表達抑制麥長管蚜羧酸酯酶的發卡rna的dna分子及其應用的制作方法

表達抑制麥長管蚜羧酸酯酶的發卡rna的dna分子及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種表達抑制麥長管蚜羧酸酯酶的發卡RNA的DNA分子及其應用。本發明所提供的DNA分子的結構為SEQ正向-X-SEQ反向，所述SEQ正向的序列為序列1的第1-345位；所述SEQ反向的序列與所述SEQ正向的序列反向互補；所述X是所述SEQ正向與所述SEQ反向之間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互補。實驗證明，將所述DNA分子轉化小麥幼胚愈傷組織，獲得轉基因株系，進行蚜蟲飼喂試驗，麥長管蚜食用轉基因葉片后，羧酸酯酶基因表達量和酶活性顯著降低、繁殖率下降，且其對辛硫磷溶劑的耐受性降低20-30%。可見，本發明對于農業生產上害蟲的防治具有重要意義。
【專利說明】表達抑制麥長管蚜羧酸酯酶的發卡RNA的DNA分子及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種表達抑制麥長管蚜羧酸酯酶的發卡RNA的DNA分子及其應用。
【背景技術】
[0002]蚜蟲是小麥生產中的主要害蟲，主要有麥無網長管蚜(Metopolophiumdirhodum),麥二叉姆(Schizaphis graminum),禾谷纟益管姆(Rhopalosiphum padi )和麥長管蟲牙(Sitobion avenae),分布極廣,幾乎遍及世界各產麥國。姆蟲以成蟲、若蟲吸取小麥汁液危害小麥，排到葉片上的蜜露降低光合作用，并傳播多種病毒病，包括大麥黃矮病毒，導致小麥產量降低和品質下降。
[0003]目前，防治小麥蚜蟲或者其他害蟲主要還是依靠化學殺蟲劑，雖然在一定程度上能夠減少蟲害所帶來的產量下降，但是長期的使用化學殺蟲劑不但費用較高而且容易使蚜蟲產生相應的抗性，同時導致蚜蟲天敵殺傷嚴重，環境污染加劇。
[0004]近年來，隨著蚜蟲抗藥性的增強，化學殺蟲劑的使用濃度和藥用量也呈現增長的趨勢。
[0005]植物介導的dsRNA確可以長效的抑制目標基因的表達，達到生產上控制害蟲的目的，這種利用植物表達與昆蟲特定基因匹配的雙鏈RNA分子，當昆蟲取食這類植物后，其靶基因的表達被明顯降低，這種技術不僅為昆蟲的功能基因組研究提供了便捷的方法，也為農業害蟲的防治提供了特異性更強且環境安全的新思路、新技術。

【發明內容】

`[0006]本發明的目的是提供一種表達抑制麥長管蚜羧酸酯酶的發卡RNA的DNA分子及其應用。
[0007]本發明所提供的DNA分子具體為如式(I)所示的DNA片段:
[0008]SEQ正向-X-SEQ反向(I)
[0009]所述序列為序列表中序列I的第1-345位；
[0010]所述SEQ_的序列與所述序列反向互補(序列I的第1513-1857位)；
[0011]所述X是所述SEQ1^1與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互補。
[0012]在本發明中，式(I)中所述X為FAD2內含子序列,具體如序列表中序列2所示。
[0013]更加具體的，式(I)所示的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列I所示。
[0014]含有所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的保護范圍。
[0015]所述重組載體可為重組表達載體，也可為重組克隆載體。
[0016]在本發明中，所述重組表達載體中啟動所述基因轉錄的啟動子具體為rbcS啟動子。
[0017]進一步,所述rbcS啟動子的序列如序列表中序列3所示。
[0018]在本發明的一個實施例中，所述重組表達載體具體為在pBAC-rbcs-sNTL載體的酶切位點插入序列I所示DNA片段后得到的重組質粒；所述酶切位點具體為Kpn I和BamH
1
[0019]由以上式(I)所示DNA片段編碼得到的RNA分子也屬于本發明的保護范圍。
[0020]以上式(I)所示DNA片段，或所述重組表達載體、表達盒或重組菌，或所述RNA分子在如下al)_a6)任一中的應用也屬于本發明的保護范圍:
[0021 ] al)抑制麥長管蚜羧酸酯酶表達；
[0022]a2)降低麥長管蚜羧酸酯酶活性；
[0023]a3)降低麥長管蚜的耐藥性；
[0024]a4)降低麥長管蚜的 繁殖率；
[0025]a5)防治麥長管蚜；
[0026]a6)培育抗麥長管蚜的轉基因植物。
[0027]本發明的另一個目的是提供一種培育抗麥長管蚜的轉基因植物的方法。
[0028]本發明所提供的培育抗麥長管蚜的轉基因植物的方法，具體可包括如下步驟:將以上式(I)所示DNA片段導入目的植物中，得到抗麥長管蚜的轉基因植物；
[0029]所述抗麥長管蚜具體體現在如下bl) _b4)中的至少一種:
[0030]bl)抑制麥長管蚜的羧酸酯酶表達；
[0031]b2)降低麥長管蚜的羧酸酯酶活性；
[0032]b3)降低麥長管蚜的耐藥性；
[0033]b4)降低麥長管蚜的繁殖率。
[0034]進一步，在本發明的一個實施例中，al)和bI)中所述抑制麥長管蚜的羧酸酯酶表達具體為使麥長管蚜的羧酸酯酶編碼基因在RNA水平的表達量降低。
[0035]在本發明中，a3)和b3)中所述耐藥性中的“藥”具體為辛硫磷溶劑。所述辛硫磷溶劑的化學名稱為0，0- 二乙基-0-(苯乙腈酮肟)硫代磷酸酯，分子式為C12H15N2O3PS,分子量為 298.18。
[0036]在以上所述的應用或方法中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物；在本發明中，所述植物為單子葉植物小麥，具體為小麥品種遼春10號。在本發明的一個實施例中，所述麥長管蚜具體為一齡麥長管蚜。
[0037]本發明通過RT-PCR方法克隆了麥長管蚜羧酸酯酶基因(SaCbE E4)片段，進一步構建了此基因片段的發夾RNAi構件。將該構件轉化小麥幼胚愈傷組織，獲得了轉基因株系。蚜蟲飼喂試驗表明，麥長管蚜食用轉基因葉片后，羧酸酯酶基因表達量和酶活性顯著降低、繁殖率下降，且其對辛硫磷溶劑的耐受性降低20-30%。可見，本發明對于農業生產上害蟲的防治具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為麥長管蚜總RNA的電泳檢測結果。其中，泳道I和2為兩個重復，均為麥長管蚜總RNA。[0039]圖2為RT-PCR獲得SaCbE E4基因片段(約0.35kb)。其中，泳道M為DAN分子量標準2000bp DNA Ladder ;泳道I為利用第一對引物(Pl_sR和Pl_sF)PCR擴增所得添加了BamH I和Hind III酶切位點的SaCbE E4基因片段，命名為CbE E4-1。泳道2為利用第二對引物(Pl-asR和Pl_asF)PCR擴增所得添加了 Kpn I和Sac I酶切位點的SaCbE E4基因片段，命名為CbE E4-2。
[0040]圖3為pHurricane載體的質粒圖譜。
[0041]圖4為重組質粒pBSK-FAD2Il-CbE E4的酶切鑒定結果。其中，泳道Ml為DAN分子量標準IKb DNA Ladder ;泳道M2為DAN分子量標準2000bp DNA Ladder ;泳道I為pTE-CbEE4-1的Hind III和BamH I酶切結果；泳道2為pHurricane載體的Hind III和BamH I酶切結果；泳道3為重組質粒pBSK-FAD2Il-CbE E4的Hind III和BamHI酶切結果。
[0042]圖5為重組質粒pBSK-CbE E4R的酶切鑒定結果。其中，泳道Ml為DAN分子量標準IKb DNA Ladder ;泳道 M2 為 DAN 分子量標準 2000bp DNA Ladder ;泳道 I 為 pTE-CbE E4-2的Kpn I和Sac I酶切結果；泳道2為pBSK_FAD2Il_CbE E4的Kpn I和Sac I酶切結果；泳道3為重組質粒pBSK-CbE E4R的Kpn I和Sac I酶切結果。
[0043]圖6為pBAC-rbcs-sNTL載體的質粒圖譜。
[0044]圖7為重組質粒pBAC-rbcs-CbE E4的酶切鑒定結果。其中，泳道M為DAN分子量標準IKb DNA Ladder ;泳道I為pBAC-rbcs-sNTL的Kpn I和BamH I酶切結果；泳道2為pBSK-CbE E4R的Kpn I和BamH I酶切結果；泳道3為重組質粒pBAC-rbcs-CbE E4的KpnI和BamH I酶切結果。
[0045]圖8為重組表達載體pBAC-rbcs-CbE E4的質粒圖譜。其中，位于BamH I和KpnI之間的“CbE-1ntron-CbE”即為序列3所示的RNAi構件。
[0046]圖9為SaCbE E4的RNAi轉基因小麥的PCR鑒定。其中，A為T3代轉基因植株用針對RNAi構件的引物對P4-F/P4-R進行PCR擴增的結果(箭頭處為約0.35kb目的條帶);B為T3代轉基因植株用針對FAD2IntronI的引物對P6-R/P6-F進行PCR擴增的結果(箭頭處為約Ikb目的條帶)。A和B中，泳道M均為DNA分子量標準DL2000Marker ;泳道+均為陽性對照pBAC-rbcs-CbE E4質粒；泳道-均為陰性對照未轉基因小麥；泳道1_9均為轉基因植株，在兩次擴增中均出現目的條帶(即A和B中均出現目的條帶)的為陽性植株。
[0047]圖10為SaCbE E4的RNAi轉基因小麥對麥長管蚜羧酸酯酶基因表達量干擾效果分析結果。其中，A為麥長管蚜取食轉基因小麥葉片I天后的檢測結果出為麥長管蚜取食轉基因小麥葉片3天后的檢測結果；C為麥長管蚜取食轉基因小麥葉片5天后的檢測結果。*表示差異顯著(p〈0.05) ;**表示差異極顯著(p〈0.01)。
