小鼠去勢高鐵骨質疏松模型構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種小鼠去勢高鐵骨質疏松模型構建方法：取8周齡ICR雌性小鼠，行雙側卵巢切除術；術后1周開始腹腔注射枸櫞酸鐵銨（FAC），7周后得到小鼠去勢高鐵骨質疏松模型。目前臨床絕經婦女多見鐵蓄積，近來許多研究認為鐵蓄積是骨質疏松的高危因素，而傳統去勢骨質疏松模型鐵水平正常，不能完全模擬絕經婦女，本發明建立的模型較傳統模型更貼近臨床現象。
【專利說明】小鼠去勢高鐵骨質疏松模型構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學【技術領域】，具體涉及動物實驗模型的構建方法，尤其涉及小鼠去勢高鐵骨質疏松模型構建方法。
【背景技術】
[0002]鐵元素在機體內的吸收過程相當復雜，食物中的三價鐵在小腸中由腸細胞色素B(Dcytb)還原為二價鐵，再通過二價陽離子轉運蛋白I (DMTl)轉運至小腸絨毛上皮細胞內，此時二價鐵可在細胞基底部經由膜鐵轉運蛋白I (FPNl)轉運至血液中，同時由膜鐵轉運輔助蛋白(Hp)氧化為三價，與血液中轉鐵蛋白結合。該結合的復合體隨血液運至各組織器官，并與組織內的細胞作用，由胞內steap3還原為二價鐵發揮其生物效應。近年來越來越多的研究顯示鐵代謝與骨代謝之間有著密切的關系，2010年美國Huang申請了鐵調素作為骨質疏松治療藥物的專利，并于2012年在Endocrinology和Gene上報道鐵在離體環境中對骨代謝的影響；不僅在基礎研究，臨床研究也顯示鐵代謝與骨代謝的關聯，2012年，韓國一項回顧性隊列研究中，針對健康體檢的940名絕經女性進行了為期三年的隨訪，發現在正常人群當血清鐵蛋白水平升高時，骨量呈劑量一致性的丟失加速。這項研究結論表明鐵蓄積可能是骨質疏松的獨立危險因素，該研究發表在骨質疏松一區雜志JBMR上，并被Nature評論為新的亮點。
[0003]骨質疏松在絕經女性群體高發，據統計,女性高于50歲后有約50%將發生骨質疏松。在女性，體內鐵離子平衡的一個重要“降鐵途徑”是月經排血，從45歲圍絕經期開始到60歲絕經后，當隨著雌激素減少、月經逐漸停止，宮血排出也減少，這段期間鐵蛋白水平升高約2~3倍。我們團隊在2012年和2013年分別在骨質疏松2區雜志IOF與Bone上提及鐵對骨質疏松的促進作用，因此女性絕經后骨質疏松除了與雌激素減少有關，還可能與體內鐵水平升聞有關系。
[0004]臨床資料顯示，多數患有骨質疏松疾病的絕經婦女體內鐵水平偏高,其原因主要在于絕經后，女性不再有月經血排出體外，而月經血的排出又恰恰是鐵排泄的重要途徑，這就導致體內鐵失衡，排出減少導致鐵蓄積。大量文獻報道:雌性小鼠去除卵巢后，與假手術組相比，去勢組血清鐵、脛骨鐵含量平均值低于假手術組。這說明小鼠與人不一樣，由于小鼠本來就沒有月經，單純的去勢骨質疏松模型體內鐵并不增高。所以傳統的小鼠去勢骨質疏松模型不能貼切的反應絕經后婦女的高鐵狀態。其他骨質疏松模型也不理想，如比格犬，盡管有排經，但是頻次為2次/年，經血太少，去勢停經后對體內鐵水平影響不大；再如食蟹猴，排經情況最接近人類，但是去勢停經后造成高鐵狀態需時太長，要一年及以上，性價比不高。高鐵水平是骨質疏松癥的獨立危險因素，而傳統去勢模型不能很好的反應該危險因素。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題于克服上述現有技術的缺點，提供一種成本低，見效快，模型性能穩定，適用性廣的小鼠去勢高鐵骨質疏松模型構建方法。
[0006]為達到上述目的，本發明的技術方案是:小鼠去勢高鐵骨質疏松模型構建方法，包括以下步驟:
