一種可抑制褐變產生的川貝母多倍體愈傷組織的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可抑制褐變產生的川貝母多倍體愈傷組織的培養(yǎng)方法，該方法通過采用將誘導產生的多倍體愈傷組織浸泡在檸檬酸溶液中切割為適當大小，再轉接入由MS、活性炭和乳糖組成的培養(yǎng)基中進行預培養(yǎng)，然后將預培養(yǎng)后的多倍體愈傷組織接入以改良的MS為基本培養(yǎng)基，并添加了2,4-D、KT和二硫蘇糖醇的固體培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，有效克服了川貝母多倍體愈傷組織在增殖培養(yǎng)中易產生褐變的問題，提高了川貝母多倍體愈傷組織的增殖倍數，為利用生物工程技術大規(guī)模、快速生產川貝母有效組分提供了一條新途徑。
【專利說明】一種可抑制褐變產生的川貝母多倍體愈傷組織的培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種川貝母多倍體愈傷組織的培養(yǎng)方法，特別是涉及一種可抑制褐變產生的川貝母多倍體愈傷組織的培養(yǎng)方法
【背景技術】
[0002]川貝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)是百合科多年生草本植物，以鱗莖入藥，為名貴的川產道地藥材，堪稱藥中之寶。川貝母是治療肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞嗽，咯痰帶血的常用藥物，主要有效成分為貝母生物堿和留體皂甙類等。在自然界中川貝母從種子萌發(fā)到長成藥材，大約需要4-5年，由于川貝母價格昂貴，加之藥材中有效成分含量很低，因此造成了川貝母野生資源的過度采挖，使得川貝母野生資源銳減，正面臨枯竭的境地。
[0003]楊楊等人在《野生和組培川貝母總生物堿含量的測定和定位研究》的一文中報道了利用組織培養(yǎng)技術生產的川貝母愈傷組織其生物堿含量為0.146%，高于野生川貝母
0.111%和市售的川貝母0.08%;王躍華等人在《卷葉貝母多倍體鱗莖誘導方法研究》一文中報道了通過利用秋水仙素誘導卷葉貝母產生的多倍體的愈傷組織培育出的多倍體鱗莖，其總生物堿含量為0.249%，大大高于二倍體組培鱗莖0.190%和市售卷葉貝母鱗莖0.068%。這是因為植物細胞中染色體數目加倍后，染色體上基因調控有效化學成分的含量也較正常二倍體增高，因此培育出的多倍體植物細胞中有效化學成分的含量也會明顯增加。
[0004]雖然誘導產生的 川貝母多倍體愈傷組織的有效組分含量大大提高，但川貝母多倍體愈傷組織在增殖培養(yǎng)過程中卻極易出現褐變，嚴重的甚至會出現死亡。因此，如何有效地抑制川貝母多倍體愈傷組織在增殖培養(yǎng)中產生褐變的問題，將直接影響到利用生物技術大規(guī)?？焖偕a川貝母中有效組分的方法順利實施。目前還未見有相關解決方法的報道。
【發(fā)明內容】
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種能有效抑制褐變產生的川貝母多倍體愈傷組織的培
養(yǎng)方法。
[0006]為達到上述目的，本發(fā)明采用的解決方案包括如下步驟:
[0007](I)川貝母多倍體愈傷組織的誘導培養(yǎng):選取川貝母新鮮鱗莖的鱗片葉，先進行消毒處理，然后接入pH值為5.5~6.2的MS+6-BA0.1~1.0mg.1^+2，4-D1.0~5.0mg.L i+IAA0.1 ~1.0mg.L W 秋水仙素 300 ~600mg.L k 鹿糖 20 ~40g/L+ 瓊脂
5.0~6.5g/L的培養(yǎng)基中，在溫度為12~20°C且無光照的條件下誘導培養(yǎng)2~5天，然后再轉接到不含秋水仙素的上述培養(yǎng)基中，在同樣的培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，獲得川貝母多倍體愈傷組織；