[0048]圖11為SaCbE E4的RNAi轉基因小麥對麥長管蚜羧酸酯酶活性影響分析結果。*表不差異顯著(P〈CL 05) ;**表不差異極顯著(p〈0.01)。
[0049]圖12為SaCbE E4的RNAi轉基因小麥對麥長管蚜耐藥性干擾效果分析結果。
[0050]圖13為SaCbE E4的RNAi轉基因小麥對麥長管蚜繁殖率的影響分析結果。**表不差異極顯著(p〈0.0Do
【具體實施方式】
[0051 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。[0052]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0053]麥長管姆(Sitobion avenae):從中國農業大學上莊實驗站小麥試驗田獲得,按照“王春芝，3種小麥蚜蟲的形態識別與防治技術，農技服務，2008，25 (3):50，58” 一文記載的方法，鑒定證實確為麥長管姆(Sitobion avenae)。其形態學特征如下:無翅孤雌姆體長
3.1_，寬1.4_，長卵形，草綠色至橙紅色，有時頭部帶紅色或褐色，腹部兩側有不明顯的灰綠至灰黑色斑。觸角黑色，第3節有8 —12個感覺圈排成一行。腹部第6— 8節及腹面具橫網紋，無緣瘤。喙粗大，黑色，長度超過中足基節。腹管長圓筒形，黑色，長為體長的1/4，在端部有十幾行網紋。有翅孤雌蚜體長3.0mm，橢圓形，綠色。喙不達中足基節。腹管長圓筒形，黑色，端部具15~16行橫行網紋，尾片長圓錐狀，有8~9根毛。若蚜體綠色，有時粉紅色，復眼紅色，一般體較短。
[0054]pHurricane載體:記載于“張付蕓，陳偉霞,劉子渲,李保云,梁榮奇.小麥SS I1-A基因片段的克隆及其RNAi表達載體的構建.中國農學通報，2011，27 (7):50_54”一文中的“H質粒”。
[0055]pBAC35SIH3載體:記載于“隋曉燕，趙琰，王樹彬等.無載體框架結構的大豆鐵蛋白線性表達盒提高小麥籽粒鐵含量的研究.農業生物技術學報，2012，20(7):766~773”一文中，用于基因槍遺傳轉化后抗性愈傷組織的篩選。
[0056]小麥(Triticum aestivum L.)品種遼春10號:由遼寧省農業科學院用雜交方法選育的強筋小麥新品種，1998年通過全國農作物品種審定委員會審定。參見“劉振元.強筋麥新品種遼春10號高產栽培技術.中國種業，2001年第6期”一文。公眾可從商業途徑獲得，也可從中國農業大學獲得，以重復本申請實驗。
[0057]實施例1、表達抑制麥長管蚜羧酸酯酶的發卡RNA的DNA分子的獲得
[0058]一、麥長管蚜羧酸酯`酶基因SaCbE E4目的片段獲得
[0059]設計如下2 對引物 Pl-sF/Pl-sR 和 Pl-asF/Pl-asR:
[0060]Pl-sF:5，-GGATCCAAGTATTGCGCAAGATGAGGGTC-3，(下劃線處為 Bam H I 酶切位點，其后的序列為序列I的第1-23位)；
[0061]Pl-sR:5，-AAGCTT GCTACGTAAGAATAATTACCAC-3’(下劃線處為 Hind III 酶切位點，其后的序列為序列I的第324-345位的反向互補序列)。
[0062]Pl-asF:5，_GGTACC AAGTAITGCGCAAGATGAGGGTC-3’(下劃線處為 Kpn I 酶切位點，其后的序列為序列I的第1-23位)；
[0063]Pl-asR:5’ -GAGCTC GCTACGTAAGAATAATTACCAC-3’(下劃線處為 Sac I 酶切位點，其后的序列為序列I的第324-345位的反向互補序列)。
[0064]2對引物的擴增片段長度均為345bp (不包括額外添加的酶切位點)。
[0065]取麥長管蚜成蟲，按照美萊博RNA提取試劑盒提取總RNA(圖1)。圖中，28S、18S都很清晰，說明提取的總RNA可以用于RT-PCR。以該總RNA為模板、分別以第一對引物(Pl_sR和Pl-sF)和第二對引物(Pl-asR和Pl-asF)進行RT-PCR，均得到0.35Kb左右的麥長管蚜羧酸酯酶基因SaCbE E4目的片段(圖2)，分別將目的片斷從瓊脂糖膠回收后連到pGEM-Teasy載體(promega公司)上,熱激轉化大腸桿菌DH5 a菌株,經藍白斑篩選陽性克隆,提取質粒，并進行酶切鑒定及測序。
[0066]將經測序表明在pGEM-Teasy載體上連入大小約為0.35Kb的DNA片段I (命名為DNA片段CbE E4-1) “GGATCC+序列I的第1-345位+AAGCTT，，的重組質粒命名為pTE_CbEE4-1 ;將經測序表明在pGEM-Teasy載體上連入大小約為0.35Kb的DNA片段2 (命名為DNA片段CbE E4-2)“GGTACC+序列I的第1-345位+GAGCTC”的重纟目質粒命名為DTE-CbE E4-2。
[0067]二、重組表達載體pBAC-rbcs-CbE E4的構建及鑒定
[0068]1、目的片段反向插入FAD2Intronl的下游
