奶山羊冷凍精液稀釋液及其制備方法和稀釋方法、以及奶山羊冷凍精液細管凍精的制備方法
【專利摘要】本發明涉及奶山羊冷凍精液稀釋液及其制備方法和稀釋方法、以及奶山羊冷凍精液細管凍精的制備方法。現有冷凍精液保存方法，精子受低溫打擊致使質膜結構改變，嚴重影響質膜的完整性及其復蘇后的活率及受精能力。本發明對新鮮精液進行兩步稀釋、平衡及兩步降溫細管冷凍處理，其中，基礎稀釋液由Tris、檸檬酸、葡萄糖、海藻糖、Vc、GSH、BSA、ATP、復合抗生素、卵黃加水配成，冷凍稀釋液由基礎稀釋液加甘油配成；利用稀釋液對鮮精進行稀釋和平衡后，分裝于細管，儲存于液氮中。本發明對奶山羊精液低溫保存和冷凍保存具有良好效果，有效提高解凍后活率、頂體完整率及質膜完整性，降低畸形率，提高奶山羊凍精生產效率及凍精品質。
【專利說明】奶山羊冷凍精液稀釋液及其制備方法和稀釋方法、以及奶山羊冷凍精液細管凍精的制備方法【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及奶山羊冷凍精液稀釋液及其制備方法和稀釋方法、以及奶山羊冷凍精液細管凍精的制備方法。
【背景技術】
[0002]奶山羊作為重要的奶畜資源，近些年來隨著我國國民生活水平提高及飲食結構調整而倍受重視。奶山羊養殖主要集中在陜西、山東、河南、河北、云南等省份，然而羊奶的需求目前已經遍及東部沿海及南方港、澳、臺等10多個省、市、自治區及直轄市，體現出一種供不應求的趨勢，因此如何加快奶山羊品種改良，提高奶山羊良種繁育速度及建立規模化養殖管理體系成為目前工作的重中之重。精液冷凍保存與人工受精技術在現代化畜牧業生產中發揮著舉足輕重的作用，應用冷凍精液進行人工授精可以不受時間、地域、品種及個體的限制，并且大量減少公畜的飼養數量，降低生產成本，提高優良種公畜的利用率，提高養殖業的經濟效益。同時該技術對品種引進、雜交改良，以及提高繁殖性能、疾病控制及保護遺傳多樣性保護方面也具有重要的意義。我國在奶牛及肉牛上應用冷凍精液技術及人工授精技術已發展的較為完善，充分提高了養殖的經濟效益，但在山羊精液冷凍保存及人工授精技術上盡管已經應用多年，但普遍冷凍精液解凍后，精子活率(0.3-0.5)難以提高受胎率(35%-50%)滿足規模化生產需要。其原因是精子受低溫打擊致使精子質膜結構發生改變，嚴重影響質膜的完整性及其復蘇后的精子的活率及受精能力。因此只有深入了解稀釋液中各成分的用途與作用機理，選擇適合羊精液的成分才能使其發揮有效作用。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供奶山羊冷凍精液稀釋液及其制備方法和稀釋方法、以及奶山羊冷凍精液細管凍精的制備方法，能夠有效改善精子在降溫過程中所受到的損傷，保持精子完整性，減少精子在冷凍過 程中所受到的傷害。
[0004]本發明所采用的技術方案是:
奶山羊冷凍精液基礎稀釋液的制備方法，其特征在于:
由以下步驟實現:
步驟一:按以下比例準備各組分:
三羥甲基-氨基甲烷 300-400 mM ；
100-130 mM ；
35-45 mM ；
260-300 mM ；
4-6 g/L ；
4-6 mM ；
8-12 g/L ；
檸檬酸葡萄糖海藻糖維生素C還原型谷胱甘肽牛血清白蛋白三磷酸腺苷0.7-1.5 mM ；步驟二:將上述組分與雙蒸水按比例混勻后，0.2 um濾膜過濾，加入復合抗生素；步驟三:按體積比15-25 %的比例，在步驟二得到的混合液中加入卵黃添加液，充分混勻，得到基礎稀釋液。