[0008](2)川貝母多倍體愈傷組織的預處理:在超凈工作臺上將川貝母多倍體愈傷組織從培養(yǎng)瓶中取出，直接浸泡于裝有檸檬酸溶液的培養(yǎng)皿中，并在檸檬酸溶液中將其切割為
1.0cm~3.0cm3的大小后，轉接入pH值為5.0的MS+活性炭1.0~4.0%+乳糖20~35g/L的液體培養(yǎng)基中，在溫度為10~15°C、無光照和搖床轉速為120~140r/min的條件下預處理4~8天；
[0009](3)川貝母多倍體愈傷組織的快速增殖培養(yǎng):將經預處理后的川貝母多倍體愈傷組織轉接到pH值為5.5的改良MS+2, 4-D1.0~4.0mg/L+KT0.5~2.0mg/L+ 二硫蘇糖醇
0.1~0.3mg/L+葡萄糖20~45g/L+瓊脂4.0~5.0g/L的固體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為12~26°C、每天光照4~8小時和光照強度為500~SOOlx的條件下進行增殖培養(yǎng)，所述改良MS基本培養(yǎng)基為無機物和硝酸鉀含量減半的MS基本培養(yǎng)基。
[0010]上述步驟(1)中所述消毒處理是指先用洗衣粉洗凈后于流水下沖洗25~30mim，再用2.0%次氯酸鈉溶液漂洗12~15min，用清水洗凈并吸干水后，再放入0.1%升汞溶液中消毒7~IOmim,然后用無菌水沖洗2~3次后用無菌濾紙吸干表面的水分。
[0011]上述步驟(2)中所述檸檬酸溶液的濃度為0.1~0.5mg/L。
[0012]本發(fā)明通過采用將誘導產生的多倍體愈傷組織浸泡在檸檬酸溶液中切割為適當大小，再轉接入由MS、活性炭和乳糖組成的培養(yǎng)基中進行預培養(yǎng)，然后將預培養(yǎng)后的多倍體愈傷組織接入以改良的MS為基本培養(yǎng)基，并添加了 2，4-D、KT和二硫蘇糖醇的固體培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，有效克服了川貝母多倍體愈傷組織在增殖培養(yǎng)中易產生褐變的問題，提高了川貝母多倍體愈傷組織的增殖倍數，為利用生物工程技術大規(guī)模、快速生產川貝母有效組分提供了一條新途徑。
[0013]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
【具體實施方式】
[0014]實施例1
[0015](I)川貝母多 倍體愈傷組織的誘導培養(yǎng):選取川貝母新鮮鱗莖的鱗片葉，先用洗衣粉洗凈后于流水下沖洗25mim，再用2.0%次氯酸鈉溶液漂洗12min，用清水洗凈并吸干水后，再放入0.1%升汞溶液中消毒7mim，然后用無菌水沖洗2次后用無菌濾紙吸干表面的水分，最后接入pH值為5.5的愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS+6-BA0.1mg.L^+2，4-D1.0mg.L_1+IAA0.1mg.I71+ 秋水仙素 300mg.I71+ 鹿糖 20g/L+ 瓊脂 5.0g/L 的培養(yǎng)基中，在溫度為12°C且無光照的條件下誘導培養(yǎng)2天，然后再轉接到不含秋水仙素的上述培養(yǎng)基即 MS+6-BA0.1mg.L_1+2,4-Dl.0mg.I^+IAA0.1mg.L-1+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 5.0g/L 中，在同樣的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)30天，川貝母多倍體愈傷組織的誘導率為78.6% ；
[0016](2)川貝母多倍體愈傷組織的預處理:在超凈工作臺上，將誘導產生的川貝母多倍體愈傷組織(即檢測愈傷組織細胞染色體數目為2n=4x=48)從培養(yǎng)瓶中取出，直接浸泡于裝有濃度為0.lmg/L的檸檬酸溶液的培養(yǎng)皿中，并在檸檬酸溶液中將其切割為1.0cm3的大小后，轉接入PH值為5.0的MS+活性炭1.0%+乳糖20g/L的液體培養(yǎng)基中，在溫度為12°C、無光照和搖床轉速為120r/min的條件下預處理4天；
