控制害蟲的方法

控制害蟲的方法
【專利摘要】本發明涉及一種控制斜紋夜蛾害蟲的方法，包括：將斜紋夜蛾害蟲與Cry1F蛋白接觸。本發明通過植物體內產生能夠殺死斜紋夜蛾的Cry1F蛋白來控制斜紋夜蛾害蟲；與現有技術使用的農業防治方法、化學防治方法和物理防治方法相比，本發明對植物進行全生育期、全植株的保護以防治斜紋夜蛾害蟲的侵害，且無污染、無殘留，效果穩定、徹底，簡單、方便、經濟。
【專利說明】控制害蟲的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種控制害蟲的方法，特別是涉及一種用在植物中表達的CrylF蛋白來控制斜紋夜蛾為害植物的方法。
【背景技術】
[0002]斜紋夜蛾(PiOdenia Iitura)屬鱗翅目夜蛾科，為雜食性和暴食性害蟲，為害寄主相當廣泛，除玉米和大豆外，還可危害包括瓜、茄、豆、蔥、韭菜、菠菜以及十字花科蔬菜、糧食、經濟作物等近100科、300多種植物；斜紋夜蛾屬世界性分布，國內各地都有發生，主要發生在長江流域和黃河流域。斜紋夜蛾主要以幼蟲為害全株、小齡時群集葉背啃食；3齡后分散為害葉片、嫩莖、老齡幼蟲可蛀食果實。
[0003]玉米和大豆是中國重要的糧食作物，每年因斜紋夜蛾造成的糧食損失巨大，更甚者影響到當地人口的生存狀況。為了防治斜紋夜蛾，人們通常采用的主要防治方法有:農業防治、化學防治和物理防治。
[0004]農業防治是把整個農田生態系統多因素的綜合協調管理，調控作物、害蟲、環境因素、創造一個有利于作物生長而不利于斜紋夜蛾發生的農田生態環境。如清除雜草，收獲后翻耕曬土或灌水，以破壞或惡化其化蛹場所，有助于減少蟲源；或者結合管理隨手摘除卵塊和群集危害的初孵幼蟲，以減少蟲源。因農業防治大多為預防性措施，應用有一定的局限性，不能作為應急措施，在斜紋夜蛾爆發時就顯得無能為力。
[0005]化學防治即農藥防治，是利用化學殺蟲劑來殺滅害蟲，是斜紋夜蛾綜合治理的重要組成部分，它具有快速、方便、簡便和高經濟效益的特點，特別是斜紋夜蛾大發生的情況下，是必不可少的應急措施，它可以在斜紋夜蛾造成危害前將其消滅。目前化學防治方法主要是藥劑噴施。但化學防治也有其局限性，如使用不當往往會導致農作物發生藥害、害蟲產生抗藥性，以及殺傷天敵、污染環境，使農田生態系統遭到破壞和農藥殘留對人、畜的安全構成威脅等不良后果。
[0006]物理防治主要根據害蟲對環境條件中各種物理因素的反應，利用各種物理因素如光、電、色、溫濕度等及機械設備進行誘殺、輻射不育等方法來防治害蟲。目前應用比較廣泛的方法主要有點燈誘蛾、糖醋誘殺和柳枝蘸灑500倍敵百蟲誘殺蛾子；上述方法雖然有不同程度的防治效果，但是在操作上具有一定的難度。
[0007]為了解決農業防治、化學防治和物理防治在實際應用中的局限性，科學家們經過研究發現將編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉入植物中，可獲得一些抗蟲轉基因植物以防治植物蟲害。CrylF殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的一種，是由蘇云金芽孢桿菌產生的不溶性伴孢結晶蛋白。
[0008]CrylF蛋白被昆蟲攝入進入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲中腸的堿性pH環境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉變成活性片段；活性片段和昆蟲中腸上皮細胞膜上表面上受體結合，插入腸膜，導致細胞膜出現穿孔病灶，破壞細胞膜內外的滲透壓變化及PH平衡等，擾亂昆蟲的消化過程，最終導致其死亡。[0009]已證明轉CrylF基因的植株可以抵抗小地老虎等鱗翅目(Lepidoptera)害蟲的侵害，然而，至今尚無關于通過產生表達CrylF蛋白的轉基因植株來控制斜紋夜蛾對植物為害的報道。

【發明內容】

[0010]本發明的目的是提供一種控制害蟲的方法，首次提供了通過產生表達CrylF蛋白的轉基因植株來控制斜紋夜蛾對植物為害的方法，且有效克服現有技術農業防治、化學防治和物理防治等技術缺陷。
[0011]為實現上述目的，本發明提供了一種控制斜紋夜蛾害蟲的方法，包括將斜紋夜蛾害蟲與CrylF蛋白接觸。
[0012]優選地,所述CrylF蛋白為CrylFa蛋白。
[0013]進一步地,所述CrylFa蛋白存在于產生所述CrylFa蛋白的植物細胞中,所述斜紋夜蛾害蟲通過攝食所述植物細胞與所述CrylFa蛋白接觸。
[0014]更進一步地,所述CrylFa蛋白存在于產生所述CrylFa蛋白的轉基因植物中，所述斜紋夜蛾害蟲通過攝食所述轉基因植物的組織與所述CrylFa蛋白接觸，接觸后所述斜紋夜蛾害蟲生長受到抑制并最終導致死亡，以實現對斜紋夜蛾為害植物的控制。
[0015]所述轉基因植物可以處于任意生育期。
[0016]所述轉基因植物的組織可以為葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥、花絲或果實。
[0017]所述對斜紋夜蛾為害植物的控制不因種植地點的改變而改變。
[0018]所述對斜紋夜蛾為害植物的控制不因種植時間的改變而改變。
[0019]所述植物可以來自玉米、大豆`、棉花、甘薯、芋、蓮、田菁、煙草、甜菜、白菜或茄子。
[0020]所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述CrylFa蛋白的多核苷酸的植物。
[0021]優選地，所述CrylFa蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。所述CrylFa蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列。
[0022]在上述技術方案的基礎上，所述植物還可以產生至少一種不同于所述CrylFa蛋白的第二種核苷酸。
[0023]進一步地，所述第二種核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質、Vip類殺蟲蛋白質、蛋白酶抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過氧化物酶。
[0024]優選地,所述第二種核苷酸可以編碼CrylAb蛋白、CrylAc蛋白、CrylBa蛋白或Vip3A蛋白。
[0025]更進一步地，所述第二種核苷酸包括SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
[0026]可選擇地，所述第二種核苷酸為抑制目標昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
[0027]為實現上述目的，本發明還提供了一種CrylF蛋白質控制斜紋夜蛾害蟲的用途。
[0028]在本發明中，CrylF蛋白在一種轉基因植物中的表達可以伴隨著一個或多個Cry類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質的表達。這種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉基因植物中共同表達可以通過遺傳工程使植物包含并表達所需的基因來實現。另外，一種植物(第I親本)可以通過遺傳工程操作表達CrylF蛋白質，第二種植物(第2親本)可以通過遺傳工程操作表達Cry類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質。通過第I親本和第2親本雜交獲得表達引入第I親本和第2親本的所有基因的后代植物。
[0029]RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。因此在本發明中可以使用RNAi技術特異性剔除或關閉目標昆蟲害蟲中特定基因的表達。
[0030]斜紋夜蛾(ProdeniaIitura)與小地老虎(Agrotis ypsilon Rottemberg)同屬鱗翅目夜蛾科，為雜食性害蟲，均為害玉米、大豆、棉花、甘薯等。盡管如此，斜紋夜蛾與小地老虎在生物學上是清晰的、截然不同的兩個物種，至少存在以下主要區別:
[0031]1、分布區域不同。斜紋夜蛾屬世界性分布，中國各地都有發生，主要發生在長江流域的江西、江蘇、湖南、湖北、浙江、安徽和黃河流域的河南、河北、山東等省。而草地貪夜蛾主要分布在境外，包括美洲的加拿大、墨西哥、美國、阿根廷、玻利維亞、巴西、智利、哥倫比亞、厄瓜多爾、法屬圭亞那、圭亞那、巴拉圭、秘魯、蘇里南、烏拉圭、委內瑞拉及整個中美洲和加勒比海地區。而小地老虎是世界性的害蟲，在我國各地也均有分布，尤以雨量豐富、氣候濕潤的長江流域和東南沿海發生量大，東北地區多發生在東部和南部濕潤地區。
[0032]2、為害習性不同。斜紋夜蛾以幼蟲為害全株，小齡時群集葉背啃食下表皮及葉肉，僅留上表皮呈透明斑；3齡后分散為害葉片、嫩莖；4齡以后進入暴食，咬食葉片，僅留主脈；老齡幼蟲可蛀食果實；其食性既雜又危害各器官，老齡時形成暴食，是一種危害性很大的害蟲。而小地老虎屬地下害蟲，1-2齡幼蟲晝夜均可群集于幼苗頂心嫩葉處取食為害；3齡后分散，幼蟲行動敏捷、有假死習性、對光線極為敏感、受到驚擾即卷縮成團，白天潛伏于表土的干濕層之間，夜晚出土從地面將幼苗植株咬斷拖入土穴、或咬食未出土的種子，幼苗主莖硬化后改食嫩葉和葉片及生長點，食物不足或尋找越冬場所時，有遷移現象；高齡幼蟲剪苗率高，取食量大。
[0033]3、形態特征不同。
[0034]1)卵形態不同:斜紋夜蛾的卵呈扁平的半球狀，初產黃白色，后變為暗灰色，塊狀粘合在一起，上覆黃褐色絨毛；而小地老虎的卵成饅頭形，具縱橫隆線，初產乳白色，漸變黃色，孵化前卵一頂端具黑點。
[0035]2)幼蟲形態不同:斜紋夜蛾幼蟲體長33-50毫米，頭部黑褐色，胸部多變，從土黃色到黑綠色都有，體表散生小白點，冬節有近似三角形的半月黑斑一對，幼蟲一般6齡；而小地老虎幼蟲圓筒形，老熟幼蟲體長37-50_，頭部褐色，具黑褐色不規則網紋，體灰褐至暗褐色，體表粗糙、布大小不一而彼此分離的顆粒，背線、亞背線及氣門線均黑褐色，前胸背板暗褐色，黃褐色臀板上具兩條明顯的深褐色縱帶，胸足與腹足黃褐色。
[0036]3)蛹形態不同:斜紋夜蛾的蛹長15-20_，圓筒形，紅褐色，尾部有一對短刺；而小地老虎的蛹長18-24mm，赤褐有光，口器與翅芽末端相齊，均伸達第4腹節后緣，腹部第4_7節背面前緣中央深褐色，且有粗大的刻點，兩側的細小刻點延伸至氣門附近，第5-7節腹面前緣也有細小刻點，腹末端具短臀棘I對。
[0037]4)成蟲形態不同:斜紋夜蛾成蟲體長14-20mm左右，翅展35-46mm，體暗褐色，胸部背面有白色叢毛，前翅灰褐色，花紋多，內橫線和外橫線白色、呈波浪狀、中間有明顯的白色斜闊帶紋，所以稱斜紋夜蛾；而小地老虎成蟲體長17-23_、翅展40-54_，頭、胸部背面暗褐色，足褐色，前足脛、跗節外緣灰褐色，中后足各節末端有灰褐色環紋，前翅褐色，前緣區黑褐色，外緣以內多暗褐色，基線淺褐色，黑色波浪形內橫線雙線，黑色環紋內有一圓灰斑，腎狀紋黑色具黑邊、其外中部有一楔形黑紋伸至外橫線，中橫線暗褐色波浪形，雙線波浪形外橫線褐色，不規則鋸齒形亞外緣線灰色、其內緣在中脈間有三個尖齒，亞外緣線與外橫線間在各脈上有小黑點，外緣線黑色，外橫線與亞外緣線間淡褐色，亞外緣線以外黑褐色，后翅灰白色，縱脈及緣線褐色，腹部背面灰色。
[0038]4、生長習性和發生規律不同。斜紋夜蛾一年發生4代(華北)-9代(廣東)，一般以老熟幼蟲或蛹在田基邊雜草中越冬，廣州地區無真正越冬現象；在長江流域以北的地區，該蟲冬季易被凍死，越冬問題尚未定論，推測當地蟲源可能從南方遷飛過去；長江流域多在7-8月大發生，黃河流域則多在8-9月大發生。成蟲夜出活動，飛翔力較強，具趨光性和趨化性，對糖醋酒等發酵物尤為敏感。每只雌蛾能產卵3-5塊，每塊約有卵位100-200個，卵多產于葉背的葉脈分叉處，以茂密、濃綠的作物產卵較多，堆產，卵塊常覆有鱗毛而易被發現，卵的孵化適溫是24°C左右；幼蟲在氣溫25°C時，歷經14-20天，初孵幼蟲具有群集危害習性，3齡以后則開始分散，老齡幼蟲有晝伏性和假死性，白天多潛伏在土縫處，傍晚爬出取食，遇驚就會落地蜷縮作假死狀。當食料不足或不當時，幼蟲可成群遷移至附近田塊危害，故又有“行軍蟲”的俗稱；化蛹的適合土壤濕度是土壤含水量在20%左右，蛹期為11-18天。斜紋夜蛾是一種喜溫性而又耐高溫的間歇猖獗危害的害蟲，各蟲態的發育適溫為28-30°C，但在高溫下(33-40°C)，生活也基本正常；抗寒力很弱，在冬季0°C左右的長時間低溫下，基本上不能生存。一般高溫年份和季節有利其發育、繁殖，低溫則易引致蟲蛹大量死亡。該蟲食性雖雜，但食料情況，包括不同的寄主，甚至同一寄主不同發育階段或器官，以及食料的豐缺，對其生育繁殖都有明顯的影響。間種、復種指數高或過度密植的田塊有利其發生。天敵有寄生幼蟲的小繭蜂和多角體病毒等。而小地老虎一年發生3-4代，老熟幼蟲或蛹在土內越冬；早春3月上旬成蟲開始出現，一般在3月中下旬和4月上中旬會出現兩個發蛾盛期；成蟲白天不活動，傍晚至前半夜活動最盛，喜歡吃酸、甜、酒味的發酵物和各種花蜜，并有趨光性，幼蟲共分6齡，1、2齡幼蟲先躲伏在雜革或植株的心葉里，晝夜取食，這時食量很小，為害也不十分顯著；3齡后白天躲到表土下，夜間出來為害；5、6齡幼蟲食量大增，每條幼蟲一夜能咬斷菜苗4-5株，多的達10株以上；幼蟲3齡后對藥劑的抵抗力顯著增加；3月底到4月中旬是第I代幼蟲為害的嚴重時期；發生世代從10月到第2年4月都見發生和為害；西北地區二到三代，長城以北一般年二到三代，長城以南黃河以北年三代，黃河以南至長江沿岸年四代，長江以南年四到五代，南亞熱帶地區年六至七代；無論年發生代數多少，在生產上造成嚴重為害的均為第一代幼蟲；南方越冬代成蟲二月份出現，全國大部分地區羽化盛期在3月下旬至4月上、中旬，寧夏、內蒙古為4月下旬；小地老虎成蟲多在下午3時至晚上10時羽化，白天潛伏于雜物及縫隙等處，黃昏后開始飛翔、覓食，3-4天后交配、產卵；卵散產于低矮葉密的雜草和幼苗上、少數產于枯葉、土縫中，近地面處落卵最多，每雌產卵800-1000粒、多達2000粒；卵期約5天左右，幼蟲6齡、個別7-8齡，幼蟲期在各地相差很大，但第一代約為30-40天； 幼蟲老熟后在深約5cm土室中化蛹，蛹期約9-19天；高溫對小地老虎的發育與繁殖不利，因而夏季發生數量較少，適宜生存溫度為15°C -25°C;冬季溫度過低，小地老虎幼蟲的死亡率增高；凡地勢低濕，雨量充沛的地方，發生較多；頭年秋雨多、土壤濕度大、雜草叢生有利于成蟲產卵和幼蟲取食活動，是第二年大發生的預兆；但降水過多，濕度過大，不利于幼蟲發育，初齡幼蟲淹水后很易死亡；成蟲產卵盛期土壤含水量在15-20%的地區為害較重；沙壤土，易透水、排水迅速，適于小地老虎繁殖，而重黏土和沙土則發生較輕。
[0039]綜合上述，可確定斜紋夜蛾與小地老虎是兩種害蟲，且親緣關系較遠，無法交配產生后代。
[0040]本發明中所述的植物、植物組織或植物細胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細胞內的任何遺傳物質，且包括細胞核和質體和線粒體基因組。
[0041]本發明中所述的“接觸”，是指昆蟲和/或害蟲觸碰、停留和/或取食植物、植物器官、植物組織或植物細胞，所述植物、植物器官、植物組織或植物細胞既可以是其體內表達殺蟲蛋白，還可以是所述植物、植物器官、植物組織或植物細胞的表面具有殺蟲蛋白和/或具有廣生殺蟲蛋白的微生物。
[0042]本發明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細胞中編碼蛋白質或多肽。本領域技術人員很容易認識到，可以將本發明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調控序列控制下。
[0043]本領域技術人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補，反之亦然。由于DNA在植物中復制產生了 DNA的其它互補鏈。這樣，本發明包括對序列表中示例的多核苷酸及其互補鏈的使用。本領域常使用的“編碼鏈”指與反義鏈結合的鏈。為了在體內表達蛋白質，典型將DNA的一條鏈轉錄為一條mRNA的互補鏈，它作為模板翻譯出蛋白質。mRNA實際上是從DNA的“反義”鏈轉錄的。“有義”或“編碼”鏈有一系列密碼子(密碼子是三個核苷酸，一次讀三個可以產生特定氨基酸)，其可作為開放閱讀框(ORF)閱讀來形成目的蛋白質或肽。本發明還包括與示例的DNA有相當功能的RNA和PNA (肽核酸)。