[0007](I)用水合氯醛腹腔注射小鼠進行麻醉，切開腹腔找出雙側卵巢，在輸卵管上結扎，并徹底切除卵巢，最后縫合；
[0008](2)術后I周，對小鼠腹腔注射枸櫞酸鐵銨(FAC)，劑量為0.05g/kg,每周2次，飼養7周后得到小鼠去勢高鐵骨質疏松模型。
[0009]本發明的一優選技術方案，步驟(1)后小鼠肌注青霉素5萬U/d，持續3d，預防感染。
[0010]本發明的一優選技術方案，步驟(1)中用3.6%水合氯醛(10!111/1^)腹腔內注射麻醉。
[0011]本發明中相關術語的說明及解釋
[0012]根據本發明，術語“去勢”是指雙側卵巢切除。
[0013]根據本發明，術語“ 骨質疏松”是指是骨代謝過程中骨吸收和骨形成的偶聯出現缺陷，體內的鈣磷代謝不平衡，使骨密度逐漸減少而引起的癥狀。
[0014]根據本發明，術語TRAP_5b是指抗酒石酸酸性磷酸酶_5b，是由骨吸收的破骨細胞分泌至血液中的有活性的酶，是常用的骨吸收生化指標。一型膠原C端肽(CTX)是骨骼更新時，一型膠原降解后進入血液的C端短肽片段，是反應骨吸收的生化指標。術語核因子KB受體活化因子配體(RANKL)是一種II型跨膜蛋白，能與破骨細胞前體細胞膜上的RANKL受體-RANK結合，刺激前體細胞分化發育為成熟破骨細胞。術語骨保護素(OPG)能與RANKL競爭性結合RANK，從而阻斷骨吸收信號的傳遞；它們的比值能反應骨吸收的能力。術語骨堿性磷酸酶(BALP)是由骨質中分泌出來，當骨頭中鈣鹽沉淀不足時，該酶分泌增多，骨中鈣鹽充足時就分泌減少，所以用來幫助檢查有無鈣吸收不足，常用來反應骨形成能力。術語骨鈣素(BGP)又稱骨 Y-羧谷氨酸包含蛋白(bone gamma-carboxyglutamic-acid-containingproteins，)，是成骨細胞合成并分泌的，比較穩定，不受骨吸收因素的影響。該蛋白在骨礦化峰期之后才出現積聚。通過血清骨鈣素可以了解成骨細胞，特別是新形成的成骨細胞的活動狀態，也是常用的檢測骨形成的生化指標。
[0015]根據本發明，術語降鈣素受體CTR是在破骨細胞(osteoclasts，0C)上發現最早的一種受體，為OC的特征性標志之一，CTR基因位于OC細胞膜，分子量為85000~90000，其氨基酸序列形成7個跨膜區及連接這些跨膜區的4個細胞外功能區(el~e4)和4個細胞內功能區(il~i4)。術語組織蛋白酶K (CTK)被認為是破骨細胞特異性表達的產物，其基因定位于lq21.2，轉錄產物長1.7kb，翻譯產物為前組織蛋白酶原K，屬于溶酶體半胱氨酸蛋白酶中的番木瓜蛋白酶超家族。術語骨鈣蛋白(OCN)又稱骨鈣素(BGP)，主要反應成骨活性。術語基質金屬蛋白酶9 (MMP9)是由破骨細胞分泌的，又稱92-kDlV型膠原酶和明膠酶B，在破骨細胞中呈高表達，該酶在正常骨改建和病理性骨吸收過程中發揮重要作用，MMP9基因位于染色體20qll.1~13.1，26~27kbp，具有13個外顯子和9個內含子。術語抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)是位于第19號染色體P13.2~13.3處的一個基因編碼的單一同工酶。該酶是一種結構高度保守的含鐵糖蛋白，分子量約30~40kD，是反應骨吸收和破骨細胞活性最重要的標志物。[0016]本發明的有益效果是:該模型在去勢小鼠基礎上進行高鐵干預，來模擬女性絕經后鐵蓄積現象，旨在模擬臨床上高鐵絕經女性，該模型建立迅速、穩定，更好的貼近臨床現象。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述:
[0018]圖1為各組實驗各組肝臟普魯士藍鐵染色。
[0019]圖2為各組酶聯免疫吸附法檢測各組血清鐵蛋白水平。
[0020]圖3為各組Micro-CT掃描實驗各組小鼠的股骨下端的三維圖像。
[0021]圖4為各組小鼠雙側脛骨PCR相關骨代謝基因檢測對比。
[0022]圖5A-5E為分別為酶聯免疫吸附法檢測各組血清骨代謝指標(TRAP_5b、CTX、RANKL/OPG、BALP、BGP)的差異示圖。
[0023]圖6為各組小鼠破骨原代細胞TRAP染色結果。與SHAM組相比，#P<0.05,與OVX組相比，*P〈0.05。
[0024]圖7為各組小鼠破骨原代細胞計數結果。與SHAM組相比，#P<0.05，與OVX組相比，*P〈0.05。
【具體實施方式】
[0025]為了便于理解，以下將通過具體的實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發明范圍的限制。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。
[0026]一.儀器、材料
[0027]本發明的SPF級雌性ICR小鼠由蘇州大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號為:SCXK (蘇)2007-0035。
[0028]Micro-CT (SKYSCAN, 1176 型)，酶標儀(Bio-tech 公司，Synergy2)，PCR 擴增儀(ABI公司，System9700),高速冷凍離心機(貝克曼庫爾德公司，Beckman Avanti J-30I),電泳儀(Bio-Rad生物公司，PowerPPAC200)，細胞培養箱(Heal Force, HF100)，倒置相差顯微鏡(Olympus公司，CKX31)，超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司，Sff-CJ-1F)
[0029]細胞培養皿(Corning生物公司),96孔板(Corning生物公司),抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒(Sigma公司),枸櫞酸鐵銨(Sigma公司),水合氯醒(國藥集團化學試劑有限公司)，生理鹽水(中國大冢制藥有限公司)，ELISA試劑盒(R & D生物公司)，a -MEM培養基(Gibco生物技術公司)，新生胎牛血清(Gibco生物技術公司)，胰蛋白酶(碧云天生物技術公司)。
[0030]二.模型建立方法
[0031 ] 選取8周齡SPF級ICR雌性小鼠30只，隨機分為FAC+0VX，0VX, SHAM三組，每組10只；FAC+0VX組為去勢高鐵骨質疏松組，OVX組為去勢骨質疏松組，SHAM組為假手術組。
[0032]FAC+0VX組為去勢高鐵骨質疏松組，本組小鼠用3.6%水合氯醛(10ml/kg)腹腔內注射麻醉后，逐層切開皮膚、肌層，進入腹腔，找出雙側卵巢，在輸卵管上結扎，并徹底切除卵巢，分層縫合。術后所有小鼠肌注青霉素5萬U/d，持續3d，預防感染。術后I周開始腹腔注射枸櫞酸鐵銨(FAC)，劑量為0.05g/kg，每周2次，給藥劑量每周按體重調整一次，7周后得到小鼠去勢高鐵骨質疏松模型。OVX組小鼠僅行雙側卵巢切除術，術后一周用等量同頻次生理鹽水腹腔注射7周。SHAM組小鼠用同樣的方法進入腹腔，找出雙側卵巢，僅切除卵巢周圍部分腹內脂肪后逐層縫合，術后一周用等量同頻次生理鹽水腹腔注射7周。
[0033]三.模型建立的評價方法與結果
[0034](一)評價指標
[0035]1.血清鐵離子指標檢測
