一種高效獲取蛹蟲草有效接種體的菌種分離方法
【專利摘要】本發明涉及一種高效獲取蛹蟲草有效接種體的菌種分離方法，其特征在于，采用熱激法處理子實體。與傳統分離平板相比，本發明分離平板氣生菌絲減少，菌絲致密，生長快。暗培養結束后，光照培養轉色快，顏色深。菌絲易發生扭結，在平板上易形成原基。栽培試驗表明，與傳統分離菌種相比，本發明分離菌種在栽培瓶中子實體原基出現早，子實體形態與親本一致，生長整齊，變異程度低。本發明操作簡單易行，分離效果好，平板菌落有效接種物部分易識別。分離菌種穩定性強，變異少。傳代次數比傳統方法增加。
【專利說明】一種高效獲取蛹蟲草有效接種體的菌種分離方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及蛹蟲草栽培【技術領域】，具體涉及一種蛹蟲草菌種及遺傳特性保持的方法。
【背景技術】
[0002]蛹蟲草(Cordyceps militaris (L.Fr) Link),又名蠶蟲草、北冬蟲夏草，屬子囊菌門(Ascomycota)、核菌綱(Pyrenomycetes)、球殼目(Sphaeriales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps (Fr.) Link)真菌。蛹蟲草是蟲草屬真菌的模式種，在自然界多寄生多種鱗翅日昆蟲的幼蟲和蛹上。
[0003]近年來，研究表明，人工栽培的蛹蟲草化學成分及藥理作用與冬蟲夏草相似，但價格卻遠遠低于冬蟲夏草，因此，蛹蟲草的開發應用具有極大的潛在市場。
[0004]人工培養蛹蟲草是解決野生蟲草來源不足的良好途徑，相關的研究很多，然而人工培養過程中菌種退化現象嚴重是制約產業化開發的一大瓶頸。影響人工培養蛹蟲草菌種退化的因素很多，簡單的可以分成兩的大類，一類是菌株的遺傳特性造成菌種的退化(內因)。一類是培養條件、操作環節、環境因素導致的菌種退化(外因)。
[0005]在實際的蛹蟲草規模化生產的菌種分離和篩選過程中，最常采用的是組織分離法。組織分離法就是指通過子實體組織分離獲得純菌絲的方法。食用菌的子實體實際上就是菌絲體的紐結物，它具有很強的再生能力。因此，只要切取一小塊子實體組織，把它移植到培養基上，就能獲取純粹的菌絲體。
[0006]組織分離培養，從生物學的角度來看，乃是一種無性繁殖，是從組織一菌絲一組織一菌絲周而復始的循環過程，`遺傳變異小，但在無性繁殖過程中可能產生自然變異和突變，但組織分離產生的變異不很大，是一種累積、漸進的過程，變異是絕對的，穩定是相對的。組織分離法還會因取樣時子實體發育的不同時期和部位，以及個人的經驗和技巧而產生不同的結果。
[0007]組織分離法取樣位置不同遺傳特性產生區別的一個典型事例是:香菇同一菌種子實體菇肉、菇柄組織分離物與菌絲體間既保持了遺傳物質相對穩定性和遺傳性狀的穩定性(DNA相似性在88%以上)，存在著相對的遺傳變異，雖然變異極為細微，但是預示著一種潛在必然趨勢，反映了累積、漸進的漫長過程，這是由于內、外因造成的，但主要是由于遺傳型的變異造成的，育種工作者不應忽略這種變異的存在，因為這很可能是造成某些菌種退化和變異的原因所在(香菇子實體組織分離物與菌絲體的遺傳相關性，上海農業學報，1997，13(4):85 ~88)。
[0008]1999年上海農科院“北冬蟲夏草子實體人工高產栽培技術及其工廠化生產研究”，首次向國內外真菌學界提供了“Cordyceps militaris”菌株有性結構的細胞學證據。證明了子實體外層內的雙核細胞為有效接種體，子實體的薄壁細胞為無效接種體。
