ；
微量元素:K10.83mg/L、Η3Β036.2mg/L、MnSO4.4Η2022.3mg/L、ZnSO4.7Η208.6mg/L、Na2MnO4.2Η200.25mg/L、CuSO4.5Η200.025mg/L、CoCl2.6Η200.025mg/L ；
鐵鹽:FeS04.7H2027.8mg/L、Na2-EDTA.2H2037.3mg/L ；有機物質:肌醇100mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸紙卩多醇0.5mg/L、鹽酸硫胺素0.lmg/L、甘氨酸 2.0mg/Lo
10.用于以花絲為外植體誘導萱草‘Red Rum’愈傷組織的培養基，其特征在于，包括愈傷組織的誘導培養基、繼代增殖培養基和生根培養基； 其中，愈傷組織的誘導培養基為:MS+0~1.0mg/L6-芐基嘌呤+0.5~2.0mg/L 二氯苯氧乙酸+30g/L鹿糖+7.0g/L瓊脂，pH值6.15 ; 繼代增殖培養基為:MS+0.5~2.0mg/L6-芐基嘌呤+0.01~0.lmg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+7.0g/L 瓊脂，pH 值 6.15 ； 生根培養基為:1/2MS+0~0.2mg/L吲哚丁酸+0~0.2mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH 值6.15。
【文檔編號】A01H4/00GK103704134SQ201310682991
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月12日 優先權日:2013年12月12日
【發明者】董麗, 高鳳, 程堂仁, 張啟翔 申請人:北京林業大學