[0044]本發明中核酸分子或其片段在嚴格條件下與本發明CrylFa基因雜交。任何常規的核酸雜交或擴增方法都可以用于鑒定本發明CrylFa基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進行特異性雜交。本發明中，如果兩個核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結構，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進行特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全的互補性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分子的“互補物”。本發明中，當一個核酸分子的每一個核苷酸都與另一個核酸分子的對應核苷酸互補時，則稱這兩個核酸分子顯示出“完全互補性”。如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩定性相互雜交從而使它們在至少常規的“低度嚴格”條件下退火且彼此結合，則稱這兩個核酸分子為“最低程度互補”。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩定性相互雜交從而使它們在常規的“高度嚴格”條件下退火且彼此結合，則稱這兩個核酸分子具有“互補性”。從完全互補性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個分子形成雙鏈結構。為了使一個核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩定的雙鏈結構。
[0045]本發明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補鏈發生特異性雜交。促進DNA雜交的適合的嚴格條件，例如，大約在45°C條件下用6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50°C條件下用
2.0XSSC洗滌，這些條件對本領域技術人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴格條件的約2.0父55(:、501:到高度嚴格條件的約0.2\55(:、501:。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴格條件的室溫約22°C，升高到高度嚴格條件的約65°C。溫度條件和鹽濃度可以都發生改變，也可以其中一個保持不變而另一個變量發生改變。優選地，本發明所述嚴格條件可為在6XSSC、0.5%SDS溶液中，在65°C下與SEQ ID N0:3或SEQ IDNO:4發生特異性雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS和1XSSC、0.1%SDS各洗膜I次。
[0046]因此，具有抗蟲活性并在嚴格條件下與本發明SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO:4雜交的序列包括在本發明中。這些序列與本發明序列至少大約40%-50%同源，大約60%、65%或 70% 同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同源性。
[0047]本發明中所述的基因和蛋白質不但包括特定的示例序列，還包括保存了所述特定示例的蛋白質的殺蟲活性特征的部分和/片段(包括與全長蛋白質相比在內和/或末端缺失)、變體、突變體、取代物(有替代氨基酸的蛋白質)、嵌合體和融合蛋白。所述“變體”或“變異”是指編碼同一蛋白或編碼有殺蟲活性的等價蛋白的核苷酸序列。所述“等價蛋白”是指與權利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗斜紋夜蛾害蟲的生物活性的蛋白。
[0048]本發明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達的序列)，前述序列的長度可存在變化，但長度足以確保(編碼)蛋白質為昆蟲毒素。
[0049]使用標準技術可以修飾基因和容易的構建基因變異體。例如，本領域熟知制造點突變的技術。又例如美國專利號5605793描述了在隨機斷裂后使用DNA重裝配產生其它分子多樣性的方法。可以使用商業化核酸內切酶制造全長基因的片段，并且可以按照標準程序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶諸如Bal31或定點誘變從這些基因的末端系統地切除核苷酸。還可以使用多種限制性內切酶獲取編碼活性片段的基因。可以使用蛋白酶直接獲得這些毒素的活性片段。
[0050]本發明可以從B.t.分離物和/或DNA文庫衍生出等價蛋白和/或編碼這些等價蛋白的基因。有多種方法獲取本發明的殺蟲蛋白。例如，可以使用本發明公開和要求保護的殺蟲蛋白的抗體從蛋白質混合物鑒定和分離其它蛋白。特別地，抗體可能是由蛋白最恒定和與其它B.t.蛋白最不同的蛋白部分`引起的。然后可以通過免疫沉淀、酶聯免疫吸附測定(ELISA)或western印跡方法使用這些抗體專一地鑒定有特征活性的等價蛋白。可使用本領域標準程序容易的制備本發明中公開的蛋白或等價蛋白或這類蛋白的片段的抗體。然后可以從微生物中獲得編碼這些蛋白的基因。
[0051]由于遺傳密碼子的豐余性，多種不同的DNA序列可以編碼相同的氨基酸序列。產生這些編碼相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本領域技術人員的技術水平內。這些不同的DNA序列包括在本發明的范圍內。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但實質上不影響殺蟲活性的序列，亦包括保留殺蟲活性的片段。
[0052]本發明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領域的常規技術，優選這種氨基酸變化為:小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常約1-30個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個殘基長。
[0053]保守取代的實例是在下列氨基酸組內發生的取代:堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些氨基酸取代在本領域內是眾所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hi 11在1979年紐約學術出版社(Academic Press)出版的《Protein》中進行了描述。最常見的互換有Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 和 Asp/Gly,以及它們相反的互換。
[0054]對于本領域的技術人員而言顯而易見地，這種取代可以在對分子功能起重要作用的區域之外發生，而且仍產生活性多肽。對于由本發明的多肽，其活性必需的并因此選擇不被取代的氨基酸殘基，可以根據本領域已知的方法，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變進行鑒定(如參見，Cunningham 和 Wells, 1989, Science244: 1081-1085)。后一技術是在分子中每一個帶正電荷的殘基處引入突變，檢測所得突變分子的抗蟲活性，從而確定對該分子活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點也可以通過其三維結構的分析來測定，這種三維結構可由核磁共振分析、結晶學或光親和標記等技術測定(參見，如de Vos等，1992，Science255:306-312 ；Smith 等，1992，J.Mol.Biol224:899_904 ；fflodaver 等，1992，FEBSLetters309:59_64)。
[0055]在本發明中，CrylF蛋白包括但不限于 CrylFa2、CrylFa3> CrylFb3> CrylFb6 或CrylFb7蛋白，或者與上述蛋白的氨基酸序列具有至少70%同源性且對斜紋夜蛾具有殺蟲活性的殺蟲片段或功能區域。
[0056]因此，與序列I和/或2所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本發明中。這些序列與本發明序列類似性/相同性典型的大于60%，優選的大于75%，更優選的大于80%，甚至更優選的大于90%，并且可以大于95%。也可以根據更特定的相同性和/或類似性范圍定義本發明的優選的多核苷酸和蛋白質。例如與本發明示例的序列有49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的相同性和 / 或類似性。