[0009]常規的蛹蟲草組織分離方法取得分離組織塊后，往往是子實體外層的表面的薄壁組織細胞和疏松組織細胞先增殖，隨后是子實體外層內的雙核細胞增殖。因此造成了常規組織分離法獲得的蛹蟲草平板菌落可育菌絲部分和不可育菌絲很難區分，界限不明顯，最終表現為蛹蟲草菌種的不穩定。
【發明內容】
[0010]本發明的目的就是利用熱激法使外層組織細胞蛋白變性，阻止不可育部分組織細胞的增殖，只讓能形成有效接種體部分的組織細胞增殖，從而使蛹蟲草平板菌落可育菌絲部分和不可育菌絲明顯可以區分，使蛹蟲草菌種穩定遺傳。
[0011]為實現上述目的，本發明具體地包括如下內容:
[0012]1、子實體親本的選擇:
[0013]選取正在栽培瓶中生長中后期的沒有受到污染的，子實體生長迅速、條形整齊，粗細均勻、顏色橘紅、子囊果尚未發育的栽培瓶經過瓶表面消毒后放入超凈工作臺。在無菌條件下，用鑷子夾取頭頂部2-3cm，放入干熱滅菌后的培養皿內，待處理。
[0014]2、子實體親本的處理:
[0015]方法一:用鑷子夾住用來組織分離的子實體，在65_85°C的無菌水(此無菌水事先在121°C，20min高溫高壓滅過菌)中停留0.5-2.0秒(溫度越高時間越短，表層細胞受損而保護內層細胞)，然后迅速轉入到冰箱冷藏室冷藏的4°C的無菌水(此無菌水事先在121°C，20min高溫高壓滅過菌)中停留2-5分鐘，然后取出放置于干熱滅菌的內置吸水濾紙的培養皿內，待用。
[0016]方法二:用鑷子夾住用來組織分離的子實體，在75%酒精中停留30-120秒，然后迅速轉入到無菌水中洗滌三遍，然后取出放置于干熱滅菌的內置吸水濾紙的培養皿內，待用。
[0017]方法三:將少量95%酒精倒入到培養皿中，點燃，用鑷子夾住用來組織分離的子實體在藍色火焰上來回過1-3次，然后迅速轉入到冰箱冷藏室冷藏的4°C的無菌水(此無菌水事先在121°C，20min高溫高壓滅過菌)中停留2_5分鐘，然后取出放置于干熱滅菌的內置吸水濾紙的培養皿內，待用。
[0018]3、組織培養:
[0019]將上述處理過的子實體切段為2_4mm，放置在PDA平板上培養即可。
[0020]本發明方法具有如下優點:
[0021]與傳統分離平板相比，本發明分離平板氣生菌絲減少，菌絲致密，生長快。暗培養結束后，光照培養轉色快，顏色深。菌絲易發生扭結，在平板上易形成原基。
[0022]栽培試驗表明，與傳統分離菌種相比，本發明分離菌種在栽培瓶中子實體原基出現早，子實體形態與親本一致，生長整齊，變異程度低。
[0023]本發明操作簡單易行，分離效果好，平板菌落有效接種物部分易識別。分離菌種穩定性強，變異少。傳代次數比傳統方法增加。
【具體實施方式】
[0024]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0025]實施例1
[0026]一、實驗時間:2012年4月:
[0027]二、實驗材料和設計:[0028]1、菌種:蛹蟲草菌株購自中國科學院微生物所，編號PRB.1235。菌種A采用傳統方法分離獲得；菌種B采用如下方法處理分離獲得:
[0029]用鑷子夾住用來組織分離的子實體，在80°C無菌水中停留1.5秒，然后迅速轉入到冰箱冷藏室冷藏的4°C的無菌水中停留2min處理。
[0030]2、液體搖瓶用培養基:去皮土豆300克(煮汁)、葡萄糖10克、蛋白胨2克、磷酸二氫鉀0.5克、硫酸鎂I克、水1000毫升，pH自然。
[0031]3、子實體生產營養液:黃豆2%、葡萄糖1%、奶粉5%、磷酸二氫鉀0.5%、硫酸鎂 0.05%、維生素BllOmg / 1000ml的比例配成營養液，調整pH在5.6~7.2。