[0069]用BamH I和Hind III同時酶切步驟一構建的pTE-CbE E4-1以及pHurricane載體(質粒圖譜如圖3所示)，電泳后分別回收前者約0.35Kb片段和后者的大片段，連接這兩個片段，轉化感受態大腸桿菌DH5 a菌株，涂板，挑斑，搖菌，提取重組質粒，將其命名為pBSK-FAD2Il-CbE E4。
[0070]用限制性內切酶BamH I和Hind III對pTE-CbE E4-1、pHurricane載體，以及重組質粒pBSK-FAD2Il-CbE E4分別進行雙酶切。結果如圖4所示，酶切pTE_CbE E4-1得到約
0.35Kb的目的片段(泳道I )，酶切pHurricane載體得到約4.0kb的片段(泳道2)，而酶切重組質粒pBSK-FAD2Il-CbE E4得到一條約4.0kb的片段和一條約0.35kb的片段(泳道3)，其中大片段同pHurricane載體大小相符，小片段同目的片段大小相符，證明從pTE_CbE E4-1切下的0.35kb的目的片段已經反向連接到pHurricane載體上。
[0071]進一步，對所述重組質粒pBSK-FAD2Il-CbE E4進行序列測定，結果表明，重組質粒pBSK-FAD2Il-CbE E4為在pHurricane載體上位于FAD2Intronl下游的酶切位點BamH I和Hind III之間反向插入序列I的第1-345位后得到的重組質粒。
[0072]2、目的片段正向插入FAD2Intronl的上游
[0073]用Kpn I 和 Sac I 同時酶切步驟一構建的 pTE-CbE E4-2 以及 pBSK_FAD2Il_CbEE4載體，電泳后分別回收前者約0.35Kb片段和后者的大片段，連接這兩個片段，轉化大腸桿菌DH5 a感受態，涂板，挑斑，搖菌，提取重組質粒，將其命名為pBSK-CbEE4-1R。
[0074]用限制性內切酶KpnI 和 Sac I 對pTE-CbE E4-2、pBSK_FAD2Il_CbE E4，以及重組質粒pBSK-CbE E4-1R分別進行雙酶切。結果如圖5所示，酶切pTE-CbE E4-2得到約0.35kb的目的片段(泳道I )，酶切pBSK-FAD2I1-CbE E4得到約4.35kb的片段(泳道2)，而酶切重組質粒pBSK-CbE E4-1R得到一條約4.35kb的片段和一條約0.35kb的片段(泳道3)，其中大片段同pBSK-FAD2Il-CbE E4大小相符，小片段同目的片段大小相符，證明從pTE_CbE E4-2上切下的0.35kb的目的片段已經連接到pBSK-FAD2Il-CbE E4上。
[0075]進一步，對所述重組質粒pBSK-CbE E4-1R進行序列測定，結果表明，重組質粒pBSK-CbE E4-1R 為在 pBSK-FAD2I1-CbE E4 載體上位于 FAD2Intronl 上游的酶切位點 KpnI和Sac I之間正向插入序列I的第1-345位后得到的重組質粒。
[0076]在重組質粒pBSK-CbE E4-1R中，位于酶切位點Kpn I和BamH I之間的序列即為RNAi構件。所述RNAi構件的序列為序列表中序列I所示。
[0077]3、將RNAi構件置于rbcS啟動子下游
[0078]用限制性內切酶Kpn I和BamH I同時雙酶切pBAC-rbcs-sNTL載體(質粒圖譜如圖6所示，構建過程見下文)和以上構建的重組質粒pBSK-CbE E4-1R，電泳后分別回收前者大小約為4kb的片段和后者大小約為1.88kb的片段，連接這兩個片段，轉化大腸桿菌感受態，涂板，挑斑，搖菌 ，提取重組質粒，將其命名為pBAC-rbcs-CbE E4。
[0079]用限制性內切酶Kpn I 和 BamH I 對 pBSK-CbE E4-1R、pBAC-rbcs_sNTL，以及重組質粒pBAC-rbcs-CbE E4分別進行雙酶切。結果如圖7所示，酶切pBAC-rbcs-sNTL可得到一條大小約為4kb的骨架片段(泳道I )，酶切pBSK-CbE E4R可得到一條大小約為1.88kb的目的片段(泳道2)，而酶切重組質粒pBAC-rbcs-CbE E4則得到一條約4kb的片段和一條約為1.88kb的片段(泳道3)，其中大片段同pBAC-rbcs-sNTL酶切后的骨架片段大小相符，小片段同目的片段大小相符，證明從pBSK-CbE E4R上切下的約1.Skb的目的片段已經連接到pBAC-rbcs-sNTL 的 Kpn I 和 BamH I 位點之間。
[0080]進一步,對所述重組質粒pBAC-rbcs-CbE E4進行序列測定，結果表明，重組質粒pBAC-rbcs-CbE E4為在pBAC-rbcs-sNTL載體的rbcS啟動子下游的酶切位點Kpn I和BamHI之間插入序列表中序列I后得到的重組質粒。
