提高家蠶突變頻率的育種方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高家蠶突變頻率的育種方法，包括以下步驟：1）、取4齡第3天幼蟲～熟蠶時為止的各個發育階段的家蠶幼蟲作為待處理家蠶幼蟲；2）、先在1.5～2.5mm厚的遮擋板上制作與待處理家蠶幼蟲的生殖巢部位的形狀和大小相吻合的照射孔，然后將照射孔對準待處理家蠶幼蟲的生殖巢部位；輻照用射線通過照射孔對待處理家蠶幼蟲的生殖巢部位進行輻照；3）、將照射后幼蟲與未照射的對照幼蟲同時按相同的方法進行飼養；熟蠶時使其吐絲、結繭及羽化；4）、將照射后的羽化成蟲和未照射的羽化成蟲交尾，產卵；對所得的飼養輻照家蠶下一代進行突變個體的選擇。
【專利說明】提高家蠶突變頻率的育種方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于誘變育種【技術領域】，涉及一種提高突變頻率的家蠶誘變育種方法。
【背景技術】
[0002]誘變是對遺傳基因進行調控產生變異的一種基本方法。通過誘變能誘發家蠶基因產生突變，促進遺傳基因重組，擴大遺傳變異，是創造新種質、選育新品種的有效途徑之一。目前常采用的方法是利用物理、化學等誘變因素等來實現。其中物理誘變因素主要是用高能量射線直接輻照家蠶生物體，但這種方法的缺點是輻照引起的致死率太高，突變頻率太低，而且因輻照產生生理損傷使得突變體穩定性不好；化學誘變因素主要是用化學誘變劑處理家蠶幼蟲或蛹體，使化學誘變劑與家蠶細胞內遺傳物質發生作用，但化學誘變的缺點是大部分化學誘變劑都具有強烈的致癌性和揮發性，除對家蠶的生理損傷較大外，對人體的安全性也不容忽視。重離子射線作為一種高能射線，具有照射深度及其照射范圍可以控制等特點。但迄今利用重離子射線對家蠶生殖巢存在部位進行局部輻照誘變的方法還沒有。
【發明內容】
[0003]本發明要解決的技術問題是提供一種提高突變頻率的家蠶誘變育種方法，以及這種誘變育種方法的應用。本發明可在不影響家蠶生理及生存的條件下，在較短時間內從大量輻照后代的材料中進行篩選，從而提高誘變個體的獲得率，明顯縮短了育種周期，使選擇效率大大提高。
[0004]為了解決上述技術問題，本發明提供一種提高家蠶突變頻率的育種方法，包括以下步驟:
[0005]I)、待處理家蠶的準·備:
[0006]取孵化的家蠶幼蟲進行飼育，取4齡第3天幼蟲~熟蠶時為止的各個發育階段的家蠶幼蟲作為待處理家蠶幼蟲；
[0007]家蠶例如為pnd ；
[0008]2)、局部照射方法:
[0009]先在1.5~2.5mm (較佳為2.0mm)厚的遮擋板上制作與待處理家蠶幼蟲的生殖巢部位(存在于第5腹節背部)的形狀和大小相吻合的照射孔，然后將照射孔對準待處理家蠶幼蟲的生殖巢部位(即，僅使家蠶幼蟲的生殖巢存在部位暴露在重離子射線下)；
[0010]輻照用射線通過照射孔對待處理家蠶幼蟲的生殖巢部位進行輻照，輻照劑量為I~30Gy ;所述輻照用射線為重離子射線；得照射后幼蟲；
[0011]3)、照射后的處理:
[0012]將照射后幼蟲與對照幼蟲(未照射)同時按相同的方法(為常規方法)進行飼養；熟蠶時使其吐絲、結繭及羽化；
[0013]分別得照射后的羽化成蟲和未照射的羽化成蟲；[0014]4)、突變個體的選擇:
[0015]將照射后的羽化成蟲和未照射的羽化成蟲交尾、產卵；對所得的飼養輻照家蠶下一代進行突變個體的選擇(即，從下一代中篩選突變的個體，也即為在飼養過程中進行突變率分析及性狀調查)。