[0017](3)川貝母多倍體愈傷組織的快速增殖培養(yǎng):將經預處理后的川貝母多倍體愈傷組織轉接到PH值為5.5的硝酸鉀含量減半的改良MS+2，4-D1.0mg/L+KT0.5mg/L+ 二硫蘇糖醇0.lmg/L+葡萄糖20g/L+瓊脂4.0g/L的固體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為12 °C、每天光照4小時和光照強度為5001x的條件下進行增殖培養(yǎng)30天，川貝母多倍體愈傷組織的增殖倍數為2.36倍，增殖的多倍體愈傷組織的褐變率為0%。[0018]實施例2
[0019](I)川貝母多倍體愈傷組織的誘導培養(yǎng):選取川貝母新鮮鱗莖的鱗片葉，先用洗衣粉洗凈后于流水下沖洗30mim，再用2.0%次氯酸鈉溶液漂洗15min，用清水洗凈并吸干水后，再放入0.1%升汞溶液中消毒9mim，然后用無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干表面的水分，最后接入pH值為5.8的愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS+6-BA0.5mg.L-1+2，4-D4.0mg.L-1+IAA0.5mg.l-1+ 秋水仙素 450mg.I71+ 鹿糖 30g/L+ 瓊脂 5.5g/L 的培養(yǎng)基中，在溫度為18°C且無光照的條件下誘導培養(yǎng)4天，然后再轉接到不含秋水仙素的上述培養(yǎng)基即 MS+6-BA0.5mg.L_1+2,4-D4.0mg.l-1+IAA0.5mg.L-1+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5.5g/L 中，在同樣的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)30天，川貝母多倍體愈傷組織的誘導率為95.6% ；
[0020](2)川貝母多倍體愈傷組織的預處理:在超凈工作臺上，將誘導產生的川貝母多倍體愈傷組織(即檢測愈傷組織細胞染色體數目為2n=4x=48)從培養(yǎng)瓶中取出，直接浸泡于裝有濃度為0.4mg/L的檸檬酸溶液的培養(yǎng)皿中，并在檸檬酸溶液中將其切割為2.5cm3的大小后，轉接入PH值為5.0的MS+活性炭3.0%+乳糖25g/L的液體培養(yǎng)基中，在溫度為12°C、無光照和搖床轉速為130r/min的條件下預處理6天；
[0021](3)川貝母多倍體愈傷組織的快速增殖培養(yǎng):將經預處理后的川貝母多倍體愈傷組織轉接到PH值為5.5的硝酸鉀含量減半的改良MS+2，4-D2.0mg/L+KTl.0mg/L+ 二硫蘇糖醇0.2mg/L+葡萄糖30g/L+瓊脂4.5g/L的固體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為20°C、每天光照6小時和光照強度為6001x的條件下進行增殖培養(yǎng)30天，川貝母多倍體愈傷組織的增殖倍數為3.43倍，增殖的多倍體愈傷組織的褐變率為0%。
[0022]實施例3
[0023](I)川貝母多倍體愈傷組織的誘導培養(yǎng):選取川貝母新鮮鱗莖的鱗片葉，先用洗衣粉洗凈后于流水下沖洗30mim，再用2.0%次氯酸鈉溶液漂洗15min，用清水洗凈并吸干水后，再放入0.1%升汞溶液中消毒lOmim，然后用無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干表面的水分，最后接入pH值為6.0的愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS+6-BAl.0mg.L-1+2，4-D5.0mg.L_1+IAA1.0mg.L—1+ 秋水仙素 600mg.L—1+ 鹿糖 40g/L+ 瓊脂 6.5g/L 的培養(yǎng)基中，在溫度為20°C且無光照的條件下誘導培養(yǎng)5天，然后再轉接到不含秋水仙素的上述培養(yǎng)基中，在同樣的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)30天，川貝母多倍體愈傷組織的誘導率為93.2% ；