[0081]重組表達載體pBAC-rbcs-CbE E4的質粒示意圖如圖8所示。在重組表達載體pBAC-rbcs-CbE E4中，啟動所述序列I所示DNA片段轉錄的啟動子為rbcS啟動子,其核苷酸序列如序列表中序列3所示。序列I由1857個核苷酸組成。其中，第1-345位為SaCbE E4基因片段的正向序列；第378-1495位為FAD2內含子核苷酸序列(序列2);第1513-1857位為所述SaCbE E4基因片段的反向序列。正向序列和反向序列之間由一段內含子(intixm)序列隔開以維持載體的穩定性；該系統在植物細胞中轉錄產生帶發夾結構(hairpin)的dsRNA，引發RNAi，從而可用于抑制目的基因的表達。
[0082]其中，pBAC-rbcs-sNTL載體的構建方法及后續的篩選鑒定過程參見文獻uSambrook J,Fritsch E F，Maniatis T.Molecular cloning - A laboratory Mauual, 2nded., New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.”。具體方法如下:
[0083]I)將載體PBAC202 (參考文獻“高澤發，陳旭清，楊鳳萍，梁榮奇，張立全，張曉東.人工合成gna基因在小麥中的表達 及其抗蚜蟲效果研究，農業生物技術學報，2006，14(4): 559-564”)用 BamH I 和 Kpn I 酶切，回收 3.8Kb 載體片段。
[0084]2)由上海捷瑞生物工程有限公司人工化學合成sNTL基因全長(5’端加上BamH I酶切位點，3’端加上Kpn I酶切位點)，經過DNA測序證明正確。sNTL基因⑶S全長為序列表中序列4。
[0085]3)BamH I和Kpn I雙酶切上一步獲得的sNTL基因片段和用BamH I和Kpn I酶切載體pBAC202得到的3.8kb載體片段連接后，選擇sNTL方向和rbcs啟動子方向一致的重組載體，命名為pBAC-rbcs-sNTL。重組載體pBAC-rbcs-sNTL的結構描述為:在載體pBAC202的酶切位點BamH I和Kpn I之間插入了序列表中序列4所示DNA片段后得到的重組載體。
[0086]實施例2、SaCbE E4的RNAi轉基因小麥的獲得及鑒定
[0087]一、SaCbE E4的RNAi轉基因小麥的獲得
[0088]選取開花后12-15天的小麥品種遼春10號的幼穗，將其種子消毒后剝取幼胚，盾片向上置于幼胚接種培養基(配方:MS基本培養基+2，4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉7g/L，pH5.8。各濃度為相應組分在培養基中的終濃度)上，25土TC暗培養3-5天誘導出小麥愈傷組織。選擇生長狀態良好的愈傷組織塊進行基因槍共轉化(將pBAC-rbcs-CbE E4和pBAC35SIH3按照3:1摩爾比混合，其中pBAC35SIH3質粒帶有除草劑Basta的抗性基因bar)，轉化后的愈傷25土 TC暗培養2_3天后移至篩選培養基(配方:幼胚接種培養基+Basta2-25mg/L。各濃度為相應組分在培養基中的終濃度)上進行除草劑抗性篩選；觀察篩選1-2周之后，將生長狀態良好的抗性愈傷組織轉移到分化培養基(配方:MS基本培養基+玉米素lOmg/L+Basta0.5mg/L, pH5.8。各濃度為相應組分在培養基中的終濃度)上使其分化，大約4-5周后可分化出幼苗，將其轉移到生根壯苗培養基(配方:MS培養基+IAA10mg/L，PH5.8。各濃度為相應組分在培養基中的終濃度)中進行生根壯苗；煉苗2-3天后移栽至土壤中可長成Ttl代轉基因植株。
[0089]同時設置向小麥品種遼春10號中轉入pBAC-rbcs-sNTL空載體的對照。
[0090]二、SaCbE E4的RNAi轉基因小麥的鑒定
[0091]用針對RNAi構件的引物對P4-F/P4-R，以及針對FAD2Intronl的引物對P6-R/P6-F對步驟一獲得具有Basta抗性的SaCbE E4的RNAi轉基因小麥的Ttl-T4代植株進行PCR鑒定。以重組表達載體pBAC-rbcs-CbE E4作為陽性對照，未轉基因的小麥品種遼春10號為陰性對照，同時設置向小麥中轉入pBAC-rbcs-sNTL的空載體對照。實驗重復3次。
[0092]針對RNAi構件的引物:
[0093]P4-F:5’ -AAGTAITGCGCAAGATGAGGGTC-3’(序列 I 的第 1-23 位)；
[0094]P4-R:5’-GCTACGTAAGAATAATTACCAC-3’ (序列 I 的第 324-345 位的反向互補序列)。
[0095]針對FAD2Intronl 的引物:
[0096]P6-F:5’ -GGTAACGATTCAAGAGAGTCTTC-3，(序列 2 的第 79-101 位)。
[0097]P6-R:5’-CCGCTCACGATAGATCTGCT-3’(序列 2 的第 1004-1023 位的反向互補序列)；
