基于慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒的hbv小鼠模型的制作方法

基于慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒的hbv小鼠模型的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒建立的HBV小鼠模型，旨在提供一種建立小鼠HBV持續(xù)性感染模型的方法。所屬領(lǐng)域?yàn)樯锛夹g(shù)。其技術(shù)特征在于將攜帶多拷貝HBV?DNA的重組質(zhì)粒pCS-HBV1.3經(jīng)尾靜脈高壓水動(dòng)力注射到小鼠體內(nèi)感染小鼠肝組織細(xì)胞，所使用的小鼠為免疫功能正常的6周齡雌性C57BL／6小鼠。以該方法建立HBV持續(xù)性感染模型操作簡(jiǎn)單，可模擬人類HBV感染過程，為HBV感染研究提供很好的工具。
【專利說明】基于慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒的HBV小鼠模型
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】本發(fā)明屬于生物技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域，特別是涉及一種基于慢病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒pCS-HBVl.3建立HBV持續(xù)性感染的小鼠模型。
[0002]【背景技術(shù)】乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)屬嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae),其感染已成為全球面臨的嚴(yán)重公共健康問題之一,全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性HBV感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC);我國(guó)屬HBV高流行國(guó)家，HBV攜帶者約有9300萬，慢性肝炎患者達(dá)3000萬，每年有近30萬人死于肝硬化或肝癌，因而也是我國(guó)亟需解決的重大問題。
[0003]HBV具有嚴(yán)格的宿主特異性和嗜肝性，只感染人和少數(shù)靈長(zhǎng)類動(dòng)物，極大地限制了人們對(duì)HBV生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)制及藥物和疫苗的開發(fā)和評(píng)價(jià)等方面的研究。目前建立的HBV感染動(dòng)物模型主要有鴨乙肝模型、土撥鼠乙肝模型、HBV感染黑猩猩、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠以及人鼠嵌合肝臟小鼠模型等。鴨乙肝病毒(DHBV)和土撥鼠乙肝病毒(WHV)基因組有別于人類HBV，黑猩猩由于費(fèi)用和倫理方面的原因受到限制；而轉(zhuǎn)基因小鼠的獲得需要昂貴的顯微注射設(shè)備和復(fù)雜的操作，非常耗時(shí)費(fèi)力，且免疫系統(tǒng)對(duì)HBV先天耐受；人鼠嵌合肝臟小鼠模型雖可完整的呈現(xiàn)HBV復(fù)制周期，但其也存在制備困難、技術(shù)條件要求較高、難以大規(guī)模制備以及免疫系統(tǒng)抑制等問題，因而有必要建立一種方便、實(shí)用、快速的小動(dòng)物動(dòng)物模型。
[0004]基于HBV可復(fù)制性克隆轉(zhuǎn)染免疫功能正常的成體小鼠建立的HBV急、慢性感染模型為HBV相關(guān)研究提供了良好的工具。Yang等(Yang PL, Althage A, Chung J，etal.Hydrodynamic injection o`f viral DNA:a mouse model of acute hepatitis B virusinfection.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99 (21): 13825-13830)采用高壓水動(dòng)力注射的方法，將大約1.6ml的含1.3拷貝HBV基因組的DNA溶液在短時(shí)間內(nèi)(5_8s)快速注入到小鼠體內(nèi)建立了 HBV急性感染模型，該方法可使小鼠產(chǎn)生高滴度的病毒(107cOpy / ml血液)，但一周后由于特異性抗病毒抗體和CD8+T細(xì)胞的出現(xiàn)HBV從血液中得以清除，而在(NOD) / SCID小鼠中病毒可持續(xù)存在81天。而Huang LR等(Huang LR，ffu HL，ChenPJ，et al.An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronichepatitis B virus infection.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(47):17862-17867.)