[0024](2)川貝母多倍體愈傷組織的預處理:在超凈工作臺上，將誘導產生的川貝母多倍體愈傷組織(即檢測愈傷組織細胞染色體數目為2n=4x=48)從培養(yǎng)瓶中取出，直接浸泡于裝有濃度為0.5mg/L的檸檬酸溶液的培養(yǎng)皿中，并在檸檬酸溶液中將其切割為3.0cm3的大小后，轉接入PH值為5.0的MS+活性炭4.0%+乳糖35g/L的液體培養(yǎng)基中，在溫度為15°C、無光照和搖床轉速為140r/min的條件下預處理8天；
[0025](3)川貝母多倍體愈傷組織的快速增殖培養(yǎng):將經預處理后的川貝母多倍體愈傷組織轉接到PH值為5.5的硝酸鉀含量減半的改良MS+2，4-D4.0mg/L+KT2.0mg/L+ 二硫蘇糖醇0.3mg/L+葡萄糖45g/L+瓊脂5.0g/L的固體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為26 °C、每天光照8小時和光照強度為SOOlx的條件下進行增殖培養(yǎng)30天，川貝母多倍體愈傷組織的增殖倍數為3.56倍，但有13.51%的增殖愈傷組織出現了不同程度的褐化情況。
[0026]實施例4
[0027]將實施例2步驟(1)中多倍體誘導培養(yǎng)基中的秋水仙素濃度改為300mg/L，誘導培養(yǎng)2天，其它步驟同實施例2，川貝母多倍體愈傷組織的誘導率為79.86%。
[0028]實施例5
[0029]在實施例2步驟(2)中，將川貝母多倍體愈傷組織改切為1.0cm2的大小，其它步驟同實施例2，經增殖培養(yǎng)后，川貝母多倍體愈傷組織的增殖倍數為2.47倍。
[0030]實施例6
[0031]將實施例2步驟(2)中液體培養(yǎng)基改為MS+活性炭1.0mg/L+乳糖35g/L，其它步驟同實施例2，川貝母多倍體愈傷組的增殖倍數為2.78倍。
[0032]實施例7
[0033]將實施例2步驟(3)中的川貝母多倍體愈傷組織的增殖培養(yǎng)基改為硝酸鉀含量減半的改良 MS+2，4-D1.0mg/L+KT2.0mg/L+ 二硫蘇糖醇 0.lmg/L+ 葡萄糖 45g/L+ 瓊脂 5.0g/L的培養(yǎng)基中，其它步驟同實施例2，川貝母多倍體愈傷組織的增殖倍數為2.43倍，增殖的多倍體愈傷組織的褐變率為11.31%。
[0034]實施例8
[0035]將實施例2步驟(3)中的增殖培養(yǎng)條件改為:培養(yǎng)溫度為26°C、每天光照8小時和光照強度為8001x，其它步驟同實施例2，川貝母多倍體愈傷組織的增殖倍數為3.23倍，增殖的多倍體愈傷組織的褐變率為21.26%。
[0036]比較實施例1`[0037]在實施例2步驟(1)中，將消毒后的鱗片葉一直接種在含秋水仙素的培養(yǎng)基中，不進行轉接，其它步驟同實施例2，培養(yǎng)30天后，鱗片葉外植體有80%出現了不同程度的褐變和死亡，而在存活的鱗片葉外植體上只有極少量的多倍體愈傷組織產生，并且很難進行增殖生長。
[0038]比較實施例2
[0039]將實施例2步驟(1)中川貝母多倍體愈傷組織的誘導培養(yǎng)條件改為:溫度為30V、每天光照18小時、光照強度為30001x，其它步驟同實施例2，川貝母多倍體愈傷組織的誘導率為45.8%ο
[0040]比較實施例3
[0041]在實施例2步驟(2)中，將川貝母多倍體愈傷組織改為不在檸檬酸溶液中進行切害I]，而是直接放在濾紙上切割為0.5cm2的大小，其它步驟同實施例2，增殖培養(yǎng)30天，其川貝母多倍體愈傷組織的增殖倍數為1.93倍，增殖的多倍體愈傷組織的褐變率為36.86%。
[0042]比較實施例4
[0043]將實施例2步驟(2)中的液體培養(yǎng)基改為pH值為7的MS+蔗糖45g/L，其它步驟同實施例2，增殖培養(yǎng)30天，其川貝母多倍體愈傷組織的增殖倍數為2.14倍，增殖的多倍體愈傷組織的褐變率為34.67%。
