提高蟲草素含量的蛹蟲草培養方法
【專利摘要】本發明屬于生物工程【技術領域】，具體涉及一種提高蟲草素含量的蛹蟲草培養方法。所述培養方法包括菌絲體培養和子實體培養，所述菌絲體培養包括以下步驟：在固體培養基中進行菌種的活化、在液體培養基中液體菌種的培養、發酵罐培養基中進行發酵罐培養，所述固體培養基、所述液體培養基和所述發酵罐培養基均含有醋酸鋅。本發明通過在固體培養基、液體培養基中加入醋酸鋅，由于較高濃度的鋅離子對于蟲草素的產生具有誘導作用和促進作用，提高了蛹蟲草中蟲草素含量。
【專利說明】提高蟲草素含量的蛹蟲草培養方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】，具體涉及一種提高蟲草素含量的蛹蟲草培養方法。
【背景技術】
[0002]蛹蟲草，又名北冬蟲夏草，屬于子囊亞門、核菌綱、球殼菌目、麥角菌科、蟲草屬，是我國名貴中藥材之一。蟲草素是一些蟲草真菌的特征性成分，也是蟲草真菌中最重要的活性成分之一。
[0003]蟲草素有免疫調節、抗腫瘤、抗疲勞、調節心肺等功能。蟲草素作為一種新型的廣譜抗菌素，以其特有的抗菌抗病毒活性，它能抑制病毒的RNA合成；對枯草桿菌和鳥結核桿菌均有抑制作用；對HIV-1型病毒也有殺傷作用；尤其對多種實體惡性腫瘤有很強的抑制作用，能增強免疫功能、防治心腦血管疾病等等。蟲草素顯示極好的藥學應用前景，目前蟲草素的研究正成為藥物化學中的一個極其活躍的領域。
[0004]蟲草素在冬蟲夏草中的含量極微，提高蟲草屬真菌的蟲草素含量的方法有兩類，一類是通過菌株的誘變育種等方式，提高原有菌種的蟲草素產量水平；另一種方法是通過培養條件優化和培養過程中添加誘導物的方式提高蟲草素的含量。
【發明內容】
[0005]為了提高蛹蟲草中蟲草素的含量，本發明提供一種提高蟲草素含量的蛹蟲草子實體培養方法。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明的技術方案是:一種提高蟲草素含量的蛹蟲草培養方法，包括菌絲體培養和子實體培養，所述菌絲體培養包括以下步驟:在固體培養基中進行菌種的活化、在液體培養基中進行液體菌種的培養和在發酵罐培養基中進行發酵罐培養，所述固體培養基、所述液體培養基和所述發酵罐培養基均含有重量百分比2%~9%的醋酸鋅。
[0007]蟲草菌絲體對鋅離子有極強的富集能力，在鋅離子脅迫下，菌絲體內蟲草素含量會增加；子實體蟲草素含量可達1.5~2.lmg/g，是未加高濃度鋅離子脅迫的所獲得的子實體的蟲草素含量的2~3倍。
[0008]此外，本發明采用醋酸鋅，醋酸鋅水溶液的pH值適于菌種的培養，醋酸根離子生物相容性好，易吸收降解，不會刺激人體腸胃，不會對人體產生副作用。
[0009]作為優選，所述固體培養基包括以下重量配比的組分:葡萄糖15~25份、蛋白胨5~10份、瓊脂14~19份、磷酸二氫鉀0.02~0.04份、硫酸鎂0.02~0.03份、醋酸鋅0.03~0.06份、維生素B10.01~0.03份和土豆180~220份。
[0010]作為優選，所述液體培養基包括以下重量配比的組分:葡萄糖16~24份、蛋白胨6~8份、磷酸二氫鉀0.03~0.05份、硫酸鎂0.03~0.04份、醋酸鋅0.04~0.09份、維生素B10.01~0.03份和水930~950份。[0011]作為優選，所述發酵罐培養基包括以下重量配比的組分:蔗糖8~20份、蛋白胨1.6~4份、酵母提取物1.6~4份和醋酸鋅4~36份。
[0012]作為優選，所述發酵罐培養基包括以下重量配比的組分:玉米漿8~20份、蛋白胨1.6~4份、酵母提取物1.6~4份和醋酸鋅4~36份。
[0013]作為優選，所述發酵罐培養基包括以下重量配比的組分:土豆8~20份、蛋白胨1.6~4份、酵母提取物1.6~4份和醋酸鋅4~36份。