將pAAV-HBVl.2質(zhì)粒與將HBV基因組克隆到克隆載體pGEM4Z的質(zhì)粒同時(shí)注射C57BL / 6小鼠，前者在注射后25天仍可檢測(cè)到HBsAg的表達(dá)，28天之內(nèi)檢測(cè)不到抗HBs抗體的產(chǎn)生；而后者僅產(chǎn)生瞬時(shí)的抗原血癥，且28天之內(nèi)產(chǎn)生抗HBs抗體可見轉(zhuǎn)基因載體結(jié)構(gòu)是影響HBV基因在小鼠體內(nèi)表達(dá)的一個(gè)重要因素，。另外國(guó)內(nèi)學(xué)者(郭燕菊，王文，孫世惠，等.免疫抑制劑地塞米松可明顯延長(zhǎng)乙型肝炎病毒抗原在水動(dòng)力法轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型中的表達(dá)[J].病毒學(xué)報(bào)，2010，26 (1):20-26.)等將含有1.3拷貝HBV基因組的HBV表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)高壓水動(dòng)力法尾靜脈注射C57BL / 6小鼠，在注射后30天血清HBsAg和HBeAg即轉(zhuǎn)為陰性，且血清和肝組織中病毒載量下降。
[0005]慢病毒載體(Lentiviral vector, LVs)是在人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基礎(chǔ)上改造而成的，能利用逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，將自身的RNA轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA整合到宿主細(xì)胞的染色體中，從而使目的基因在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)期而穩(wěn)定的表達(dá)。慢病毒載體系統(tǒng)主要由三種包含不同結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒構(gòu)成，分別是轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒和包膜表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒除可插入感興趣的外源基因，還保留了病毒的LTR區(qū)和其他對(duì)病毒的整合和復(fù)制起重要作用的原件；其中LTR區(qū)包含了慢病毒的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、包裝信號(hào)、整合位點(diǎn)；整合位點(diǎn)可使病毒基因整合到宿主基因，使得外源基因得以長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)。
[0006]高壓水動(dòng)力尾靜脈注射(ZhangG,Budker V,Wolff JA.High levels of foreigngene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.Hum Gene Then 1999，10 (10): 1735-1737)是可使外源基因在肝內(nèi)表達(dá)的一種技術(shù)方法，利用該方法建立的小鼠HBV急慢性感染模型，為研究HBV復(fù)制和基因表達(dá)、肝癌致病機(jī)理及抗病毒藥物篩選及疫苗研究等提供了一個(gè)良好的工具。但目前難以獲得HBV持續(xù)性感染模型，因而本研究和發(fā)明利用慢病毒載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因載體結(jié)構(gòu)，構(gòu)建攜1.3倍HBV基因組的轉(zhuǎn)基因載體pCS-HBVl.3，經(jīng)高壓水動(dòng)力尾靜脈注射的方法注入到小鼠體內(nèi)，使其能夠穩(wěn)定高效長(zhǎng)期表達(dá)HBV基因。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0007]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基于慢病毒轉(zhuǎn)基因載體攜帶1.3倍HBV基因組的重組質(zhì)粒pCS-HBVl.3，以及利用該質(zhì)粒采用高壓尾靜脈注射技術(shù)建立HBV感染模型的方法；利用本發(fā)明的方法建立的HBV急、慢性感染模型有助于HBV生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)制及藥物的開發(fā)和評(píng)價(jià)等方面的研究。
[0008]本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因載體pCS-HBVl.3制備HBV小鼠急、慢性感染模型的制備方法，具體步驟如下:
[0009](1)載體構(gòu)建:本發(fā)明以pAAV / HBV1.3質(zhì)粒為模板，通過PCR的方法獲得1.3拷貝的HBV基因組(ayw亞型，GenBank:AB267090.1，D基因型)DNA片段；然后將此DNA片段插入到pCS-CG質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，并去除了原質(zhì)粒上的EGFP表達(dá)盒，獲得了攜帶1.3拷貝HBV基因組DNA的重組質(zhì)粒pCS-HBVl.3，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定正確；