[0098]結果如圖9所示，作為陽性對照的pBAC-rbcs-CbE E4質粒擴增出大小約為0.35kb和Ikb的兩個目標帶，而作為陰性對照 的未轉基因植株和轉入pBAC-rbcs-sNTL的空載體的植株均沒有擴出目標片段；而SaCbE E4的RNAi轉基因小麥可同時擴增出0.35kb和Ikb左右的兩個目標片段的為陽性植株。從陽性植株中隨機選取兩株，分別命名為SadsCbEl-5和SadsCbE2-2。
[0099]實施例3、SaCbE E4的RNAi轉基因小麥對麥長管蚜防治效果研究
[0100]麥長管蚜種群，室內飼養蚜蟲三代，期間從未施用過任何殺蟲劑。室內飼養溫度為21±1°C，相對濕度為50-60%，光周期為L:D=16h:8h。蚜蟲飼養在感蚜小麥品種京411上，兩周更換一次新鮮的幼苗用于蚜蟲。
[0101]一、SaCbE E4的RNAi轉基因小麥對麥長管蚜羧酸酯酶基因表達量干擾效果分析
[0102]以處于一齡若蟲時期的麥長管蚜為實驗材料，分別飼喂在T3代處于兩葉一心幼苗期的SaCbE E4的RNAi轉基因株系SadsCbEl-5和SadsCbE2_2上I天、3天、5天(用紗網單株隔離)。利用qRT-PCR技術分析麥長管蚜體內羧酸酯酶基因的表達量。具體操作如下:
[0103]利用Primer5.0軟件設計羧酸酯酶基因SaCbE E4的擴增引物對P2-F/P2-R (擴增片段大小為343bp)，設計內參基因P-actin的擴增引物對P3-F/P3-R (擴增片段大小為238bp)。
[0104]羧酸酯酶基因SaCbE E4的擴增引物:
[0105]P2-F:5，-TGGTTGGGAGTGTGGAAC-3，；
[0106]P2-R: 5，-AGCAAATCCTAATACGCCC-3，。
[0107]內參基因P -actin的擴增引物:
[0108]P3-F:5， -CCGAAAAGCTGTCATAATGAAGACC-3，；
[0109]P3-R: 5，-GGTGAAACCTTGTCTACTGTTACATCTTG-3，。
[0110]取分別飼喂在T3代處于兩葉一心幼苗期的SaCbE E4的RNAi轉基因株系SadsCbEl-5和SadsCbE2-2上I天、3天、5天的麥長管蚜，按照美萊博RNA提取試劑盒提取總RNA0取500ng的總RNA反轉錄為cDNA,稀釋10°、IO1UO2UO3' 104、IO5倍，作為熒光定量PCR的模板，檢測以上設計的兩對引物的特異性。
[0111]擴增體系:引物(IOiimol ? OOJiiLJXTrans Start TM Green qPCRSuperMixlO U L、Passive Reference Dye0.4 U L、模板 cDNA2 U L, ddH20 補充至 20 U L。
[0112]PCR 循環程序:95°C 35s ；95°C 5s，60°C 35s，72°C 10s，35 個循環；每個樣本 3 個重復。
[0113]最終結果的計算采用2_AAct法(Ct表示循環數)進行計算，使用EXcel2003軟件進行統計學分析，具體參見 “Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCR and the2 AAct method.Methods25 (4):402~408.”一文,使用Excel2003軟件進行統計學分析,計算每種處理的平均值與方差，并進行顯著性差異的分析(t-test，n=3, P < 0.01或0.05)。
[0114]實驗重復3次，結果取平均值。
[0115]同時設置以未轉基因的小麥品種遼春10號(CK)和轉入pBAC-rbcs-sNTL空載體的小麥植株飼喂麥長管蚜的對照。
[0116]結果如圖10所示，從圖中可以看出，麥長管蚜取食SadsCbEl-5葉片1-3天后，其體內羧酸酯酶基因表達量較對照(CK)降低，在第5天時達到極顯著水平(p〈0.01);麥長管蚜取食轉基因株系SadsCbE2-2葉片1_3天后，麥長管蚜羧酸酯酶基因表達量較對照(CK)顯著降低(p〈0.05),在第5天時達到極顯著水平(p〈0.01)。而對于用轉入pBAC-rbcs-sNTL空載體的小麥植株飼喂麥長管蚜的對照組，其結果與未轉基因對照(CK)基本一致，無統計學差異。以上結果表明，SaC·bE E4的RNAi轉基因小麥可有效降低麥長管蚜體內羧酸酯酶的表達量。
[0117]二、SaCbE E4的RNAi轉基因小麥對麥長管蚜羧酸酯酶活性影響分析
