一種翹嘴鲌雌核發育誘導方法
【專利摘要】本發明公開了一種翹嘴鲌雌核發育誘導方法，包括如下步驟：（1）采集鯉魚精液；（2）對鯉魚精液進行紫外線遺傳滅活處理；（3）采集翹嘴鲌成熟卵子，用經過紫外線遺傳滅活處理后的鯉魚精液進行干法授精；（4）受精卵進行冷休克處理后放入孵化容器中進行孵化，正常成活的魚苗為雌核發育魚。本發明采用普通鯉魚的紫外線遺傳滅活精子刺激翹嘴鲌卵子，通過冷休克抑制卵子第二極體釋放促使染色體加倍的方法，成功獲得翹嘴鲌雌核發育個體。由于正常存活個體即為雌核發育魚，不需要再進行后續的染色體、遺傳標記等鑒定分析，顯著簡化了鑒定程序。
【專利說明】一種翹嘴鉑雌核發育誘導方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及魚類生物技術，尤其涉及一種翹嘴舶雌核發育誘導方法。
【背景技術】
[0002]翅嘴舶(CWierBasilewsky)是我國重要的淡水經濟魚類之一。目前，養殖用翹嘴舶大部分仍停留在利用天然親魚或多代選留的養殖種，不僅其養殖性狀未被挖掘，而且由于親本選擇不當、近親繁殖等原因，養殖性狀已出現生長緩慢、肉質品質下降等不同程度的種質衰退現象。人工雌核發育誘導是魚類快速固定母本性狀和進行性別控制的重要技術手段，可加快魚類尤其是世代周期較長魚類的育種進程和效率。已有研究表明，經過一次人工雌核發育誘導約相當于14世代全同胞交配選育，多數魚類經過連續兩次雌核發育就可以作為品系(種)親本用于育種生產。然而，魚類雌核發育誘導方法常因種類和選用的刺激源不同而有所差異。選擇遺傳距離較遠且雜交不育的魚類精子作為激活源，不僅可獲得大量雌核發育魚，而且子代易于鑒別，是一種良好的雌核發育誘導方法。前期，我們開展了鯉魚與翹嘴舶的雜交試驗，結果表明，鯉魚精子能激活翹嘴舶卵子發育，但因染色體數目不匹配等原因，孵化出膜仔魚多數畸形且出膜不久后死亡，顯示鯉魚可以作為翹嘴舶雌核發育誘導的激活源。目前，有關翹嘴舶雌核發育誘導仍未見報道。為此，我們選擇鯉魚精子作為激活，經紫外線滅火精子遺傳物質，冷休克抑制卵子第二極體釋放，成功建立了翹嘴舶異源雌核誘導方法，并獲得了大量第一代雌核發育魚和多個第二代雌核發育魚家系，為后續翹嘴舶選育及全雌育種提供 了重要的技術支撐。
【發明內容】
[0003]本發明目的在于提供一種翹嘴舶雌核發育誘導方法，選取鯉魚精子作為激活源，經紫外線遺傳滅活，進而冷休克處理抑制卵子第二極體釋放，不僅獲得了大批量翹嘴舶雌核發育魚，而且還極大的簡化雌核發育魚的鑒定工作。
[0004]本發明的技術方案為:一種翹嘴舶雌核發育誘導方法，包括如下步驟:
(1)采集鯉魚精液；
(2)對鯉魚精液進行紫外線遺傳滅活處理；
(3)采集翹嘴舶成熟卵子，用經過紫外線遺傳滅活處理后的鯉魚精液進行干法授精；
(4)受精卵進行冷休克處理后放入孵化容器中進行孵化，正常成活的魚苗即為雌核發育魚。
[0005]受精卵于授精后l_6min內進行10_35min的冷休克處理。
[0006]受精卵在2-4°C的溫度下進行冷休克處理。
[0007]所述受精卵授精后4分鐘進行冷休克處理。
[0008]所述受精卵進行冷休克處理的最佳時間為15分鐘。
[0009]鯉魚精子在進行紫外線遺傳滅活處理時，處理到60-70%的鯉魚精子仍具有活力后停止紫外線處理，將處理后的鯉魚精子保存用于第(3 )步的授精。[0010]鯉魚精子的紫外線遺傳滅活處理方法為:
A、用Hank’s氏液按體積比1:5稀釋鯉魚精子，將稀釋后的鯉魚精子均勻涂在4°C預冷的培養皿中；
B、用紫外線燈對培養皿上的精液進行照射，照射過程中緩慢搖動培養皿使照射均勻；
C、每隔2-4min觀察精子活力，當60-70%的鯉魚精子具有活力時停止照射。
[0011]紫外線遺傳滅活處理后的精液保存于4°C的遮光容器中。
[0012] 用于采集鯉魚精液的雄鯉魚親本為2-3齡，體重0.5 kg以上的健康雄鯉魚。
[0013]用于采集翹嘴舶卵子的翹嘴舶雌魚親本按以下方式進行強化培育:
a、將體重1.0kg以上的翹嘴舶進行專池培育，雌雄比2:1;
b、培育初期投喂膨化配合飼料，后期增投鮮活餌料(野生小雜魚)；
C、繁殖季節時，挑選雌雄翹嘴舶親本，人工催產后放入催產池中，流水刺激，雌雄比
1:2。
[0014]有益效果:
1.本發明具有較強的可操作性。本發明采用普通鯉魚的紫外線遺傳滅活精子刺激翹嘴舶卵子，通過冷休克抑制卵子第二極體釋放促使染色體加倍的方法，成功獲得翹嘴舶雌核發育個體。雌核發育二倍體仔魚的孵化率和成活率較高。
[0015]本發明獲得雌核發育魚苗易于鑒別。正常存活個體即為雌核發育魚，不需要再進行后續的染色體、遺傳標記等鑒定分析，顯著簡化了鑒定程序。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1是采用本發明獲得的翹嘴舶雌核發育魚的初孵仔魚實體圖；
圖2是采用本發明獲得的翹嘴舶雌核發育魚的I冬齡魚種實體圖；
圖3是采用本發明獲得的翹嘴舶雌核發育魚的染色體圖
圖4是引物HLJHB01在雌核發育群體中的擴增圖譜；
圖5是引物S129在3個群體中的擴增圖譜；
圖6是鯉魚精子與翹嘴舶卵子雜交獲得的畸形胚胎圖；
圖7是紫外線遺傳滅活后的鯉魚精子與翹嘴舶卵子授精獲得的單倍體胚胎圖。
【具體實施方式】
[0017]本發明的翹嘴舶雌核發育誘導方法具體如下:
涉及親本強化培育、人工催產、精子遺傳物質失活、受精卵染色體加倍等關節環節，具體技術過程及參數如下:
1.強化培育。獲得性腺發育良好的翹嘴舶和鯉魚親本是該項技術發明能否成功的首要條件。12月至翌年I月，從湖泊或池塘中選留3齡以上，無病無傷，體重1.0kg以上的翹嘴舶良種進行專池培育，雌雄比2:1。培育期間，初期投喂優質膨化配合飼料，后期增投一些鮮活餌料，比如鮮活小雜魚以及小規格的鯽、鳊魚苗等，以保證親魚的營養需求。雄鯉魚親本要求2-3齡，體重0.5 kg以上，體質健壯且鱗、鰭完整無病無傷，多套養于團頭魴等魚類的親本培育池內。
[0018]人工催產。繁殖季節，水溫達到25°C以上時，挑選性成熟雌雄翹嘴舶親本，要求雌魚卵巢輪廓明顯、體側鱗片排列疏松、觸摸腹壁有豐滿和松軟的感覺。注射方法一般采用胸腔一次注射，雌魚注射量為(LRH-A2 50 u g+HCG 1200IU)/kg，雄魚注射量減半。注射藥物的親魚放入催產池中，流水刺激，雌雄比1: 2。對于鯉魚而言，若輕壓腹部有乳白色稠狀精液流出，并能很快在水中散開，可不用注射催產藥物，直接采集精液。若挑選的鯉魚精液量少，可參考翹嘴舶激素劑量腹腔注射I次，并進行流水刺激。[0019]紫外線處理。根據紫外線使DNA失活的原理和適宜照射劑量不影響精子入卵能力的特點，參考已有文獻，自制紫外線處理裝置I套，主要包括兩支15W的紫外燈和搖床一臺，通過精子稀釋度、精子活力等情況的實時觀察，具體確定每次精子遺傳失活的照射時間。紫外線處理的具體方法為:1)精子的稀釋。