[0010](2)采用高壓水動(dòng)力的方法將含有1.3拷貝HBV DNA的重組載體通過尾靜脈注入至丨J小鼠體內(nèi)，建立HBV感染的小鼠模型；
[0011](3)模型鑒定。
[0012]上述1.3拷貝的HBV DNA重組表達(dá)載體經(jīng)PCR擴(kuò)增得到HBV基因組的第1個(gè)片段(1066-3182bp)，經(jīng)Pst 1、EcoR I雙酶切后連接到同樣雙酶切的pCS_CG載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCS-HBVl質(zhì)粒；之后PCR擴(kuò)增HBV基因組的第二個(gè)片段(0_1582bp)，經(jīng)EcoR 1、ΚρηΙ雙酶切后連接到同樣酶切的pCS-HBVl的質(zhì)粒上，獲得了含1.3倍HBV基因組的重組質(zhì)粒pCS-HBVl.3。
[0013]一種含1.3倍基因組的基于慢病毒載體系統(tǒng)的乙肝成體轉(zhuǎn)基因小鼠模型，它是將
1.3倍的HBV重組質(zhì)粒pCS-HBVl.3利用高壓水動(dòng)力的方法經(jīng)尾靜脈注入到小鼠體內(nèi)，所述動(dòng)物是小鼠，高壓水動(dòng)力尾靜脈注射法是本發(fā)明所用的關(guān)鍵技術(shù)。
[0014]本發(fā)明采用常規(guī)的高壓水動(dòng)力注射的方法，注射前先將小鼠于白熾燈泡下照射10-15min,使其尾靜脈擴(kuò)張；注射質(zhì)粒量為5 μ g，液體為0.9% NaCl溶液。利用該方法在注射后24h即可建立HBV感染模型，其抗原表達(dá)可持續(xù)存在16周，可獲得HBV持續(xù)性感染的模型。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1HBV轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)結(jié)構(gòu)示意圖
[0016]為HBV轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)pCS-HBV1.3結(jié)構(gòu)示意圖。載體骨架為慢病毒載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-CG，將1.3倍HBV基因組插入取代其中的EGFP表達(dá)盒。
[0017]圖2pCS-HBVl.3 與 pAAV / HBV1.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清 HBsAg、HBeAg 的檢測(cè)
[0018]體外培養(yǎng)的Huh7細(xì)胞，分別用質(zhì)粒pCS-HBVl.3和pAAV / HBV1.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)水平。圖中可見，兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48h，上清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)均為陽(yáng)性，但兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后上清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)無顯著差異。
[0019]圖3雌性C57BL / 6小鼠注射pCS_HBVl.3質(zhì)粒建立HBV小鼠模型指標(biāo)檢測(cè)
[0020]為雌性C57BL / 6小鼠經(jīng)尾靜脈注射5 μ g pCS-HBVl.3后各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)HBV各種指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，注射后Id后即可在血清中檢測(cè)到HBsAg、HBeAg和HBV DNA,并且在注射后1周可在血清中檢測(cè)到ant1-HBc產(chǎn)生以及肝組織HBV DNA的存在，上述指標(biāo)均持續(xù)到8周均為陽(yáng)性；而在此期間均未檢測(cè)到ant1-HBs的產(chǎn)生。參見實(shí)施例2。[0021 ] 圖4雌性C57BL / 6小鼠注射pAAV_HBVl.3質(zhì)粒建立HBV小鼠模型指標(biāo)檢測(cè)
[0022]為雌性C57BL / 6小鼠經(jīng)尾靜脈注射5 μ g pAAV / HBV1.3后各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)HBV各種指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，注射后Id后即可在血清中檢測(cè)到HBsAg、HBeAg和HBVDNA,但在4周內(nèi)全部轉(zhuǎn)為陰性，同時(shí)檢測(cè)到ant1-HBs產(chǎn)生；在注射后1周可在血清中檢測(cè)到ant1-HBc產(chǎn)生以及肝組織HBV DNA的存在，注射后8周仍為陽(yáng)性。參見實(shí)施例3。
[0023]圖5雌性C57BL / 6小鼠分別注射pCS_HBVl.3和pAAV_HBVl.3質(zhì)粒后血清及肝組織DNA檢測(cè)