[0032]4、采用PP料制成的培養盒(高10CM，上底直徑12cm，下底直徑8cm)。每盒大米40克和營養液56克分裝混合，滅菌接種。
[0033]5、暗培養管理
[0034]培養室適宜溫度為(18~25) °C，濕度為(70~85)%，應避光培養(7~8)天。菌絲布滿表面后開始通風培養。
[0035]6、子實體培養
[0036]在按種后待菌絲布滿整個瓶面并深扎到瓶底，開始見光，但避免太陽光直射。若培養室光線太暗，可補充日光燈照。菌絲見光后，在培養料表面或四周見有桔黃色色素形成，并出現米粒狀的桔黃色菌蕾，菌蕾伸長后即成為子實體。子實體培育階段，溫度應為(20~23) °C，超過25°C生長緩慢，濕度應提高到(80~85) %。超過27°C菌絲萎縮不能出菌束。在子實體培養后期，逐漸加大室內空氣的流通和交換，培養室培養階段若發現污染應立即清除。
[0037]7、采收:
[0038]采收后A菌種平均鮮重達到28.7克/瓶。采收后B菌種平均鮮重達到31.8克/瓶。
[0039]實施例2
[0040]基本操作同實施例1，不同在于菌種B采用如下方法處理分離獲得:
[0041]用鑷子夾住用來組織分離的子實體，在75%酒精中停留60秒，然后迅速轉入到無菌水中洗滌三遍。
[0042]采收后A菌種平均鮮重達到28.5克/瓶。采收后B菌種平均鮮重達到32.3克/瓶。
[0043]實施例3
[0044]基本操作同實施例1，不同在于菌種B采用如下方法處理分離獲得:
[0045]將少量95%酒精倒入到培養皿中，點燃，用鑷子夾住用來組織分離的子實體在藍色火焰上來回過1-3次，然后迅速轉入到冰箱冷藏室冷藏的4°C的無菌水中停留4分鐘。
[0046]采收后A菌種平均鮮重達到27.8克/瓶。采收后B菌種平均鮮重達到33.6克/瓶。
[0047]以上實施例表明:本發明操作簡單易行，分離效果好，平板菌落有效接種物部分易識別。不但分離菌種穩定性強，而且比傳統分離方法還達到了增產的效果。
[0048]雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施例對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做`的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【權利要求】
1.一種高效獲取蛹蟲草有效接種體的菌種分離方法，其特征在于，采用熱激法處理子實體。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于，處理子實體的具體步驟為:子實體在65-85°C的無菌水中停留0.5-2.0秒，然后迅速轉入到冰箱冷藏室冷藏的4°C的無菌水中停留2-5分鐘。
3.權利要求1所述的方法，其特征在于，處理子實體的具體步驟為:子實體在75%酒精中停留30-120秒，然后迅速轉入到無菌水中洗滌三遍。
4.權利要求1所述的方法，其特征在于，處理子實體的具體步驟為:將少量酒精點燃，子實體在藍色火焰上來回過1-3次，然后迅速轉入到冰箱冷藏室冷藏的4°C的無菌水中停留2-5分鐘。
【文檔編號】A01G1/04GK103548559SQ201310492121
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月18日 優先權日:2013年10月18日
【發明者】邢禮軍, 劉春閣, 張愛武, 喻少帆, 王衛紅, 劉新香, 閆明明, 楊海濤, 蘆麗紅 申請人:北京市農林科學院