人工擠取的鯉魚精液用Hank’s氏液按體積比1:5稀釋，之后均勻涂在4°C預冷的培養皿中，精液厚度控制在Imm以內，并保存于盛有碎冰塊的容器上。2)精子遺傳物質的失活。保持培養皿精液面與燈管的距離為13-14cm，照射時間控制在30-50min。照射過程中用搖床不停地緩慢搖動培養皿，以使精子被均勻照射，且每隔一段時間手工搖動幾次。當快達到適宜的照射劑量時，每隔2-4min在顯微鏡下觀察精子活力以決定照射的時間長度。當60-70%的鯉魚精子仍具有活力時，停止照射，完成紫外線滅活處理。處理過的精液保存于4°C的遮光容器中備用。
[0020]染色體加倍。影響卵子染色體加倍的主要因素有處理溫度、起始時間和處理持續時間。因野外條件下，對水溫梯度的控制比較難，但在一定環境條件下，冰水混合物能維持較長一段時間的溫度穩定，故選擇處理溫度范圍控制在2-4°C。
[0021](I)處理起始時間。翹嘴舶親魚發情時，親魚水面形成波紋，雌、雄魚有時翻騰水面，急速追逐，這時分別起網捕魚，采集翹嘴舶成熟卵子，用事先準備好的遺傳滅活的鯉魚精子進行干法授精，并分別于授精后1、2、3、4、5和6min處理受精卵，水溫2_4°C左右，持續處理時間14min，通過胚胎孵化率、成活率及畸形率的比較，結果表明，受精卵于授精后
1-6min進行冷休克處理14分鐘，均可獲得雌核發育魚苗，但以冷休克處理4min最為適宜，孵化率和成活率分別達15.7%和10.7%。
[0022](2)處理持續時間。授精后4min分別處理10、15、20、25、30和35min，水溫控制
2-4°C左右，通過胚胎孵化率、成活率及畸形率的比較，結果表明，冷休克持續處理10-35min均有效，但以冷休克處理15min為最佳，孵化率和成活率分別達15.4%和13.7%。
[0023](3)經過多次試驗，受精卵在授精后l-6min進行冷休克(2_4°C )處理10_35min都均可以獲得雌核發育魚。但研究認為翹嘴舶受精卵最適宜的冷休克染色體加倍條件為授精后4min進行冷休克(2-4°C)處理15min。
[0024]苗種培育。上述處理后的受精卵在孵化缸內常溫(25_28°C )下流水孵化，以魚卵不沉積為度，直至魚苗孵出。孵化獲得的體型正常、能主動攝食的魚苗即為誘導的翹嘴舶雌核發育魚，如圖1和圖2所示，圖2中的翹嘴舶雌核發育魚為I冬齡魚種，如圖所示，其發育良好，體積大小可參考上方5毛錢的大小。當魚苗“腰點”出現時，移至池塘中進行夏花培育。
[0025]雌核發育魚鑒定。將體型正常、能主動攝食的魚苗進行染色體分析(植物血球凝集素體內注射制備魚類腎細胞染色體法)，其染色體數為48對，如圖3所示，與母本染色體數一致，證明其為二倍體；然后再用微衛星標記和RAPD標記進行檢測，未發現來自父本鯉魚的遺傳物質，子代遺傳物質均來自母本，且遺傳同質性顯著提高，證明得到的后代為雌核發育魚。如圖4和5所示。圖4為微衛星引物(F: AATATAGGCAGAGATGACTTCAGAC, R:TTGAAAAGTGGGGACATGG)在翹嘴舶雌核發育一代(meio_Gl )、雌核發育二代(meio_G2)及翹嘴舶太湖野生群體(control )之間的擴增結果；圖5中的A表示引物S129 (CCAAGCTTCC)在標號為meio-Gl雌核發育群體中的擴增圖譜；B表示引物S129在標號為meio_G2雌核發育群體中的擴增圖譜；C表示引物S129在翹嘴舶太湖野生群體中的擴增圖譜，圖中F為父本；M 為 D15000+2000 DNA marker ?