[0024]為雌性C57BL / 6小鼠經(jīng)尾靜脈分別注射5 μ g pCS-HBVl.3和pAAV_HBVl.3質(zhì)粒后各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)血清及肝組織DNA變化。結(jié)果顯示，pCS-HBVl.3質(zhì)粒注射小鼠血清HBV DNA陽(yáng)性持續(xù)時(shí)間顯著長(zhǎng)于pAAV-HBVl.3質(zhì)粒注射小鼠；而上述兩質(zhì)粒注射小鼠肝組織DNA在注射后56天持續(xù)陽(yáng)性，二者之間無差別。
[0025]圖6雌性C57BL / 6小鼠分別注射pCS_HBVL 3和pAAV_HBVL 3質(zhì)粒后肝組織免疫組化分析結(jié)果
[0026]為為雌性C57BL / 6小鼠經(jīng)尾靜脈分別注射5 μ g pCS-HBVl.3和pAAV-HBVl.3質(zhì)粒后5d經(jīng)免疫組化檢測(cè)肝組織HBeAg的表達(dá)。可見上述兩種質(zhì)粒注射小鼠肝組織均可檢測(cè)到HBeAg的表達(dá)。A為pCS-HBVl.3質(zhì)粒注射小鼠結(jié)果，B為pAAV-HBVl.3質(zhì)粒注射小鼠結(jié)果，C為注射NS小鼠的免疫組化結(jié)果。
[0027]圖7雌性BALB / c小鼠注射pCS_HBVl.3質(zhì)粒建立HBV小鼠模型指標(biāo)檢測(cè)
[0028]為雌性BALB / c小鼠經(jīng)尾靜脈注射5 μ g pCS-HBVl.3后各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)HBV各種指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，注射后Id后即可在血清中檢測(cè)到HBsAg、HBeAg和HBV DNA,但在注射后2周內(nèi)全部轉(zhuǎn)為陰性，并且血清中可檢測(cè)到ant1-HBs ;在注射后1周可在血清中檢測(cè)到ant1-HBc產(chǎn)生以及肝組織HBV DNA的存在。參見實(shí)施例4。
[0029]圖8雄性C57BL / 6小鼠注射pCS_HBVl.3質(zhì)粒建立HBV小鼠模型指標(biāo)檢測(cè)[0030]為雄性的C57BL / 6小鼠經(jīng)尾靜脈注射5Bg pCS_HBVl.3后各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)HBV各種指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，注射后Id后即可在血清中檢測(cè)到HBsAg、HBeAg和HBV DNA，并在注射后4周轉(zhuǎn)為陰性，并伴隨ant1-HBs產(chǎn)生；在注射后1周可在血清中檢測(cè)到ant1-HBc產(chǎn)生以及肝組織HBV DNA的存在，并在注射后8周均為陽(yáng)性。參見實(shí)施例5。
[0031 ] 圖9HI小鼠免疫計(jì)劃參見實(shí)施例7
[0032]圖10HI小鼠免疫后抗體及細(xì)胞免疫應(yīng)答檢測(cè)
[0033]為HI小鼠接受HBSS1聯(lián)合Alum和Poly I:C佐劑初免和加強(qiáng)免疫后的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示，加強(qiáng)免疫后針對(duì)于HBV S和PreSl抗體均顯著增加，細(xì)胞免疫應(yīng)答亦有所增強(qiáng)。A ant1-S檢測(cè)結(jié)果B ant1-Presl檢測(cè)結(jié)果C S肽庫(kù)刺激的ELISpot結(jié)果
[0034]圖11HI小鼠免疫后HBV DNA、HBsAg及HBeAg動(dòng)態(tài)變化檢測(cè)
[0035]為HI小鼠免疫后HBV HBV DNA、HBsAg及HBeAg動(dòng)態(tài)變化的結(jié)果，可見HBSS1兩針免疫后，血清HBV DNA完全清除，但肝組織DNA無明顯變化；HBSS1聯(lián)合Alum和Poly I:C佐劑免疫兩次后血清HBsAg和HBeAg和對(duì)照組相比顯著降低。
【具體實(shí)施方式】:
[0036]以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0037]實(shí)施例1重組質(zhì)粒pCS-HBVl.3的建立
[0038]材料及來源:
[0039]含1.3倍乙型肝炎病毒全基因(ayw亞型，GenBank:AB267090.1)的質(zhì)粒pAAV-HBVl.3由本室前期構(gòu)建(郭燕菊，王文，孫世惠，等.免疫抑制劑地塞米松可明顯延長(zhǎng)乙型肝炎病毒抗原在水動(dòng)力法轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型中的表達(dá)[J].病毒學(xué)報(bào)，2010，26(1):20-26.)；
[0040]質(zhì)粒pCS-CG 來源于 D r.Chow SA(UCLA AIDS Institute),由本室保存。
[0041]質(zhì)粒小提試劑盒，PCR產(chǎn)物回收試劑盒，DNA膠回收試劑盒、片段回收試劑盒及病毒基因組提取試劑盒購(gòu) 自天根生化科技有限公司。質(zhì)粒大提提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司。