[0057]本發明中所述調控序列包括但不限于啟動子、轉運肽、終止子，增強子，前導序列，內含子以及其它可操作地連接到所述Vip類蛋白和Cry類蛋白的調節序列。
[0058]所述啟動子為植物中可表達的啟動子，所述的“植物中可表達的啟動子”是指確保與其連接的編碼序列在植物細胞內進行表達的啟動子。植物中可表達的啟動子可為組成型啟動子。指導植物內組成型表達的啟動子的示例包括但不限于，來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子、玉米ubi啟動子、水稻G0S2基因的啟動子等。備選地，植物中可表達的啟動子可為組織特異的啟動子，即該啟動子在植物的一些組織內如在綠色組織中指導編碼序列的表達水平高于植物的其他組織(可通過常規RNA試驗進行測定)，如PEP羧化酶啟動子。備選地，植物中可表達的啟動子可為創傷誘導啟動子。創傷誘導啟動子或指導創傷誘導的表達模式的啟動子是指當植物經受機械或由昆蟲啃食引起的創傷時，啟動子調控下的編碼序列的表達較正常生長條件下有顯著提高。創傷誘導啟動子的示例包括但不限于，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因(Pin I和pin II)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動子。
[0059]所述轉運肽(又稱分泌信號序列或導向序列)是指導轉基因產物到特定的細胞器或細胞區室，對受體蛋`白質來說，所述轉運肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉運肽序列靶向葉綠體，或者利用‘KDEL’保留序列靶向內質網，或者利用大麥植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。
[0060]所述前導序列包含但不限于，小RNA病毒前導序列，如EMCV前導序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區)；馬鈴薯Y病毒組前導序列，如MDMV (玉米矮縮花葉病毒)前導序列；人類免疫球蛋白質重鏈結合蛋白質(BiP);苜蓿花葉病毒的外殼蛋白質mRNA的不翻譯前導序列(AMV RNA4);煙草花葉病毒(TMV)前導序列。
[0061]所述增強子包含但不限于，花椰菜花葉病毒(CaMV)增強子、玄參花葉病毒(FMV)增強子、康乃馨風化環病毒(CERV)增強子、木薯脈花葉病毒(CsVMV)增強子、紫茉莉花葉病毒(MMV)增強子、夜香樹黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生褪綠線條花葉病毒(PCLSV)增強子。
[0062]對于單子葉植物應用而言，所述內含子包含但不限于，玉米hsp70內含子、玉米泛素內含子、Adh內含子1、蔗糖合酶內含子或水稻Actl內含子。對于雙子葉植物應用而言，所述內含子包含但不限于，CAT-1內含子、pKANNIBAL內含子、PIV2內含子和“超級泛素”內含子。
[0063]所述終止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號序列，包括但不限于，來源于農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于蛋白酶抑制劑II (pin II)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信號序列和來源于α -微管蛋白(a -tubulin)基因的多聚腺苷酸化信號序列。
[0064]本發明中所述“有效連接”表示核酸序列的聯結，所述聯結使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。在本發明中所述“有效連接”可以為將啟動子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉錄受到該啟動子控制和調控。當感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達時“有效連接”表示:啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉錄物融合并且想要實現編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得得到的轉錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實現編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得5’`非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結，并且連接方式使得得到的翻譯產物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關系是符合讀碼框的。可以“有效連接”的核酸序列包括但不限于:提供基因表達功能的序列(即基因表達元件，例如啟動子、5’非翻譯區域、內含子、蛋白編碼區域、3’非翻譯區域、聚腺苷化位點和/或轉錄終止子)、提供DNA轉移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點特異性重組酶識別位點、整合酶識別位點)、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標記物、生物合成基因)、提供可計分標記物功能的序列、體外或體內協助序列操作的序列(即多接頭序列、位點特異性重組序列)和提供復制功能的序列(即細菌的復制起點、自主復制序列、著絲粒序列)。
[0065]本發明中所述的“殺蟲”是指對農作物害蟲是有毒的。更具體地，目標昆蟲是斜紋夜蛾害蟲。
[0066]本發明中CrylF蛋白對斜紋夜蛾害蟲具有毒性。本發明中的植物，特別是大豆和玉米，在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含編碼Cry IF蛋白的核苷酸序列，斜紋夜蛾害蟲通過攝食植物組織與該蛋白接觸，接觸后斜紋夜蛾害蟲生長受到抑制并最終導致死亡。抑制是指致死或亞致死。同時，植物在形態上應是正常的，且可在常規方法下培養以用于產物的消耗和/或生成。此外，該植物可基本消除對化學或生物殺蟲劑的需要(所述化學或生物殺蟲劑為針對CrylF蛋白所靶向的斜紋夜蛾害蟲的殺蟲劑)。
[0067]植物材料中殺蟲晶體蛋白(ICP)的表達水平可通過本領域內所描述的多種方法進行檢測，例如通過應用特異引物對組織內產生的編碼殺蟲蛋白質的mRNA進行定量，或直接特異性檢測產生的殺蟲蛋白質的量。
[0068]可以應用不同的試驗測定植物中ICP的殺蟲效果。本發明中目標昆蟲主要為斜紋夜蛾。
[0069]本發明中，所述CrylF蛋白可以具有序列表中SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。除了包含CrylF蛋白的編碼區外，也可包含其他元件，例如編碼選擇性標記的蛋白質。
[0070]此外，包含編碼本發明CrylF蛋白的核苷酸序列的表達盒在植物中還可以與至少一種編碼除草劑抗性基因的蛋白質一起表達，所述除草劑抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敵草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、對除草劑茅草枯的抗性基因、對氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制劑(如PPT)的抗性基因，從而獲得既具有高殺蟲活性、又具有除草劑抗性 的轉基因植物。
[0071 ] 本發明中，將外源DNA導入植物，如將編碼所述CrylF蛋白的基因或表達盒或重組載體導入植物細胞，常規的轉化方法包括但不限于，農桿菌介導的轉化、微量發射轟擊、直接將DNA攝入原生質體、電穿孔或晶須硅介導的DNA導入。
[0072]本發明提供了一種控制害蟲的方法，具有以下優點:
[0073]1、內因防治。現有技術主要是通過外部作用即外因來控制斜紋夜蛾害蟲的為害，如農業防治、化學防治和物理防治；而本發明是通過植物體內產生能夠殺死斜紋夜蛾的CrylF蛋白來控制斜紋夜蛾害蟲的，即通過內因來防治。