[0118]以處于一齡時期的麥長管蚜麥長管蚜為實驗材料，分別飼喂在T3代SaCbE E4的RNAi轉基因株系SadsCbE1-5和SadsCbE2-2上3天、5天(用紗網單株隔離)。用蒸餾水沖洗麥長管蚜，然后放在濾紙上吸干，放入玻璃勻漿器中，分別加入濃度為0.04mol/L的pH7.0的磷酸緩沖液(PBS)冰浴勻漿，勻漿液在4°C下，8000r/min離心IOmin (離心半徑為Ilcm),取上清液作為羧酸酯酶酶源。按照van Asperene方法(參見“Van Asperen KA.studyof housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method.Journal ofInsect Physiology, 1962,8(4):401~414” 一文)測定姆蟲體內羧酸酯酶的活性,具體如下:將酶源用濃度0.04mol/L PH7.0PBS溶液適當稀釋后取lml，加入濃度為3X10_4mol/L的底物a -乙酸萘酯(a -NA, Sigma公司生產，目錄號R9461)的水溶液1.0ml和濃度為l(T4mol/L的毒扁豆堿(Sigma公司，目錄號E8375_250mg)的水溶液0.01ml,混勻后于37°C恒溫水浴中反應10min,然后加入0.5ml顯色液,搖勻后靜置15min,于590nm處比色測定，以PBS取代酶液作為對照。其中，顯色液的配方如下:1%固藍B鹽溶液:5%SDS溶液=體積比2: 5，現用現配。其中，1%固藍8鹽(分子式(:141112(:12財02*2%12，分子量475.46，深綠色粉末，溶于水)溶液的配方如下:稱取0.4g固藍B鹽加ddH2025ml，即得1%固藍B鹽溶液。5%SDS (十二烷基苯磺酸鈉)溶液的配方如下:稱取1.0gSDS加ddH2020mL，即得5%SDS溶液。[0119]以上方法測定羧酸酯酶的活性的原理:底物a -乙酸萘酯(a -NA)在羧酸酯酶的作用下發生水解生成a-萘酚，a-萘酚與固藍B鹽作用，生成深藍色或深紅色物質，在590nm處比色測定其吸光度。羧酸酯酶的活性越強，生成a _萘酚的量越大，進而生成的深藍色或深紅色物質越多，致使所測得的0D590值越大。在37°C和pH7.0條件下，反應前后每毫升酶液每分鐘使吸光度上升(或下降)1.00，定義為I個酶活單位(U/mLXmin)。
[0120]實驗重復3次，結果取平均值。
[0121]同時設置以未轉基因的小麥品種遼春10號(CK)和轉入pBAC-rbcs-sNTL空載體的小麥植株飼喂麥長管蚜的對照。
[0122]結果如圖11所示，從圖中可以看出，麥長管蚜取食SadsCbEl-5葉片3天或5天后，麥長管蚜體內羧酸酯酶的活性較對照(CK)均顯著降低(p〈0.05);麥長管蚜取食轉基因株系SadsCbE2-2葉片3天或5天后，麥長管蚜體內羧酸酯酶的活性較對照(CK)均極顯著降低(p〈0.01)。而對于用轉入pBAC-rbcs-sNTL空載體的小麥植株飼喂麥長管蚜的對照組，其結果與未轉基因對照(CK)基本一致，無統計學差異。以上結果表明，SaCbE E4的RNAi轉基因小麥可有效降低麥長管蚜體內羧酸酯酶的活性。
[0123]三、SaCbE E4的RNAi轉基因小麥對麥長管蚜耐藥性干擾效果分析
[0124]以處于一齡時期的麥長管蚜為實驗材料，分別飼喂在T3代SaCbE E4的RNAi轉基因株系SadsCbEl-5和SadsCbE2-2上5天(用紗網單株隔離)。
[0125]辛硫磷溶劑:0，0_ 二乙基-0-(苯乙腈酮肟)硫代磷酸酯，分子式:C12H15N203PS，分子量:298.18。
[0126]辛硫磷溶劑能夠水解a_萘酚，羧酸酯酶能夠酶解辛硫磷溶劑，因此，通過用分光光度計測定a-萘酚的濃度 來估算辛硫磷溶劑，進而估算羧酸酯酶的活性(參考文獻:Devonshire AL.The properties of a carboxylesterase from the peachpotatoaphid, Myzus persicae(Sulz.), and its role in conferring insecticide resistance.Biochem.J., 1977, 167:675 ~683 ；Lan WS, Jian C, Jiang H, et al.Expression andcharacterization of carboxylesterase E4gene from peach-potato aphid(Myzuspersicae)for degradation of Carbaryl and Malathion) ?Biotechno logyLetters, 2005，27:1141-1146)。具體操作如下:
[0127]1、分別取食喂5天的麥長管蚜，用蒸餾水沖洗，然后放在濾紙上吸干，放入玻璃勻漿器中，分別加入0.04mol/L pH值7.0的磷酸緩沖液(PBS)冰浴勻漿，勻漿液于4°C，8000r/min離心IOmin,取上清液作為羧酸酯酶酶源。
[0128]2、將4mL酶液(對照為0.04mol/L pH=7.0的PBS緩沖液)和ImLlOO u M辛硫磷溶液加入到 15mL10mM KH2P04/K0H 緩沖液(pH=7.5)(配方:將 1.36g 無水 KH2PO4 溶于 1000mL蒸餾水中，用KOH顆粒調節pH值至7.5)中，反應體系20mL。37°C溫育。每隔5min取一次樣(2mL)。
[0129]3、中步驟2的2mL溶液中加入濃度為3X 10_4mol/L的底物a -乙酸萘酯(a -NA,Sigma公司生產，目錄號R9461)的水溶液1.0ml和濃度為l(T4mol/L的毒扁豆堿(Sigma公司，目錄號E8375-250mg)的水溶液0.01ml，混勻后于37°C恒溫水浴中反應lOmin，再加入