[0042]pCS-HBVl.3質(zhì)粒構(gòu)建方法:
[0043]首先以pAAV-HBVl.3質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增HBV基因組第一個(gè)(1066-3182bp)，引物如下:上游:ACGCTGCAGATGCATGTATTCAATCTAAG(Pst I)，下游:ATAGAATTCCACCACTGCATGGCCTGAGGAT (EcoR I) ；PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳回收2116bp片段，經(jīng)Pst I,EcoR I雙酶切后經(jīng)與同樣上述兩種酶雙酶切的pCS-CG質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞；篩選含2116bp HBV基因組的陽(yáng)性克隆pCS-HBVl，經(jīng)Pst 1、EcoR I酶切及序列測(cè)序鑒定。
[0044]其次以pAAV-HBVl.3質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增HBV基因組第二個(gè)片段(0-1582bp)，引物如下:上游:CGCGAATTCCACAACCTTTCACCAAACTC(EcoR I);下游:ATAGGTACCAGATCTCGTACTGAAGGAAAG (Kpn I) ;PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳回收2116bp片段，PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳回收1582bp片段，經(jīng)EcoR 1、Kpn I雙酶切后經(jīng)與同樣上述兩種酶雙酶切的pCS-HBVl質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞；篩選含1.3倍HBV基因組的陽(yáng)性克隆pCS-HBVl.3，經(jīng)Pst 1、Kpn I酶切及序列測(cè)序鑒定。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCS-HBVl.3結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。
[0045]實(shí)施例2重組質(zhì)粒pCS-HBVl.3和pAAV-HBVl.3體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)材料及來源:
[0046]培養(yǎng)細(xì)胞株Huh7為肝來源的細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10% FBS的DMEM。
[0047]轉(zhuǎn)染試劑FuGENE HD購(gòu)自Roche公司。
[0048]HBV HBsAg、HBeAg ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海科華生物公司。
[0049]轉(zhuǎn)染方法:
[0050]接種5X 105Huh7細(xì)胞于六孔板，次日轉(zhuǎn)染前換成opt1-MEM培養(yǎng)基，每孔2ml，100ulopt1-MEM加2 μ g質(zhì)粒后混勻，再加入6 μ 1 FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻后室溫放置15min后逐滴加入到六孔板中，6h后換為含2 % FBS的DMEM后繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后48h收獲上清100 μ 1ELISA方法測(cè)定HBsAg和HBeAg的表達(dá)和分泌水平。血清HBsAg結(jié)果判定為S / C0V>1為陽(yáng)性，進(jìn)一步用羅氏新型乙肝表面抗原(HBsAg)定量檢測(cè)試劑檢測(cè)，將檢測(cè)到的 S / C0V 值轉(zhuǎn)換為 cut-off index (C0I)，以 C0I ≥ 1 為陽(yáng)性。HBeAg、HBsAb 及 HBcAb 的判定標(biāo)準(zhǔn)為0D450大于2.1倍陰性對(duì)照0D450的平均值判斷為陽(yáng)性。
[0051]結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pCS-HBVl.3和pAAV-HBVl.3體外轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后48h，均可檢測(cè)到HBsAg和HBeAg的表達(dá)，且二者表達(dá)水平無顯著差別。具體結(jié)果參見圖2。
[0052]實(shí)施例3
[0053]比較兩種HBV轉(zhuǎn)基因載體pCS-HBVl.3與pAAV-HBVl.3建立HBV成體小鼠模型
[0054]實(shí)驗(yàn)如下:
[0055]材料及來源:
[0056]動(dòng)物SPF級(jí)C57BL / 6小鼠，4-6周齡，雌性，體重18_22g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，飼養(yǎng)于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心二級(jí)動(dòng)物房。飼養(yǎng)條件按照SPF級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。