[0074]2、無污染、無殘留。現有技術使用的化學防治方法雖然對控制斜紋夜蛾害蟲的為害起到了一定作用，但同時也對人、畜和農田生態系統帶來了污染、破壞和殘留；使用本發明控制斜紋夜蛾害蟲的方法，可以消除上述不良后果。
[0075]3、全生育期防治。現有技術使用的控制斜紋夜蛾害蟲的方法都是階段性的，而本發明是對植物進行全生育期的保護，轉基因植物(CrylF蛋白)從發芽、生長，一直到開花、結果，都可以避免遭受斜紋夜蛾的侵害。
[0076]4、全植株防治。現有技術使用的控制斜紋夜蛾害蟲的方法大多是局部性的，如葉面噴施；而本發明是對整個植株進行保護，如轉基因植物(CrylF蛋白)的葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥、花絲、果實等都是可以抵抗斜紋夜蛾侵害的。
[0077]5、效果穩定。現有技術使用的無論是農業防治方法還是物理防治方法都需要利用環境條件對害蟲進行防治，可變因素較多；本發明是使所述CrylF蛋白在植物體內進行表達，有效地避免了環境條件不穩定的缺陷，且本發明轉基因植物(CrylF蛋白)的防治效果在不同地點、不同時間、不同遺傳背景也都是穩定一致的。
[0078]6、簡單、方便、經濟。現有技術使用的物理防治方法在農業生產操作上具有一定的難度；本發明只需種植能夠表達CrylF蛋白的轉基因植物即可，而不需要采用其它措施，從而節省了大量人力、物力和財力。
[0079]7、效果徹底。現有技術使用的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其效果是不徹底的，只起到減輕作用；而本發明轉基因植物(CrylF蛋白)可以造成初孵斜紋夜蛾幼蟲的大量死亡，且對小部分存活幼蟲發育進度造成極大的抑制，3天后幼蟲基本仍處于初孵狀態或介于初孵-陰性對照狀態之間，都是明顯的發育不良，且已停止發育，轉基因植物大體上只受到輕微損傷。
[0080]下面通過附圖和實施例，對本發明的技術方案做進一步的詳細描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0081]圖1為本發明控制害蟲的方法的含有CrylFa-Ol核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T構建流程圖；
[0082]圖2為本發明控制害蟲的方法的含有CrylFa-Ol核苷酸序列的重組表達載體DBN100014構建流程圖；
[0083]圖3為本發明控制害蟲的方法的含有CrylFa-Ol核苷酸序列的重組表達載體DBN100015構建流程圖；
[0084]圖4為本發明控制害蟲的方法的轉基因玉米植株接種斜紋夜蛾的抗蟲效果圖；
[0085]圖5為本發明控制害蟲的方法的轉基因大豆植株接種斜紋夜蛾的抗蟲效果圖。
【具體實施方式】
[0086]下面通過具體實施例進一步說明本發明控制害蟲的方法的技術方案。
[0087]第一實施例、CrylFa基因的獲得和合成
[0088]1、獲得CrylFa核苷酸序列
[0089]CrylFa-Ol殺蟲蛋白質的氨基酸序列(605個氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:1所示；編碼相應于所述CrylFa-Ol殺蟲蛋白質的氨基酸序列(605個氨基酸)的CrylFa-Ol核苷酸序列(1818個核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:3所示；CrylFa_02殺蟲蛋白質的氨基酸序列(1148個氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO: 2所示；編碼相應于所述CrylFa_02殺蟲蛋白質的氨基酸序列(1148個氨基酸)的CrylFa-02核苷酸序列(3447個核苷酸)，如序列表中 SEQ ID NO:4 所示。
[0090]2、獲得CrylAb和Vip3A核苷酸序列
[0091]編碼CrylAb殺蟲蛋白質的氨基酸序列(818個氨基酸)的CrylAb核苷酸序列(2457個核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:5所示；編碼Vip3A殺蟲蛋白質的氨基酸序列(789個氨基酸)的Vip3A核苷酸序列(2370個核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:6所示。
[0092]3、合成上述核苷酸序列
[0093]所述CrylFa-Ol核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 3所示)、所述CrylFa-02核苷酸序列(如序列表中SEQ ID N0:4所示)、所述CrylAb核苷酸序列(如序列表中SEQ IDNO: 5所示)和所述Vip3A核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:6所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述CrylFa-Ol核苷酸序列(SEQ ID N0:3)的5’端還連接有AscI酶切位點，所述CrylFa-Ol核苷酸序列(SEQ ID NO:3)的3’端還連接有BamHI酶切位點；合成的所述CrylFa-02核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的5’端還連接有AscI酶切位點，所述CrylFa-02核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的3’端還連接有BamHI酶切位點；合成的所述CrylAb核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)的5’端還連接有NcoI酶切位點，所述CrylAb核苷酸序列(SEQ ID N0:5)的3’端還連接有SpeI酶切位點；合成的所述Vip3A核苷酸序列(SEQ IDNO:6)的5’端還連接有ScaI酶切位點，所述Vip3A核苷酸序列(SEQ ID NO:6)的3’端還連接有SpeI酶切位點。
[0094]第二實施例、重組表達載體的構建及重組表達載體轉化農桿菌
[0095]1、構建含有CrylF基因的重組克隆載體
[0096]將合成的CrylFa-Ol核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T (Promega, Madison, USA,CAT:A3600)上，操作步驟按Promega公司產品pGEM_T載體說明書進行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；fl表示噬菌體fl的復制起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；T7為T7RNA聚合酶啟動子；CryIFa-OI為CrylFa-Ol核苷酸序列(SEQ ID NO: 3) ；MCS為多克隆位點)。
[0097]然后將重組克隆載體DBNOl-T用熱激方法轉化大腸桿菌Tl感受態細胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501 )，其熱激條件為:50 μ I大腸桿菌Tl感受態細胞、10 μ I質粒DNA(重組克隆載體DBN01-T)，42°C水浴30秒；37°C振蕩培養I小時(IOOrpm轉速下搖床搖動)，在表面涂有IPTG(異丙基硫代-β -D-半乳糖苷)和X-gal(5_溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養過夜。堿法提取其質粒:將菌液在12000rpm轉速下離心Imin,去上清液,沉淀菌體用100 μ I冰預冷的溶液I (25mM Tris-HCl, IOmM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，`pH8.0)懸浮；加入150μ I新配制的溶液II (0.2Μ NaOH,1%SDS(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 μ I冰冷的溶液III (4Μ醋酸鉀，2Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min ;于溫度4°C、轉速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min ;于溫度4V、轉速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70%的乙醇洗滌后晾干；加入 30μ I 含 RNase (20μ g/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，pH8.0)溶解沉淀；于溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;于溫度_20°C保存備用。