[0016]作為本發明的提高家蠶突變頻率的育種方法的改進:
[0017]步驟2)中的重離子射線為碳(C)離子射線，氖(Ne)離子射線、氦(He)離子射線。
[0018]作為本發明的提高家蠶突變頻率的育種方法的進一步改進:
[0019]遮擋板為塑料制品板或金屬板。塑料制品板為丙烯酸樹脂板。
[0020]作為本發明的提高家蠶突變頻率的育種方法的進一步改進:
[0021]當待處理家蠶幼蟲為4齡第3天幼蟲時，輻照劑量為I~9Gy (較佳為I~5Gy);
[0022]當待處理家蠶幼蟲為熟蠶時，輻照劑量為5~29Gy (較佳為5~15Gy)。
[0023]作為本發明的提高家蠶突變頻率的育種方法的進一步改進:飼育所用的飼料為桑葉或家蠶人工飼料。
[0024]綜上所述，本發明的提高家蠶突變頻率的育種方法，是將家蠶(按常規方法)飼養至一定時期，用重離子射線局部照射家蠶幼蟲的生殖巢部位，照射后繼續飼養至成熟，吐絲、結繭及羽化 后交尾產卵，從下一代中篩選突變的個體。
[0025]本發明具有以下優點:
[0026]本發明能很好地解決現有的家蠶誘變育種方法的各種問題。如:現有的物理誘變因素主要是用高能量射線(如激光，伽馬射線、電磁)直接輻照家蠶生物體，但這種方法的缺點是因為家蠶個體全身受輻照，輻照引起的致死率太高，突變頻率太低，突變體因輻照個體生理損傷而使得穩定性不好。化學誘變因素主要是用化學誘變劑處理幼蟲或蛹體，使化學誘變劑與家蠶細胞內遺傳物質發生作用，但化學誘變的缺點是大部分化學誘變劑都具有強烈的致癌性和揮發性，除對家蠶的生理損傷較大外，對人體的安全性也不容忽視。
[0027]本發明公開的家蠶輻照誘變的方法具有下述優點:1)射線的輻照范圍(面積)及照射深度可以控制，對家蠶的損傷幾乎沒有，僅對生殖器細胞產生影響，不會導致家蠶的死亡，對其它生理影響也很小，從而提高了誘變基數；2)利用不同種類的重離子射線能量的不同，對生殖器細胞的刺激效應不同，引起相應DNA的突變或斷裂等遺傳變異的類型不同，可產生的突變種類增加，提高了選擇的范圍；3)處理時間短，大大地節約了人力物力；4)不涉及有毒、有害及致癌等化學物質，安全環保。
[0028]綜上所述，本發明根據家蠶生殖器內的細胞對射線輻照敏感，通過對其進行輻照可以誘發大量的基因突變和染色體畸形的特點，以及根據利用重離子射線的照射深度及其照射范圍可以控制的特點，對家蠶生殖器部位進行重離子射線局部輻照，輻照不會引起家蠶的死亡，僅對生殖器產生影響，誘發生殖細胞內的遺傳物質進行基因突變和染色體畸形等遺傳學變異，同時利用不同種類的重離子射線能量的不同，對生殖器的刺激效應不同，弓丨起相應DNA的突變或斷裂等遺傳變異的類型不同，使產生的突變種類增加，從而提高選擇的范圍，從中篩選或獲得新的可利用突變體，培育出家蠶新品種的一種育種方法。在經濟上具有重要意義，具有廣闊的應用前景。
【具體實施方式】[0029]以下根據實施例詳細介紹本發明，本發明沒有限定這些實施例。
[0030]實施例1:12C5+離子射線輻照家蠶4齡第3天幼蟲生殖巢產生突變體:
[0031](I)試驗家蠶的準備
[0032]家蠶品種(pnd)孵化的幼蟲用桑葉飼育，取4齡第3天的幼蟲用于輻照(即，作為待處理家蠶幼蟲)。
[0033](2)局部輻照方法