[0057]試劑:經(jīng)QIAGEN公司質(zhì)粒大量提取純化試劑盒純化的質(zhì)粒pCS_HBVl.3及pAAV-HBVl.3 ;生理鹽水(0.9%的 NaCl 溶液)。
[0058]儀器:lml、2ml及5ml注射器。
[0059]方法
[0060]高壓水動(dòng)力尾靜脈注射:雌性SPF級(jí)C57BL / 6小鼠分成兩組，每組6只，分別經(jīng)高壓水動(dòng)力尾靜脈注射5 μ g質(zhì)粒pCS-HBVl.3及pAAV-HBVl.3。具體操作如下:先將小鼠置于30瓦白熾燈泡下照射，使小鼠尾靜脈擴(kuò)張；注射前再將尾靜脈浸于37°C左右的溫水中進(jìn)一步擴(kuò)張尾靜脈；5-8秒內(nèi)將1.5-2.5ml (相當(dāng)于小鼠體重的8% -10%體積)的質(zhì)粒溶液勻速注射到小鼠體內(nèi)，注射后室溫條件下觀察小鼠反應(yīng)；
[0061]HBV指標(biāo)檢測(cè):
[0062]1.各組小鼠注射后l、3、5、7、10、14d之后相繼隔周，乙醚麻醉后內(nèi)眥靜脈取血，分離血清，以PBS1:10稀釋后用ELISA檢測(cè)試劑盒(上?？迫A)檢測(cè)血清中HBsAg、HBeAg、HBsAb及HBcAb水平。血清HBsAg結(jié)果判定為S / C0V>1為陽(yáng)性，進(jìn)一步用羅氏新型乙肝表面抗原(HBsAg)定量檢測(cè)試劑檢測(cè)，將檢測(cè)到的S / C0V值轉(zhuǎn)換為cut-off index (C0I)，以C0I≥1為陽(yáng)性。HBeAg、HBsAb及HBcAb的判定標(biāo)準(zhǔn)為0D450大于2.1倍陰性對(duì)照0D450的平均值判斷為陽(yáng)性。
[0063]2.Real-time PCR檢測(cè)小鼠血清及肝組織HBV DNA水平:熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自湖南圣湘生物科技有限公司；熒光定量PCR儀為Agilent公司生產(chǎn)的Staragene MX3005P。肝組織DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。觀察終末處死小鼠，分離肝組織，稱取30mg左右的小鼠肝組織提取，最后以50μ 1 ΤΕ溶解，分別取分離的小鼠血清和提取的肝組織 DNA5 μ 1 進(jìn)行 Real-time PCR 檢測(cè)。
[0064]結(jié)果顯示:pCS-HBVl.3注射組小鼠，在注射后1天即可在血清中檢測(cè)到HBsAg、HBeAg的表達(dá)，并且70%小鼠均可在6周內(nèi)持續(xù)陽(yáng)性；并且在注射后7天至注射后56天均可檢測(cè)到HBcAb的表達(dá)；而pAAV-HBVl.3注射組小鼠在注射后1周可在血清中檢測(cè)到高水平的HBsAg、HBeAg及HBV DNA,但在注射后28天全部轉(zhuǎn)陰，并伴隨HBsAb產(chǎn)生；而上述兩組小鼠均可在血清及肝組織中檢測(cè)到HBV DNA，在注射后56天，pCS-HBVl.3注射組肝組織HBV DNA水平高于pAAV-HBVl.3注射組；而兩組小鼠血清DNA均在注射后第Id即可檢測(cè)到，pCS-HBVl.3注射組小鼠在注射后1周血清DNA達(dá)高峰之后緩慢下降；而pAAV-HBVl.3注射組只在注射后10d檢測(cè)到，注射后14d全部轉(zhuǎn)陰。二者在肝內(nèi)均可檢測(cè)到HBeAg的表達(dá)；提示注射pCS-HBVl.3質(zhì)粒更優(yōu)于pAAV-HBVl.3建立小鼠HBV持續(xù)性感染模型。結(jié)果參見圖3、4、5。
[0065]實(shí)施例4
[0066]比較BALB / c和C57BL / 6小鼠分別注射pCS_HBVl.3建立的小鼠模型
[0067]實(shí)驗(yàn)如下:
[0068]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)BALB / c和C57BL / 6小鼠，各6只，雌性，6周齡。
[0069]注射質(zhì)粒為pCS-HBVl.3，注射量為5 μ g/只，溶于相當(dāng)于小鼠體重8% -10%體積的NS中。
[0070]注射方法高壓水動(dòng)力尾靜脈注射，小鼠經(jīng)光照尾靜脈擴(kuò)張后，將質(zhì)粒溶液在5_8s內(nèi)勻速注射到小鼠體內(nèi)。
[0071]檢測(cè)方法:按預(yù)先設(shè)定好的時(shí)間點(diǎn)經(jīng)內(nèi)眥靜脈采血。采血量為50 μ 1，經(jīng)5000rpm，離心5min收集血清，以PBS1:10稀釋后，用于HBsAg、HBeAg、HBsAb及HBcAb的ELISA檢測(cè)(使用上海科華公司的HBV ELISA檢測(cè)試劑盒);用HBV核酸定量試劑盒(PCR-熒光探針法)(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2011第340，湖南圣湘生物)按照使用說明書檢測(cè)血清及肝組織HBV DNA。