[0098]提取的質粒經AscI和BamHI酶切鑒定后，對陽性克隆進行測序驗證，結果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的所述CrylFa-Ol核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，即CrylFa-Ol核苷酸序列正確插入。
[0099]按照上述構建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述CrylFa-02核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN02-T，其中，CrylFa-02為CrylFa-02核苷酸序列(SEQ ID N0:4)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN02-T中所述CrylFa-02核苷酸序列正確插入。
[0100]按照上述構建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述CrylAb核苷酸序列連入克隆載體PGEM-T上，得到重組克隆載體DBN03-T，其中，CrylAb為CrylAb核苷酸序列(SEQ ID N0:5)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN03-T中所述CrylAb核苷酸序列正確插入。[0101]按照上述構建重組克隆載體DBNOl-T的方法，將合成的所述Vip3A核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN04-T，其中，Vip3A為Vip3A核苷酸序列(SEQID N0:6)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN04-T中所述Vip3A核苷酸序列正確插入。
[0102]2、構建含有CrylF基因的重組表達載體
[0103]用限制性內切酶AscI和BamHI分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和表達載體DBNBC-Ol (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機構可以提供))，將切下的CrylFa-Ol核苷酸序列片段插到表達載體DBNBC-Ol的AscI和BamHI位點之間，利用常規的酶切方法構建載體是本領域技術人員所熟知的，構建成重組表達載體DBN100014，其構建流程如圖2所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；Ub1:玉米Ubiquitin (泛素)基因啟動子(SEQ ID NO: 7);CrylFa-Ol =CrylFa-Ol核苷酸序列(SEQ ID NO: 3) ；Nos:胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQID N0:8) ；PM1:磷酸甘露糖異構酶基因(SEQ ID N0:9) ；LB:左邊界)。
[0104]將重組表達載體DBN100014用熱激方法轉化大腸桿菌Tl感受態細胞，其熱激條件為:50μ I大腸桿菌Tl感受態細胞、10 μ I質粒DNA (重組表達載體DBN100014)，42 °C水浴30秒；37°C振蕩培養I小時(IOOrpm轉速下搖床搖動)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaC110g/L,瓊脂15g/L,用NaOH調pH至7.5)上于溫度37°C條件下培養12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養過夜。堿法提取其質粒。將提取的質粒用限制性內切酶AscI和BamHI酶切后鑒定，并將陽性克隆進行測序鑒定，結果表明重組表達載體DBN100014在AscI和BamHI位點間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:3所示核苷酸序列，即CrylFa-Ol核苷酸序列。
[0105] 按照上述構建重組表達載體DBN100014的方法，將AscI和BamHI酶切重組克隆載體DBN02-T切下的所述CrylFa-02核苷酸序列插入表達載體DBNBC-Ol，得到重組表達載體DBN100013。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100013中的核苷酸序列含有為序列表中SEQID NO:4所示核苷酸序列，即CrylFa-02核苷酸序列，所述CrylFa-02核苷酸序列可以連接所述Ubi啟動子和Nos終止子。
[0106]按照上述構建重組表達載體DBN100014的方法，將AscI和BamH1、NcoI和SpeI分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和DBN03-T切下的所述CrylFa-Ol核苷酸序列和CrylAb核苷酸序列插入表達載體DBNBC-Ol，得到重組表達載體DBN100075。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100075中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:5所示核苷酸序列，即CrylFa-Ol核苷酸序列和CrylAb核苷酸序列，所述CrylFa-Ol核苷酸序列和所述CrylAb核苷酸序列可以連接所述Ubi啟動子和Nos終止子。
[0107]按照上述構建重組表達載體DBN100014的方法，將AscI和BamH1、ScaI和SpeI分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和DBN04-T切下的所述CrylFa-Ol核苷酸序列和Vip3A核苷酸序列插入表達載體DBNBC-OI，得到重組表達載體DBN100276。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100276中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:6所示核苷酸序列，即CrylFa-Ol核苷酸序列和Vip3A核苷酸序列，所述CrylFa-Ol核苷酸序列和所述Vip3A核苷酸序列可以連接所述Ubi啟動子和Nos終止子。
[0108]按照上述構建重組表達載體DBN100014的方法，用限制性內切酶AscI和BamHI分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和表達載體DBNBC-02 (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機構可以提供))，將切下的CrylFa-Ol核苷酸序列片段插到表達載體DBNBC-02的AscI和BamHI位點之間，利用常規的酶切方法構建載體是本領域技術人員所熟知的，構建成重組表達載體DBN100015，其構建流程如圖3所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；Ub1:玉米Ubiquitin (泛素)基因啟動子(SEQ ID NO: 7) ;CrylFa_01:CrylFa_01 核苷酸序列(SEQ IDNO:3) ;Nos:胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID NO:8) ;PAT:草丁膦乙酰轉移酶基因(SEQID NO:22) ；LB:左邊界)。