[0014]作為優選，所述子實體培養包括以下步驟:子實體培養基的制備、子實體培養基滅菌、接種、遮光密閉培養和采收；所述子實體培養基包括富硒大米、稻米谷蛋白的酶水解溶液和醋酸鋅。
[0015]子實體培養基中含有富硒大米，能夠提高培養出的蛹蟲草的蟲草素含量，而且富硒能力強，硒利用率更高，大幅度提高子實體硒含量，子實體硒含量可達42~57 ii g/g，是子實體培養基中采用普通大米所獲得的子實體中硒含量的10倍左右。蛹蟲草子實體產量更高，色澤鮮艷，提高了蛹蟲草的營養和藥用價值。此外，子實體培養基中還含有醋酸鋅，使培養出的子實體達到含鋅量達1150~1260mg/g，是子實體培養基中不采用醋酸鋅所獲得的子實體中鋅含量的10000~12000倍，可以起到補鋅的作用。
[0016]作為優選，所述子實體培養基滅菌是指子實體培養基在高壓蒸汽中控溫120~125°C處理I小時，停止加熱后保溫I小時。
[0017]本發明通過在固體培養基、液體培養基和發酵罐培養基加入醋酸鋅，在高濃度鋅離子脅迫下，提高蟲草素含量，既滿足了工業生產的要求，也符合現代消費者對食品營養和保健的要求。生產工序簡單，見效快，生產成本低；制備的蟲草營養價值高。
【具體實施方式】
[0018]實施例一:
[0019]—種提高蟲草素含量的蛹蟲草培養方法，包括菌絲體培養和子實體培養，所述菌絲體培養包括以下步驟:
[0020](I)在固體培養基中進行菌種的活化:
[0021]所述固體培養基包括葡萄糖18g、蛋白胨Sg、瓊脂15g、磷酸二氫鉀0.03g、硫酸鎂
0.03g、維生素B10.03g、土豆200g和醋酸鋅5g。
[0022]將所述固體培養基分裝于試管中；將蛹蟲草菌種在無菌條件下接入試管斜面，15~30°C遮光密閉培養5~10天。
[0023] (2)在液體培養基中液體菌種的培養:
[0024]所述液體培養基包括葡萄糖20g、蛋白胨10g、瓊脂18g、磷酸二氫鉀0.04g、硫酸鎂
0.03g、維生素B10.02g和土豆190g,醋酸鋅8g和水950g。
[0025]將配置好的液體培養基按每瓶200ML裝入罐頭瓶內，用聚丙烯薄膜和橡皮筋封口，放入高壓鍋中滅菌，按照常規的高壓滅菌程序，0.12Mpa時，保持50分鐘。待培養液溫度冷卻到23°C以下后，在無菌環境中每瓶接入活化后斜面菌種。將接好菌種的罐頭瓶放在培養室進行遮光密閉培養，先避光，靜止兩至三天。避光，上搖床，防止菌絲結塊，順便檢查菌絲生長狀況，發現可疑的菌種及時剔除。培養室溫度控制在18°C~23°C，五天后即可得到能用于生產的蛹蟲草液體菌種。[0026](3)在發酵罐培養基中培養:
[0027]當菌絲體收率0.4~0.8%時，轉入發酵罐培養，所述發酵罐培養基包括蔗糖lOOOg，蛋白胨200g，酵母提取物200g，醋酸鋅1000g。發酵罐封蓋，裝在架子上，進入蒸房，進行高溫滅菌，1200C保持一小時，溫度至70°C時，打開蒸房門，拿出進行冷卻，20°C至23 V接種，臭氧機滅菌。接種在無菌操作臺上進行，打開發酵罐封蓋后，用接種槍均勻噴灑菌種，每個發酵罐5ML，蒸后封好。在16°C至18°C恒溫下進行避光培養，培養至菌絲體收得率1.2-1.8%，放罐收獲。
[0028]所述子實體培養包括以下步驟:
[0029](I)子實體培養基制備:子實體培養基的配方如下:富硒大米20份，醋酸鋅加入稻米谷蛋白的酶水解溶液35份，醋酸鋅加入稻米谷蛋白的酶水解溶液形成的溶液，其醋酸鋅的濃度是20mg/L，其含谷類蛋白肽10g/L。
[0030](2)滅菌:子實體培養基在高壓蒸汽中控溫120~125°C滅菌I小時，停止加熱后保溫I小時。裝在架子上，進入蒸房，進行高溫滅菌，120°C保持一小時，溫度至70°C時，打開蒸房門，拿出進行冷卻，20°C至23°C接種，臭氧機滅菌。