[0072]結(jié)果顯示:BALB / c小鼠高壓水動(dòng)力注射5μ g pCS-HBVl.3質(zhì)粒后，HBsAg和HBeAg在注射后5d達(dá)高峰，之后迅速下降，至注射后12d轉(zhuǎn)為陰性；與此同時(shí)，注射質(zhì)粒后7天可檢測(cè)到HBcAb ;注射質(zhì)粒后14d檢測(cè)到HBsAb ;血清HBV DNA同樣在注射質(zhì)粒后l_14d陽(yáng)性，但肝組織DNA注射后15d后仍可檢測(cè)到。而C57BL / 6小鼠高壓水動(dòng)力注射5 μ gpCS-HBVl.3質(zhì)粒后，約70%小鼠血清HBsAg、HBeAg及HBV DNA表達(dá)時(shí)間明顯長(zhǎng)于BALB /c小鼠，并且在注射后56d未檢測(cè)到HBsAb的產(chǎn)生，提示宿主的遺傳背景影響HBV在小鼠體內(nèi)的持續(xù)表達(dá)。結(jié)果參見圖3和圖7。
[0073]實(shí)施例5
[0074]雌性、雄性C57BL / 6小鼠高壓水動(dòng)力注射pCS-HBVl.3質(zhì)粒比較
[0075]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)雌性及雄性C57BL / 6小鼠，各6只，6周齡。
[0076]注射質(zhì)粒為pCS-HBVl.3，注射量為5μ g /只，溶于相當(dāng)于小鼠體重8%-10%體積的NS中。[0077]注射方法高壓水動(dòng)力尾靜脈注射，小鼠經(jīng)光照尾靜脈擴(kuò)張后，將質(zhì)粒溶液在5_8s內(nèi)勻速注射到小鼠體內(nèi)。
[0078]檢測(cè)方法:按預(yù)先設(shè)定好的時(shí)間點(diǎn)經(jīng)內(nèi)眥靜脈采血。采血量為50 μ 1，經(jīng)5000rpm，離55min收集血清，以PBS1:10稀釋后，用于HBsAg、HBeAg、HBsAb及HBcAb的ELISA檢測(cè)(使用上海科華公司的HBV ELISA檢測(cè)試劑盒);用HBV核酸定量試劑盒(PCR-熒光探針法)(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2011第340，湖南圣湘生物)按照使用說明書檢測(cè)血清及肝組織HBV DNA。
[0079]結(jié)果顯示:雄性C57BL / 6小鼠經(jīng)高壓水動(dòng)力尾靜脈注射5 μ g pCS-HBVl.3質(zhì)粒后，血清HBsAg在注射后第Id即可檢測(cè)到，但到注射后28d全部轉(zhuǎn)陰，并且伴隨HBsAb的產(chǎn)生；血清HBeAg同樣在注射后第Id檢測(cè)到，且約70%的小鼠在注射后28d轉(zhuǎn)陰；血清HBVDNA在注射后49d均可檢測(cè)到。而雌性C57BL / 6小鼠其陽(yáng)性小鼠比例及陽(yáng)性持續(xù)時(shí)間均高于雄性小鼠，提示雌性C57BL / 6小鼠更適合建立HBV持續(xù)感染模型。結(jié)果參見圖3和圖8。
[0080]實(shí)施例6
[0081 ] 肝組織HBeAg免疫組化分析:
[0082]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)C57BL / 6小鼠，雌性，6周齡。
[0083]注射質(zhì)粒為pCS-HBVl.3和pAAV-HBVl.3，注射量為5 μ g/只，溶于相當(dāng)于小鼠體重8% -10%體積的NS中。
[0084]注射方法高壓水動(dòng)力尾靜脈注射，小鼠經(jīng)光照尾靜脈擴(kuò)張后，將質(zhì)粒溶液在5_8s內(nèi)勻速注射到小鼠體內(nèi)。同時(shí)設(shè)注射NS對(duì)照鼠；免疫組化分析HBeAg的表達(dá)。
[0085]試劑:兔抗HBeAg單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，HRP標(biāo)記羊抗兔抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。
[0086]方法如下:各小鼠分別在注射后5d、42d處死小鼠，分離肝組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定織常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，切片后進(jìn)行HE染色進(jìn)行病理分析。同時(shí)石蠟切片脫蠟至水，3% H202室溫lOmin，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，正常山羊血清工作液室溫封閉，加入1:200稀釋的兔抗HBeAg的抗體4°C過夜；PBS漂洗，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，37°C孵育30min，PBS漂洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明封片，光鏡下觀察HBeAg的表達(dá)。
[0087]結(jié)果:雌性6周齡的C57BL / 6小鼠，經(jīng)高壓水動(dòng)力尾靜脈注射5 μ g pCS-HBVl.3質(zhì)粒后，肝臟均為明顯的肝細(xì)胞損傷、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、炎性反應(yīng)；且均可檢測(cè)到HBeAg的表達(dá)，HBeAg的表達(dá)，主要位于細(xì)胞核內(nèi)，少量分布于細(xì)胞質(zhì)中。結(jié)果參見圖6。