[0109]按照上述構建重組表達載體DBN100015的方法，將AscI和BamHI酶切重組克隆載體DBN02-T切下的所述CrylFa-02核苷酸序列插入表達載體DBNBC-02，得到重組表達載體DBN100030。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100030中的核苷酸序列含有為序列表中SEQID NO:4所示核苷酸序列，即CrylFa-02核苷酸序列，所述CrylFa-02核苷酸序列可以連接所述Ubi啟動子和Nos終止子。
[0110]按照上述構建重組表達載體DBN100015的方法，將AscI和BamH1、NcoI和SpeI分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和DBN03-T切下的所述CrylFa-Ol核苷酸序列和CrylAb核苷酸序列插入表達載體DBNBC-02，得到重組表達載體DBN100012。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100012中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:5所示核苷酸序列，即CrylFa-Ol核苷酸序列和CrylAb核苷酸序列，所述CrylFa-Ol核苷酸序列和所述CrylAb核苷酸序列可以連接所述Ubi啟動子和Nos終止子。
[0111]按照上述構建重組表達載體DBN100015的方法，將AscI和BamH1、ScaI和SpeI分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和DBN04-T切下的所述CrylFa-Ol核苷酸序列和Vip3A核苷酸序列插入表達載體DBNBC-OI，得到重組表達載體DBN100031。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100031中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:6所示核苷酸序列，即CrylFa-Ol核苷酸序列和Vip3A核苷酸序列，所述CrylFa-Ol核苷酸序列和所述Vip3A核苷酸序列可以連接所述Ubi啟動子和Nos終止子。
[0112]3、重組表達載體轉化農桿菌
[0113]對已經構建正確的重組表達`載體DBN100014、DBN100013、DBN100075、DBN100276、DBN100015、DBN100030、DBN100012 和 DBN100031 用液氮法轉化到農桿菌 LBA4404(Invitrgen, Chicago, USA, CAT:18313-015)中，其轉化條件為:100 μ L 農桿菌 LBA4404、
3μ L質粒DNA (重組表達載體);置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉化后的農桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉速為200rpm條件下培養2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養并提取其質粒，用限制性內切酶AhdI和XhoI對重組表達載體DBN100014、DBN100013、DBN100012、DBN100075、DBN100015 和 DBN100030 進行酶切驗證，用限制性內切酶AhdI和EcoRV對重組表達載體DBN100031和DBN100276進行酶切驗證，結果表明重組表達載體 DBN100014、DBN100013、DBN100075、DBN100276、DBN100015、DBN100030、DBN100012和DBN100031結構完全正確。
[0114]第三實施例、轉入CrylF基因的玉米植株的獲得及驗證
[0115]1、獲得轉入CrylF基因的玉米植株
[0116]按照常規采用的農桿菌侵染法，將無菌培養的玉米品種綜31 (Z31)的幼胚與第二實施例中3所述的農桿菌共培養，以將第二實施例中2構建的重組表達載體DBN100014、DBN100013.DBN100075和DBN100276中的T-DNA (包括玉米Ubiquitin基因的啟動子序列、CrylFa-Ol核苷酸序列、CrylFa-02核苷酸序列、CryIAb核苷酸序列、Vip3A核苷酸序列、PMI基因和Nos終止子序列)轉入到玉米染色體組中，獲得了轉入CrylFa-Ol核苷酸序列的玉米植株、轉入CrylFa-02核苷酸序列的玉米植株、轉入CrylFa-Ol-CrylAb核苷酸序列的玉米植株和轉入CrylFa-01-Vip3A核苷酸序列的玉米植株；同時以野生型玉米植株作為對照。
[0117]對于農桿菌介導的玉米轉化，簡要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農桿菌懸浮液接觸幼胚，其中農桿菌能夠將CrylFa-Ol核苷酸序列、CrylFa-02核苷酸序列、CrylFa-Ol-CrylAb核苷酸序列和/或CrylFa-01_Vip3A核苷酸序列傳遞至幼胚之一的至少一個細胞(步驟1:侵染步驟)，在此步驟中，幼胚優選地浸入農桿菌懸浮液(OD66tl=0.4-0.6，侵染培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L，pH5.3))中以啟動接種。幼胚與農桿菌共培養一段時期(3天)(步驟2:共培養步驟)。優選地，幼胚在侵染步驟后在固體培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)100mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養。在此共培養階段后，可以有一個選擇性的“恢復”步驟。在“恢復”步驟中，恢復培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖30g/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D)lmg/L、瓊脂8g/L,pH5.8)中至少存在一種已知抑制農桿菌生長的抗生素(頭孢霉素)，不添加植物轉化體的選擇劑(步驟3:恢復步驟)。優選地，幼胚在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養基上培養，以消除農桿菌并為侵染細胞提供恢復期。接著，接種的幼胚在含選擇劑(甘露糖)的培養基上培養并選擇生長著的轉化愈傷組織(步驟4:選擇步驟)。優選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養，導致轉化的細胞選擇性生長。然后，愈傷組織再生成植物(步驟5:再生步驟)，優選地，在含選擇劑的培養基上生長的愈傷組織在固體培養基(MS分化培養基和MS生 根培養基)上培養以再生植物。
[0118]篩選得到的抗性愈傷組織轉移到所述MS分化培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培養分化。分化出來的小苗轉移到所述MS生根培養基(MS鹽2.15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培養至約IOcm高，移至溫室培養至結實。在溫室中，每天于28°C下培養16小時，再于20°C下培養8小時。
[0119]2、用TaqMan驗證轉入CrylF基因的玉米植株
[0120]分別取轉入CrylFa-Ol核苷酸序列的玉米植株、轉入CrylFa-02核苷酸序列的玉米植株、轉入CrylFa-Ol-CrylAb核苷酸序列的玉米植株和轉入CrylFa_01_Vip3A核苷酸序列的玉米植株的葉片約IOOmg作為樣品,用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組DNA，通過Taqman探針熒光定量PCR方法檢測CrylF基因、CrylAb基因和Vip3A基因的拷貝數。同時以野生型玉米植株作為對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設3次重復，取平均值。
[0121]檢測CrylF基因、CrylAb基因和Vip3A基因拷貝數的具體方法如下:
[0122]步驟11、分別取轉入CrylFa-Ol核苷酸序列的玉米植株、轉入CrylFa-02核苷酸序列的玉米植株、轉入CrylFa-Ol-CrylAb核苷酸序列的玉米植株、轉入CrylFa_01_Vip3A核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重復；
[0123]步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA，具體方法參考其產品說明書；
[0124]步驟13、用NanoDrop2000 (Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；
[0125]步驟14、調整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80_100ng/μ I ；
[0126]步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數，以經過鑒定已知拷貝數的樣品作為標準品，以野生型玉米植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是:
[0127]以下引物和探針用來檢測CrylFa-Ol核苷酸序列:
[0128]引物I (CFl):CAGTCAGGAACTACAGTTGTAAGAGGG 如序列表中 SEQ ID NO: 10 所示；
[0129]引物2 (CRl):ACGCGAATGGTCCTCCACTAG 如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示；
[0130]探針I (CPl):CGTCGAAGAATGTCTCCTCCCGTGAAC 如序列表中 SEQ ID NO: 12 所示；
[0131]以下引物和探針用來檢測CrylFa-02核苷酸序列:
[0132]引物3 (CF2):CAGTCAGGAACTACAGTTGTAAGAGGG 如序列表中 SEQ ID NO: 13 所示；
[0133]引物4 (CR2):ACGCGAATGGTCCTCCACTAG 如序列表中 SEQ ID NO: 14 所示；
[0134]探針2 (CP2):CGTCGAAGAATGTCTCCTCCCGTGAAC 如序列表中 SEQ ID NO: 15 所示；
[0135]以下引物和探針用來檢測CrylAb核苷酸序列:
[0136]引物5 (CF3):CGAACTACGACTCCCGCAC 如序列表中 SEQ ID NO: 16 所示；
[0137]引物6 (CR3):GTAGATTTCGCGGGTCAGTTG 如序列表中 SEQ ID NO: 17 所示；
[0138]探針3 (CP3):CTACCCGATCCGCACCGTGTCC 如序列表中 SEQ ID NO: 18 所示；
[0139]以下引物和探針用來檢測Vip3A核苷酸序列:
[0140]引物7 (VFl):ATTCTCGAAATCTCCCCTAGCG 如序列表中 SEQ ID NO: 19 所示；
[0141]引物8 (VRl):GCTGCCAGTGGATGTCCAG 如序列表中 SEQ ID NO: 20 所示；
[0142]探針4 (VPl):CTCCTGAGCCCCGAGCTGATTAACACC 如序列表中 SEQ ID NO:21 所示；
[0143]PCR反應體系為:
[0144]
【權利要求】
1.一種控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，包括將斜紋夜蛾害蟲與CrylF蛋白接觸。
2.根據權利要求1所述的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述CrylF蛋白為CrylFa 蛋白。
3.根據權利要求2所述的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述CrylFa蛋白存在于產生所述CrylFa蛋白的植物細胞中，所述斜紋夜蛾害蟲通過攝食所述植物細胞與所述CrylFa蛋白接觸。
4.根據權利要求3所述的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述CrylFa蛋白存在于產生所述CrylFa蛋白的轉基因植物中，所述斜紋夜蛾害蟲通過攝食所述轉基因植物的組織與所述CrylFa蛋白接觸，接觸后所述斜紋夜蛾害蟲生長受到抑制并最終導致死亡，以實現對斜紋夜蛾為害植物的控制。
5.根據權利要求4所述的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述轉基因植物可以處于任意生育期。
6.根據權利要求4所述的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述轉基因植物的組織可以為葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥、花絲或果實。
7.根據權利要求4所述的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述對斜紋夜蛾為害植物的控制不因種植地點的改變而改變。
8.根據權利要求4所述的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述對斜紋夜蛾為害植物的控制不因種植時間的改變而改變。
9.根據權利要求3至8任一項所述的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述植物可以來自玉米、大豆、棉花、甘薯、芋、蓮、田菁、煙草、甜菜、白菜或茄子。
10.根據權利要求2至9任一項所述的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述CrylFa蛋白的多核苷酸的植物。
11.根據權利要求2至10任一項所述的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述CrylFa蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。
12.根據權利要求11所述的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述CrylFa蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
13.根據權利要求3至12任一項所述的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述植物還可以產生至少一種不同于所述CrylFa蛋白的第二種核苷酸。
14.根據權利要求13所述的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質、Vip類殺蟲蛋白質、蛋白酶抑制劑、凝集素、α _淀粉酶或過氧化物酶。
15.根據權利要求14所述的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸可以編碼CrylAb蛋白、CrylAc蛋白、CrylBa蛋白或Vip3A蛋白。`
16.根據權利要求15所述的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸包括SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
17.根據權利要求13所述的控制斜紋夜蛾害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸為抑制目標昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
18.—種CrylF蛋白質控制斜紋夜蛾害蟲的用途。
【文檔編號】A01P7/04GK103719137SQ201310573804
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年11月15日 優先權日:2013年11月15日
【發明者】張愛紅, 鮑曉明, 劉海利, 裴艷新, 張云珠 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 北京大北農科技集團股份有限公司生物技術中心