[0031](3)接種:
[0032]所述子實體培養基冷卻后，接入上述發酵罐培養基培養出的液體菌種，液體菌種的重量是子實體培養基內所含富硒大米重量的6% ;培養溫度控制在15°C~20°C，空氣濕度60% ~65%。
[0033](4)遮光密閉 培養:
[0034]完全黑暗條件培養7~8天；
[0035]轉色期管理:培養溫度在18°C~22°C，每天光照11小時以上，光照強度保持在150~160Lx，同時進行連續變溫刺激，晝夜溫差控制在14~18°C，培養3~4天；
[0036]子實體生長階段管理:料面上出現菌蕾后，溫度適當降低。控制在20~22°C，空氣濕度83%~87%，光照強度保持在130~170Lx，增加新鮮空氣，促進子實體形成，培養30~40天。
[0037](5)采收:當子實體高度達到6~9cm子實體頂端膨大即可采收烘干。
[0038]子實體中蟲草素含量達到1.8mg/g,硒含量達到35 ii g/g,鋅含量達到1260mg/g。
[0039]實施例二:
[0040]—種提高蟲草素含量的蛹蟲草培養方法，包括菌絲體培養和子實體培養，所述菌絲體培養包括以下步驟:
[0041](I)在固體培養基中進行菌種的活化:
[0042]所述固體培養基包括葡萄糖25g、蛋白胨10g、瓊脂19g、磷酸二氫鉀0.04g、硫酸鎂
0.03g、維生素B10.01~0.03g、土豆180~220g和醋酸鋅4.3~17g。分裝于試管中；將蛹蟲草菌種在無菌條件下接入試管斜面，15~30°C遮光密閉培養5~10天。
[0043](2)在液體培養基中液體菌種的培養:
[0044]所述液體培養基包括葡萄糖25g、蛋白胨10g、磷酸二氫鉀0.04g、硫酸鎂0.03g、醋酸鋅0.06g、維生素B10.03g、土豆220g、醋酸酸鋅17g和水950g。將配置好的培養液按每瓶200ML裝入罐頭瓶內，用聚丙烯薄膜和橡皮筋封口，放入高壓鍋中滅菌，按照常規的高壓滅菌程序，0.12Mpa時，保持50分鐘。待培養液溫度冷卻到23°C以下后，在無菌環境中每瓶接入活化后斜面菌種。將接好菌種的罐頭瓶放在培養室進行遮光密閉培養，先避光，靜止兩至三天。避光，上搖床，防止菌絲結塊，順便檢查菌絲生長狀況，發現可疑的菌種及時剔除。培養室溫度控制在18°C~23°C，五天后即可得到能用于生產的蛹蟲草液體菌種。 [0045] (3)在發酵罐培養基中培養:
[0046]當菌絲體收率0.4~0.8%時,轉入發酵罐培養,所述發酵罐培養包括土豆2000g、蛋白胨400g、酵母提取物400g和醋酸鋅3600g。發酵罐封蓋，裝在架子上，進入蒸房，進行高溫滅菌，1200C保持一小時，溫度至70°C時，打開蒸房門，拿出進行冷卻，20°C至23°C接種，臭氧機滅菌。接種在無菌操作臺上進行，打開發酵罐封蓋后，用接種槍均勻噴灑菌種，每個發酵罐5ML，蒸后封好。在16°C至18°C恒溫下進行避光培養，培養至菌絲體收得率
1.2-1.8%，放罐收獲。菌絲體中蟲草素含量達到2.6mg/g，而未添加醋酸鋅的條件下菌絲體中蟲草素含量僅有0.62mg/g，添加醋酸鋅之后增加1.98mg/g。
[0047]所述子實體培養包括以下步驟:
[0048](I)子實體培養基制備:子實體培養基的配方如下:富硒大米20份，醋酸鋅加入稻米谷蛋白的酶水解溶液35份，醋酸鋅加入稻米谷蛋白的酶水解溶液形成的溶液，其醋酸鋅的濃度是20mg/L，其含谷類蛋白肽10g/L。
[0049](2)滅菌:子實體培養基在高壓蒸汽中控溫120~125°C滅菌I小時，停止加熱后保溫I小時。裝在架子上，進入蒸房，進行高溫滅菌，120°C保持一小時，溫度至70°C時，打開蒸房門，拿出進行冷卻，20°C至23°C接種，臭氧機滅菌。
[0050](3)接種:
[0051]所述子實體培養基冷卻后，接入上述發酵罐培養基培養出的液體菌種，液體菌種的重量是子實體培養基內所含富硒大米重量的6% ;培養溫度控制在15°C~20°C，空氣濕度60% ~65%。
[0052](4)遮光密閉培養:
[0053]完全黑暗條件培養7~8天；
[0054]轉色期管理:培養溫度在18°C~22°C，每天光照11小時以上，光照強度保持在150~160Lx，同時進行連續變溫刺激，晝夜溫差控制在14~18°C，培養3~4天；
[0055]子實體生長階段管理:料面上出現菌蕾后，溫度適當降低。控制在20~22°C，空氣濕度83%~87%，光照強度保持在130~170Lx，增加新鮮空氣，促進子實體形成，培養30~40天。
[0056](5)采收:當子實體高度達到6~9cm子實體頂端膨大即可采收烘干。
[0057]子實體中蟲草素含量達到2.lmg/g,硒含量達到57 U g/g,鋅含量達到1150mg/g。
[0058]實施例三:
[0059]—種提高蟲草素含量的蛹蟲草培養方法，包括菌絲體培養和子實體培養，所述菌絲體培養包括以下步驟:
[0060](I)在固體培養基中進行菌種的活化:
[0061]所述固體培養基包括葡萄糖25g、蛋白胨10g、瓊脂19g、磷酸二氫鉀0.04g、硫酸鎂
0.03g、維生素B10.01~0.03g、土豆180~220g和醋酸鋅4.3~17g。分裝于試管中；將蛹蟲草菌種在無菌條件下接入試管斜面，15~30°C遮光密閉培養5~10天。
[0062](2)在液體培養基中液體菌種的培養:[0063]所述液體培養基包括葡萄糖25g、蛋白胨10g、磷酸二氫鉀0.04g、硫酸鎂0.03g、維生素B10.03g、土豆220g、醋酸酸鋅17g和水950g。將配置好的培養液按每瓶200ML裝入罐頭瓶內，用聚丙烯薄膜和橡皮筋封口，放入高壓鍋中滅菌，按照常規的高壓滅菌程序，0.12Mpa時，保持50分鐘。待培養液溫度冷卻到23°C以下后，在無菌環境中每瓶接入活化后斜面菌種。將接好菌種的罐頭瓶放在培養室進行遮光密閉培養，先避光，靜止兩至三天。避光，上搖床，防止菌絲結塊，順便檢查菌絲生長狀況，發現可疑的菌種及時剔除。培養室溫度控制在18°C~23°C，五天后即可得到能用于生產的蛹蟲草液體菌種。[0064](3)在發酵罐培養基中培養:
[0065]當菌絲體收率0.4~0.8%時，轉入發酵罐培養，所述發酵罐培養包括玉米漿2000g、蛋白胨400g、酵母提取物400g和醋酸鋅3600g。發酵罐封蓋，裝在架子上，進入蒸房，進行高溫滅菌，120°C保持一小時，溫度至70°C時，打開蒸房門，拿出進行冷卻，20°C至23°C接種，臭氧機滅菌。接種在無菌操作臺上進行，打開發酵罐封蓋后，用接種槍均勻噴灑菌種，每個發酵罐5ML，蒸后封好。在16°C至18°C恒溫下進行避光培養，培養至菌絲體收得率1.2-1.8%，放罐收獲。菌絲體中蟲草素含量達到3.2mg/g，而未添加醋酸鋅的條件下菌絲體中蟲草素含量僅有0.52mg/g，添加醋酸鋅之后增加2.68mg/g。
[0066]所述子實體培養包括以下步驟:
[0067](I)子實體培養基制備:子實體培養基的配方如下:富硒大米20份，醋酸鋅加入稻米谷蛋白的酶水解溶液35份，醋酸鋅加入稻米谷蛋白的酶水解溶液形成的溶液，其醋酸鋅的濃度是20mg/L，其含谷類蛋白肽10g/L。
[0068](2)滅菌:子實體培養基在高壓蒸汽中控溫120~125°C滅菌I小時，停止加熱后保溫I小時。裝在架子上，進入蒸房，進行高溫滅菌，120°C保持一小時，溫度至70°C時，打開蒸房門，拿出進行冷卻，20°C至23°C接種，臭氧機滅菌。
[0069](3)接種:
[0070]所述子實體培養基冷卻后，接入上述發酵罐培養基培養出的液體菌種，液體菌種的重量是子實體培養基內所含富硒大米重量的6% ;培養溫度控制在15°C~20°C，空氣濕度60% ~65%。