[0088]實(shí)施例7
[0089]HBV小鼠模型在疫苗評(píng)價(jià)中的應(yīng)用
[0090]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雌性C57BL / 6小鼠，各6只，6周齡。
[0091]疫苗及佐劑CHO細(xì)胞表達(dá)CHO細(xì)胞表達(dá)的含S+PreSl融合抗原的顆粒疫苗HBSS1，為華北制藥股份有限公司產(chǎn)品，用注射用生理鹽水配制成lOOyg / ml ;氫氧化鋁佐劑由華北制藥集團(tuán)提供，濃度為2mg / ml。聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly I:C):購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司，用注射用生理鹽水配制成2mg / ml ο
[0092]方法:小鼠經(jīng)高 壓尾靜脈注射5 μ g pCS-HBVl.3質(zhì)粒后，將陽(yáng)性鼠隨機(jī)分為3組，每組 6 只。分別為 Alum+Poly I:C、HBSS1+A1 (OH) 3、HBSS1+A1 (OH) 3+Poly I:C 免疫組；其中每劑中抗原含量皆為1.25ug，A1(0H)3含量為lmg/mL，Poly I:C含量為50 μ g，注射體積為0.lml ;肌肉注射，共免疫兩次，間隔2周；每次免疫后2周經(jīng)內(nèi)眥靜脈采血分離血清；末次免疫后2周將小鼠脫頸處死后無菌取脾，研磨分離獲得脾細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度后立即用于ELISPOT檢測(cè)。參見圖9
[0093]用于HBsAg、HBeAg及HBsAb及的ELISA檢測(cè)(使用上?？迫A公司的HBV ELISA檢測(cè)試劑盒)；乙型肝炎病毒前S1抗體(抗S1)診斷試劑盒購(gòu)自上海阿爾法生物技術(shù)有限公司。用HBV核酸定量試劑盒(PCR-熒光探針法)(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2011第340，湖南圣湘生物)按照使用說明書檢測(cè)血清及肝組織HBV DNA。小鼠IFN-y細(xì)胞因子ELISPOT試劑購(gòu)自BD公司。
[0094]按說明書操作，在包被抗用抗IFN-Y抗體后，每孔加入100ul含S或PreSl抗原多肽的脾細(xì)胞培養(yǎng)懸液，每孔脾細(xì)胞數(shù)為5 X 105個(gè)，37°C 5%C02靜置培養(yǎng)18h ;棄去培養(yǎng)液后，分步加入檢測(cè)抗體和顯色液顯色，Bioreader4000斑點(diǎn)分析儀計(jì)數(shù)斑點(diǎn)形成數(shù)(SFC)。根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)的多少判斷特異性殺傷T細(xì)胞的數(shù)量，該數(shù)量的多少與細(xì)胞免疫強(qiáng)度呈正相關(guān)。結(jié)果見圖6。
[0095]結(jié)果:小鼠經(jīng)高壓尾靜脈注射5μ g pCS-HBVl.3質(zhì)粒后免疫，同對(duì)照組相比，HBSS1聯(lián)合佐劑組在第二次免疫后均可誘導(dǎo)高水平的S和PreSl特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，見圖10 ;HBSS1聯(lián)合Alum和PolyI:C佐劑免疫兩次后血清HBsAg和HBeAg和對(duì)照組相比顯著降低。并且血清HBV DNA完全清除，但肝組織DNA無明顯變化，見圖11。
【權(quán)利要求】
1.本發(fā)明所述的基于慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒建立小鼠模型技術(shù)，其技術(shù)特征是將攜帶多拷貝HBV基因組的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒pCS-HBVl.3用于制作HBV小鼠模型。
2.依據(jù)權(quán)利要求1，該重組質(zhì)粒骨架來自于慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒pCS-CG，以HBV基因取代其多克隆位點(diǎn)的EGFP表達(dá)盒。
3.依據(jù)權(quán)利要求1，HBV基因組DNA的拷貝數(shù)為1.3個(gè)拷貝。
4.依據(jù)權(quán)利要求1，所述的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒PCS-HBV1.3是經(jīng)尾靜脈高壓水動(dòng)力注射的方法感染小鼠肝細(xì)胞而建立的HBV小鼠模型。
5.依據(jù)權(quán)利要求1，所述的HBV小鼠模型為HBV持續(xù)性感染模型。
6.依據(jù)權(quán)利要求1，所述的HBV小鼠模型為雌性4-6周齡C57BL/ 6小鼠。
【文檔編號(hào)】A01K67/027GK103642839SQ201310581982
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】譚文杰, 揣俠, 王文, 陳紅, 楊揚(yáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所