[0036]造模7周后以4%水合氯醛以0.lml/100g劑量麻醉小鼠，采取雙側眼球摘除取血法收集小鼠全血Iml，3000r/min離心IOmin，吸取上層血清，分裝于小EP管中，凍存于_80°C冰箱中，用于檢測。采用自動生化分析儀檢測血清鐵離子水平。
[0037]2.肝臟鐵水平檢測
[0038]小鼠處死后行肝臟門靜脈生理鹽水灌洗，至肝臟變大，發白為止。取肝臟一葉浸泡于福爾馬林中固定，4周后取出，觀察大體顏色并行普魯士藍鐵染色，光鏡下觀察鐵藍染顆粒。
[0039]3.血清鐵蛋白水平檢測
[0040]血清稀釋40倍后 ，用酶聯免疫吸附法(Elisa)檢測各組鐵蛋白水平差異。酶標儀讀出各組OD值，并按照標準孔繪制濃度曲線，根據各標本OD值計算相應的鐵蛋白濃度。
[0041]4.Micro-CT 掃描
[0042]用Skyscanl 172Mciro_CT對小鼠股骨標本遠端松質骨進行掃描并進行三維重建和數據分析。掃描條件是59KV、127uA，精密度為9um。松質骨的感興趣區域(R0I)為股骨遠端生長板以下60層面開始數100層，這100層掃描圖片用于松質骨三維重建及數據分析。
[0043]5.骨代謝相關基因檢測
[0044]取小鼠雙側脛骨置于研缽中，加入少量液氮迅速研磨成粉(邊研磨邊加液氮)，取粉末置入離心管，以經典Trizol法提取RNA，再逆轉錄成cDNA，_80度保存。半定量PCR檢測骨代謝相關基因(CTR，CTK, RANKL, OPG, OCN, MMP9, TRAP)各組表達差異。
[0045]6.血清骨代謝指標(TRAP-5b、CTX、RANKL/OPG、BALP, BGP)檢測方法同鐵蛋白檢測。
[0046]7.骨髓源性破骨細胞培養
[0047]血清收集完成后，將每只小鼠浸泡于75%酒精中5分鐘以充分消毒。于無菌操作臺中進行以下操作。將小鼠下肢在髖關節處離斷，暴露出股骨。用注射器吸取含有10%血清的a-MEM將骨髓細胞沖到培養皿中。24小時后收集非貼壁細胞重新種植，此時換成30ng/ml M-CSF的培養基培養3天。3天后，胰酶消化貼壁細胞，將獲得的細胞以每孔4000的密度接種到96孔板中。用含有50ng/ml RANKL和30ng/ml M-CSF的培養基培養8天，每2天換液一次，8天后進行抗酒石酸酸性磷酸酶染色。
[0048]8.統計學分析
[0049]利用SPSS19.0統計軟件進行方差分析，所有數據均以M± SD表示。以P〈0.05為有統計學意義。
[0050](二):結果
[0051]1.血清鐵離子指標[0052]表1各組小鼠血清鐵濃度(與Sham組比較，*P〈0.05)
[0053]
【權利要求】
1.小鼠去勢高鐵骨質疏松模型構建方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)用水合氯醛腹腔注射小鼠進行麻醉，切開腹腔找出雙側卵巢，在輸卵管上結扎，并徹底切除卵巢，最后縫合； (2)術后I周，對小鼠腹腔注射枸櫞酸鐵銨FAC，劑量為0.05g/kg,每周2次，飼養7周后得到小鼠去勢高鐵骨質疏松模型。
2.根據權利要求1所述的方法，步驟(1)中用3.6%水合氯醛10ml/kg腹腔內注射麻醉。
3.根據權利要求1所述的方法，步驟(1)后小鼠肌注青霉素5萬U/d，持續3d，預防感染 。
【文檔編號】A01K67/02GK103636555SQ201310556517
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月11日 優先權日:2013年11月11日
【發明者】王嘯, 徐又佳, 劉祿林, 李光飛, 高超 申請人:徐又佳