[0034]先在2.0mm厚的丙烯酸樹脂板上，制作與4齡第3天的幼蟲生殖巢存在部位(存在于第5腹節背部)的形狀和大小相吻合的8 X 4mm的孔(方形孔)；將生殖巢存在部位對準該孔，并用透明膠帶紙將幼蟲部分固定在照射用實驗臺上，用18.3MeV/u的碳離子(12C5+)射線進行輻照，碳離子射線的水中射程約為1.1mm，樹脂板的厚度為2.0mm,因此，碳離子射線不能穿過該丙烯酸樹脂板。照射劑量I~10Gy。
[0035](3)照射后的處理
[0036]照射后的幼蟲與對照幼蟲(未照射)同時按常規方法給予桑葉飼養。熟蠶時將其放入事先墊有衛生紙的塑料容器內，使其吐絲、結繭、羽化，按常規方法進行調查。照射后羽化的雌性(或雄性)個體與未照射的正常雄蛾(雌蛾)交尾、產卵；飼養輻照后的下一代，在飼養過程中進行突變率分析及相關性狀調查。
[0037](4)輻照效果
[0038]結果表明，IOGy照射時，雖輻照個體沒有發生死亡，但生殖巢內的細胞完全死亡，交尾后的個體不能造卵或受精，在I~9Gy劑量范圍內，福照個體能夠部分造卵或受精,并隨輻照劑量的減少，造卵數、產卵數或受精率等增加。
[0039]l、3、5Gy劑量照射雌性個體，均有較高的突變率(表1)，其中3Gy照射個體能夠有約85%的造卵量及產卵量，通過與未輻照雄蛾交尾后，飼養孵化后的個體，通過對飼養的1405個個體的形態學觀察，發現僅斑紋發生變異的個體有21個，突變發生率達到1.49%;數量性狀調查結果顯示:輻照后的蠶繭量的變異幅度在1.227-1.373g (對照為
1.212-1.279g)，繭層量為0.174-0.206g(對照為0.167-0.189g)，說明輻照引起家蠶數量性狀(蠶繭量及繭層量)的變異幅度明顯加大，這為選擇高蠶繭量及繭層量的家蠶品種(品系)提供了可能。
[0040]表1
[0041]
照射劑平均^n^飼養斑紋突變蠶m量苗層量 量造卵數產量數個體數個數(％) 變幅(g) 變幅(g)
(Gy) (個) (個) (個)____
I382~ 351 — 1587 20( 1.26%)~ 1.212-1.303 0.163-0.199~
3353329 ~ 1405 21(1.49 %) ' 1.227-1.373 0.174-0.206
5231一 207 — 1267 27(2.13%)~ 1.222-1.448 0.168-0.2 lT
—^照 4164011246-- 1.212-1.279 0.167-0.189
[0042]備注說明:
[0043]上述l、3、5Gy劑量照射下，輻照個體均沒有發生死亡現象，羽化率均為100%。
[0044]對比例1、相對于實施例1而言,作如下改動:[0045]取消步驟2)的局部輻照中所用的丙烯酸樹脂板；即，將用18.3MeV/u的碳離子(12C5+)射線直接照射4齡第3天的幼蟲；
[0046]上述l、3、5Gy劑量照射下，輻照個體的羽化率分別為97.14%,88.89%及69.44%，雖IGy的照射對羽化率幾乎沒有影響，但存在5齡經過延長等問題。
[0047]實施例2:12C5+離子射線輻照家蠶4齡第3天幼蟲生殖巢產生突變體
[0048]( I)試驗家蠶的準備
[0049]家蠶品種(pnd)孵化的幼蟲用桑葉飼育，取4齡第3天的幼蟲用于輻照(即，作為待處理家蠶幼蟲)。
[0050](2)局部輻照方法
[0051]先在2.0mm厚的丙烯酸樹脂板上，制作與4齡第3天的幼蟲生殖巢存在部位(存在于第5腹節背部)的形狀和大小相吻合的8 X 4mm的孔；將生殖巢存在部位對準該孔，并用透明膠帶紙將幼蟲部分固定在照射用實驗臺上，用18.3MeV/u的碳離子(12C5+)射線進行輻照，碳離子射線的水中射程約為1.1mm，樹脂板的厚度為2.0mm，因此，碳離子射線不能穿過該丙烯酸樹脂板。照射劑量I~IOGy。