[0026]對比分析。正常鯉魚精子與正常翹嘴舶卵子雜交，獲得胚胎均為畸形，如圖6所示，孵化后1-2天全部死亡。紫外線處理過的鯉魚精子與翹嘴舶卵子進行授精，獲得的胚胎表現出明顯的單倍體綜合癥，如圖7所示。而采用本發明的方法，將紫外線遺傳滅活處理后的鯉魚精子和翹嘴舶卵子進行授精，并進行過冷休克加倍處理，孵化出膜的子代存活且形態與親本一致，如圖1和圖2所示。本發明獲得正常存活個體經過上述的鑒定可以確定為雌核發育魚，因此，在實際飼養中，只要正常存活個體就可以確認為雌核發育魚，不再需要進行后續的染色體、遺傳標記等鑒定分析(即上述的鑒定)，顯著簡化了鑒定程序，減少了飼養成本。
[0027]以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所做的進一步詳細說明，便于該【技術領域】的技術人員能理解和應用本發明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下還可以做出若干簡單推演或替換，而不必經過創造性的勞動。因此，本領域技術人員根據本發明的揭示，對本發明做出的簡單改進都應該在本發`明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種翹嘴舶雌核發育誘導方法，包括如下步驟:(1)采集鯉魚精液；(2)對鯉魚精液進行紫外線遺傳滅活處理；(3)采集翹嘴舶成熟卵子，用經過紫外線遺傳滅活處理后的鯉魚精液進行干法授精；(4)受精卵進行冷休克處理后放入孵化容器中進行孵化，正常成活的魚苗為雌核發育魚。
2.如權利要求1所述的翹嘴舶雌核發育誘導方法，其特征在于，受精卵于授精后 l-6min內進行10_35min的冷休克處理。
3.如權利要求1所述的翹嘴舶雌核發育誘導方法，其特征在于，受精卵在2-4°C的溫度下進行冷休克處理。
4.如權利要求2所述的翹嘴舶雌核發育誘導方法，其特征在于，所述受精卵授精后4分鐘進行冷休克處理。
5.如權利要求2所述的翹嘴舶雌核發育誘導方法，其特征在于，所述受精卵進行冷休克處理的最佳時間為15分鐘。
6.如權利要求1所述的翹嘴舶雌核發育誘導方法，其特征在于，鯉魚精子在進行紫外線遺傳滅活處理時，處理到60-70%的鯉魚精子仍具有活力后停止紫外線處理，將處理后的鯉魚精子保存用于第(3 )步的授精。
7.如權利要求6所述的翹嘴舶雌核發育誘導方法，其特征在于，鯉魚精子的紫外線遺傳滅活處理方法為:A、用Hank’s氏液按體積比1:5稀釋鯉魚精子，將稀釋后的鯉魚精子均勻涂在4°C預冷的培養皿中；B、用紫外線燈對培養皿上的精液進行照射，照射過程中緩慢搖動培養皿使照射均勻；C、每隔2-4min觀察精子活力，當60-70%的鯉魚精子具有活力時停止照射。
8.如權利要求6所述的翹嘴舶雌核發育誘導方法，其特征在于，紫外線遺傳滅活處理后的精液保存于4°C的遮光容器中。
9.如權利要求1所述的翹嘴舶雌核發育誘導方法，其特征在于，用于采集鯉魚精液的雄鯉魚親本為2-3齡,體重0.5 kg以上的健康雄鯉魚。
10.如權利要求1所述的翹嘴舶雌核發育誘導方法，其特征在于，用于采集翹嘴舶卵子的翹嘴舶雌魚親本按以下方式進行強化培育:a、將體重1.0kg以上的翹嘴舶進行專池培育，雌雄比2:1;b、培育初期投喂膨化配合飼料，后期增投鮮活餌料 ；C、繁殖季節時，挑選雌雄翹嘴舶親本，人工催產后放入催產池中，流水刺激，雌雄比1:2。
【文檔編號】A01K61/00GK103563805SQ201310546582
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月7日 優先權日:2013年11月7日
【發明者】顧志敏, 賈永義 申請人:浙江省淡水水產研究所