[0071](4)遮光密閉培養:
[0072]完全黑暗條件培養7~8天；
[0073]轉色期管理:培養溫度在18°C~22°C，每天光照11小時以上，光照強度保持在150~160Lx，同時進行連續變溫刺激，晝夜溫差控制在14~18°C，培養3~4天；
[0074]子實體生長階段管理:料面上出現菌蕾后，溫度適當降低。控制在20~22°C，空氣濕度83%~87%，光照強度保持在130~170Lx，增加新鮮空氣，促進子實體形成，培養30~40天。
[0075](5)采收:當子實體高度達到6~9cm子實體頂端膨大即可采收烘干。子實體中蟲草素含量達到1.5mg/g,硒含量達到42 ii g/g,鋅含量達到1200mg/g。
[0076]對比例:
[0077]與實施例1的區別在于，所述固體培養基、液體培養基、發酵罐培養基和子實體培養基中不包括醋酸鋅，子實體培養基中的富硒大米為普通大米。
[0078]表1:在所述固體培養基、液體培養基、發酵罐培養基和子實體培養基加入醋酸鋅，子實體培養基中采用富硒大米對所培養的子實體中蟲草素含量、硒含量和鋅含量的影響。
[0079]
【權利要求】
1.一種提高蟲草素含量的蛹蟲草培養方法，包括菌絲體培養和子實體培養，所述菌絲體培養包括以下步驟:在固體培養基中進行菌種的活化、在液體培養基中進行液體菌種的培養和在發酵罐培養基中進行發酵罐培養，其特征在于，所述固體培養基、所述液體培養基和所述發酵罐培養基分別含有重量百分比2%~9%的醋酸鋅。
2.根據權利要求1所述的提高蟲草素含量的蛹蟲草培養方法，其特征在于，所述固體培養基包括以下重量配比的組分:葡萄糖15~25份、蛋白胨5~10份、瓊脂14~19份、磷酸二氫鉀0.02~0.04份、硫酸鎂0.02~0.03份、醋酸鋅0.03~0.06份、維生素B10.01~0.03份和土豆180~220份。
3.根據權利要求1所述的提高蟲草素含量的蛹蟲草培養方法，其特征在于，所述液體培養基包括以下重量配比的組分:葡萄糖16~24份、蛋白胨6~8份、磷酸二氫鉀0.03~0.05份、硫酸鎂0.03~0.04份、醋酸鋅0.04~0.09份、維生素B10.01~0.03份和水930 ~950 份。
4.根據權利要求1所述的提高蟲草素含量的蛹蟲草培養方法，其特征在于，所述發酵罐培養基包括以下重量配比的組分:蔗糖8~20份、蛋白胨1.6~4份、酵母提取物1.6~4份和醋酸鋅4~36份。
5.根據權利要求1所述的提高蟲草素含量的蛹蟲草培養方法，其特征在于，所述發酵罐培養基包括以下重量配比的組分:玉米漿8~20份、蛋白胨1.6~4份、酵母提取物1.60~4份和醋酸鋅4~36份。
6.根據權利要求1所述的提高蟲草素含量的蛹蟲草培養方法，其特征在于，所述發酵罐培養基包括以下重量配比的組分:土豆8~20份、蛋白胨1.6~4份、酵母提取物1.6~4份和醋酸鋅4~36份。
7.根據權利要求1所述的提高蟲草素含量的蛹蟲草培養方法，其特征在于，所述子實體培養包括以下步驟:子實體培養基的制備、子實體培養基滅菌、接種、遮光密閉培養和采收；所述子實體培養基包括富硒大米、稻米谷蛋白的酶水解溶液和醋酸鋅。
8.根據權利要求7所述的提高蟲草素含量的蛹蟲草培養方法，其特征在于，所述子實體培養基滅菌是指子實體培養基在高壓蒸汽中控溫120~125°C處理I小時，停止加熱后保溫I小時。
【文檔編號】A01G1/04GK103609329SQ201310541025
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月5日 優先權日:2013年11月5日
【發明者】陶志康, 丁志紅 申請人:昆山市康樂蟲草專業合作社, 陶志康