[0052](3)照射后的處理
[0053]照射后的幼蟲與對照幼蟲(未照射)同時按常規方法給與桑葉飼養。熟蠶時將其放入事先墊有衛生紙的塑料容器內，使其吐絲、結繭、羽化，按常規方法進行調查。照射后羽化的雌性(或雄性)個體與未照射的正常雄蛾(雌蛾)交尾、產卵；飼養輻照后的下一代，在飼養過程中進行突變率分析及相關性狀調查。
·[0054](4)輻照效果
[0055]結果表明，IOGy照射時，雖輻照個體沒有發生死亡，但生殖巢內的細胞完全死亡，交尾后的個體不能造卵或受精，在I~9Gy照射劑量范圍內，輻照個體能夠部分造卵或受精，并隨輻照劑量的減少，造卵數、產卵數或受精率等增加。
[0056]l、3、5Gy劑量照射雄性個體，均有較高的突變率(表2)，其中3Gy劑量輻照雄性個體，照射個體能正常與雌蛾交尾，受精率在80%以上；飼養孵化后的個體，通過對飼養的1338個個體的形態學觀察，發現僅斑紋發生變異的個體有24個，突變發生率達到
1.79% ;數量性狀調查結果顯示:輻照后的蠶繭量的變異幅度在1.219-1.353g (對照為
1.201-1.253g)，繭層量為0.161-0.203g(對照為0.161-0.182g)，說明輻照引起家蠶數量性狀(蠶繭量及繭層量)的變異幅度明顯加大，這為選擇高蠶繭量及繭層量的家蠶品種(品系)提供了可能。
[0057]表2
【權利要求】
1.提高家蠶突變頻率的育種方法，其特征是包括以下步驟: 1)、待處理家蠶的準備: 取孵化的家蠶幼蟲進行飼育，取4齡第3天幼蟲~熟蠶時為止的各個發育階段的家蠶幼蟲作為待處理家蠶幼蟲； 2)、局部照射方法: 先在1.5~2.5mm厚的遮擋板上制作與待處理家蠶幼蟲的生殖巢部位的形狀和大小相吻合的照射孔，然后將照射孔對準待處理家蠶幼蟲的生殖巢部位； 輻照用射線通過照射孔對待處理家蠶幼蟲的生殖巢部位進行輻照，輻照劑量為I~30Gy ;所述輻照用射線為重離子射線；得照射后幼蟲； 3)、照射后的處理: 將照射后幼蟲與未照射的對照幼蟲同時按相同的方法進行飼養；熟蠶時使其吐絲、結繭及羽化； 分別得照射后的羽化成蟲和未照射的羽化成蟲； 4)、突變個體的選擇: 將照射后的羽化成蟲和未照射的羽化成蟲交尾，產卵；對所得的飼養輻照家蠶下一代進行突變個體的選擇。
2.根據權利 要求1所述的提高家蠶突變頻率的育種方法，其特征是: 步驟2)中的重離子射線為碳離子射線，氖離子射線、氦離子射線。
3.根據權利要求2所述的提高家蠶突變頻率的育種方法，其特征是:所述遮擋板為塑料制品板或金屬板。
4.根據權利要求3所述的提高家蠶突變頻率的育種方法，其特征是:所述塑料制品板為丙烯酸樹脂板。
5.根據權利要求1~4任一所述的提高家蠶突變頻率的育種方法，其特征是: 當待處理家蠶幼蟲為4齡第3天幼蟲時，輻照劑量為I~9Gy ; 當待處理家蠶幼蟲為熟蠶時，輻照劑量為5~29Gy。
6.根據權利要求5所述的提高家蠶突變頻率的育種方法，其特征是:所述飼育所用的飼料為桑葉或家蠶人工飼料。
【文檔編號】A01K67/04GK103621475SQ201310547646
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月6日 優先權日:2013年11月6日
【發明者】屠振力 申請人:浙江大學