[0044]比較實施例5
[0045]將實施例2步驟(2)中川貝母多倍體愈傷組織的預處理條件改為:溫度為30°C、每天光照18小時、光照強度為25001x，其它步驟同實施例2，增殖培養(yǎng)30天后統計，川貝母多倍體愈傷組織的增殖倍數為1.98倍，增殖的多倍體愈傷組織的褐變率為51.23%。
[0046]比較實施例6
[0047]將實施例2步驟(3)中的增殖培養(yǎng)基改為MS+2，4-D0.5mg/L+KT3.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，其它步驟同實施例2，增殖培養(yǎng)30天后統計，川貝母多倍體愈傷組織的增殖倍數為1.78倍，增殖的多 倍體愈傷組織的褐變率為33.26%。
【權利要求】
1.一種可抑制褐變產生的川貝母多倍體愈傷組織的培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟: (1)川貝母多倍體愈傷組織的誘導培養(yǎng):選取川貝母新鮮鱗莖的鱗片葉，先進行消毒處理，然后接入pH值為5.5~6.2的MS+6-BA0.1~1.0mg.L_1+2,4-Dl.0~5.0mg.L i+IAA0.1 ~1.0mg.L W 秋水仙素 300 ~600mg.L k 鹿糖 20 ~40g/L+ 瓊脂5.0~6.5g/L的培養(yǎng)基中，在溫度為12~20°C且無光照的條件下誘導培養(yǎng)2~5天，然后再轉接到不含秋水仙素的上述培養(yǎng)基中，在同樣的培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，獲得川貝母多倍體愈傷組織； (2)川貝母多倍體愈傷組織的預處理:在超凈工作臺上將川貝母多倍體愈傷組織從培養(yǎng)瓶中取出，直接浸泡于裝有檸檬酸溶液的培養(yǎng)皿中，并在檸檬酸溶液中將其切割為1.0cm~3.0cm3的大小后，轉接入pH值為5.0的MS+活性炭1.0~4.0%+乳糖20~35g/L的液體培養(yǎng)基中，在溫度為10~15°C、無光照和搖床轉速為120~140r/min的條件下預處理4~8天； (3)川貝母多倍體愈傷組織的增殖培養(yǎng):將經預處理后的川貝母多倍體愈傷組織轉接到 pH值為 5.5 的改良 MS+2, 4-D1.0 ~4.0mg/L+KT0.5 ~2.0mg/L+二硫蘇糖醇 0.1 ~0.3mg/L+葡萄糖20~45g/L+瓊脂4.0~5.0g/L的固體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為12~26 °C、每天光照4~8小時和光照強度為500~8001x的條件下進行增殖培養(yǎng)，所述改良MS基本培養(yǎng)基為無機物和硝酸鉀含量減半的MS基本培養(yǎng)基。
2.根據權利要求1所述的一種可抑制褐變產生的川貝母多倍體愈傷組織的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(1)中所述消毒處理是指先用洗衣粉洗凈后于流水下沖洗25~30mim，再用2.0%次氯酸鈉溶液漂洗12~15min，用清水洗凈并吸干水后，再放入0.1%升汞溶液中消毒7~IOmim,然后用無菌水沖洗2~3次后用無菌濾紙吸干表面的水分。
3.根據權利要求1所述的一種可抑制褐變產生的川貝母多倍體愈傷組織的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2)中所述檸檬酸溶液的濃度為0.1~0.5mg/L。
【文檔編號】A01H4/00GK103598099SQ201310616170
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月27日 優(yōu)先權日:2013年11月27日
【發(fā)明者】王躍華, 劉濤, 江明殊, 楊敏, 范文萍, 王磊, 郭翠平, 何詩虹, 王曉蓉, 李睿玉, 許志強 申請人:成都大學