0.5ml的DBLS，混合均勻后于590nm處比色測定OD值，從而估算羧酸酯酶活性。在37°C和PH7.0條件下，反應前后每毫升酶液每分鐘使吸光度上升(或下降)100，定義為I個酶活單位(U/mLXmin)。其中 DBLS 由 45mg 固藍 B 鹽、4.5mL H2OU0.5mL5%SDS 配制而成。5%SDS(十二烷基苯磺酸鈉)溶液的配方如下:稱取1.0gSDS加ddH2020mL，即得5%SDS溶液。
[0130]實驗重復3次，結果取平均值。
[0131]同時設置以未轉基因的小麥品種遼春10號(CK)和轉入pBAC-rbcs-sNTL空載體的小麥植株飼喂麥長管蚜的對照。
[0132]結果如圖12所示，從圖中可以看出，SaCbE E4的RNAi轉基因株系上飼喂的麥長管蚜的羧酸酯酶活性降低，對辛硫磷溶劑的水解速度較對照(CK)變慢。而對于用轉入pBAC-rbcs-sNTL空載體的小麥植株飼喂麥長管蚜的對照組，其結果與未轉基因對照(CK)基本一致，無統計學差異。以上結果表明，SaCbE E4的RNAi轉基因小麥可有效降低麥長管蚜的耐藥性，使其對藥物更加敏感。
[0133]四、SaCbE E4的RNAi轉基因小麥對麥長管蚜繁殖率的影響
[0134]以處于一齡時期的麥長管蚜為實驗材料，分別飼喂在T3代SaCbE E4的RNAi轉基因株系SadsCbEl-5和SadsCbE2-2上15天(用紗網單株隔離)。飼喂在兩種轉基因株系上的麥長管蚜的初始數量均為10頭。飼喂15天后，統計各轉基因株系上麥長管蚜的數目。
[0135]實驗重復3次，結果取平均值。
[0136]同時設置以未轉基因的小麥品種遼春10號(CK)和轉入pBAC-rbcs-sNTL空載體的小麥植株飼喂麥長管蚜的對照。
[0137]結果如圖13所示，從圖中可以看出，轉基因株系SadsCbEl-5和SadsCbE2_2上的蟲牙蟲數目均較對照(CK)極顯著 降低(p〈0.01)。而對于用轉入pBAC-rbcs-sNTL空載體的小麥植株飼喂麥長管蚜的對照組，其結果與未轉基因對照(CK)基本一致，無統計學差異。以上結果表明，SaCbE E4的RNAi轉基因小麥可有效降低麥長管蚜的繁殖率。
【權利要求】
1.如式(I)所示的DNA片段: SEQ正向-X-SEQ反向(I) 所述SEQM的序列為序列I的第1-345位； 所述SEQ的序列與所述序列反向互補； 所述X是所述SEQ1^1與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ1向及所述SEQfi^1均不互補。
2.根據權利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述X的序列如序列表中序列2所示。
3.根據權利要求1或2所述的DNA片段，其特征在于:所述DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列I所示。
4.含有權利要求1-3中任一所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為重組表達載體或重組克隆載體； 所述重組表達載體中啟動所述基因轉錄的啟動子具體為rbcS啟動子。
6.權利要求1-3中任一所述的DNA片段編碼得到的RNA分子。
7.權利要求1-3中任一所述的DNA片段，或權利要求4或5所述的重組表達載體、表達盒或重組菌，或權利要求6所述的RNA分子在如下al) -a6)任一中的應用: al)抑制麥長管蚜羧酸酯酶表達； a2)降低麥長管蚜羧酸酯酶活性； a3)降低麥長管蚜的耐藥性； a4)降低麥長管蚜的繁殖率； a5)防治麥長管蚜； a6)培育抗麥長管蚜的轉基因植物。
8.一種培育抗麥長管蚜的轉基因植物的方法，包括如下步驟:將權利要求1-3中任一所述的DNA片段導入目的植物中，得到抗麥長管蚜的轉基因植物； 所述抗麥長管蚜具體體現在如下bl) -b4)中的至少一種: bl)抑制麥長管蚜的羧酸酯酶表達； b2)降低麥長管蚜的羧酸酯酶活性； b3)降低麥長管蚜的耐藥性； b4)降低麥長管蚜的繁殖率。
9.根據權利要求7所述的應用，或權利要求8所述的方法，其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
10.根據權利要求9所述的應用方法，其特征在于:所述單子葉植物具體為小麥。
【文檔編號】A01N57/16GK103589728SQ201310552870
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月8日 優先權日:2013年11月8日
【發明者】梁榮奇, 倪中福, 許蘭杰, 段曉亮, 呂延華, 尤明山, 解超杰, 李保云, 彭惠茹, 姚穎垠, 杜金昆, 劉志勇, 胡兆榮, 孫其信 申請人:中國農業大學