[0005]步驟二中，加入復合抗生素，即加入0.05~0.055 g/L的泰樂菌素、0.27~0.28 g/L的慶大霉素、0.16^0.18 g/L的林可霉素以及0.3^0.35 g/L的奇霉素。
[0006]步驟三中，卵黃添加液由以下步驟制得:
將新鮮無病原菌雞蛋經過雙氯苯雙胍己烷浸泡后抽取卵黃液，以質量體積比為0.035%加入十二烷基磺酸鈉，15 X IO3 g離心I h，吸取上清液經0.45 μ m濾膜過濾得到卵黃添加液。
[0007]所述的制備方法制得的奶山羊冷凍精液基礎稀釋液。
[0008]奶山羊冷凍精液冷凍稀釋液的制備方法，其特征在于:
由以下步驟實現:
步驟一:按以下比例準備各組分:
三羥甲基-氨基甲烷 300-400 mM ；
100-130 mM ；
35-45 mM ；
260-300 mM ；
4-6 g/L ；
4-6 mM ；
8-12 g/L ；
0.7-1.5 mM ；
步驟二:將上述組分與雙蒸水按比例混勻后，0.2 um濾膜過濾，加入復合抗生素；步驟三:按體積比15-25 %的比例，在步驟二得到的混合液中加入卵黃添加液，充分混勻，得到基礎稀釋液；
步驟四:基礎稀釋液配制好后，按甘油終體積濃度為12-16%的比例，加入甘油，得到冷凍稀釋液。
[0009]步驟二中，加入復合抗生素，即加入0.05~0.055 g/L的泰樂菌素、0.27~0.28 g/L的慶大霉素、0.16^0.18 g/L的林可霉素以及0.3^0.35 g/L的奇霉素。
[0010]步驟三中，卵黃添加液由以下步驟制得:
將新鮮無病原菌雞蛋經過雙氯苯雙胍己烷浸泡后抽取卵黃液，以質量體積比為0.035%加入十二烷基磺酸鈉，15 X IO3 g離心I h，吸取上清液經0.45 μ m濾膜過濾得到卵黃添加液。
[0011]所述的制備方法制得的奶山羊冷凍精液冷凍稀釋液。
[0012]奶山羊冷凍精液的稀釋方法，其特征在于:
由以下步驟實現:
步驟一:制備基礎稀釋液:
(I)按以下比例準備各組分:
三羥甲基-氨基甲烷 300-400 mM ；
檸檬酸葡萄糖海藻糖維生素C還原型谷胱甘肽牛血清白蛋白三磷酸腺苷檸檬酸葡萄糖海藻糖維生素C
100-130 mM ；35—45 mM ；
260-300 mM ；
還原型谷胱甘肽牛血清白蛋白三磷酸腺苷
4-6 mM ；
8-12 g/L ；
0.7-1.5 mM ；
(2)將上述組分與雙蒸水按比例混勻后，0.2 um濾膜過濾，加入復合抗生素，即加入0.05、.055 g/L的泰樂菌素、0.27、.28 g/L的慶大霉素、0.16^0.18 g/L的林可霉素以及0.3~0.35 g/L的奇霉素；
(3)按體積比15-25%的比例，在步驟二得到的混合液中加入卵黃添加液，充分混勻，得到基礎稀釋液；
卵黃添加液由以下步驟制得:
將新鮮無病原菌雞蛋經過雙氯苯雙胍己烷浸泡后抽取卵黃液，以質量體積比為0.035%加入十二烷基磺酸鈉，15 X IO3 g離心I h，吸取上清液經0.45 μ m濾膜過濾得到卵黃添加液；
步驟二:制備冷凍稀釋液:
基礎稀釋液配制好后，按甘油終體積濃度為12-16%的比例，加入甘油，得到冷凍稀釋
液；
步驟三:采用兩步法稀釋奶山羊精液并平衡:
(1)采集新鮮公羊精液，在37°C溫度下對精子的表觀活率、活率及密度進行質量評定:用帶有刻度的集精杯計算每次采精體積；在顯微鏡100倍視野下觀察鮮精的表觀活率，分為0-5級，O級為沒有波動，5級為快速漩渦狀波動；在400倍視野下評定鮮精活率，將鮮精稀釋1000倍后在血球計數板上計算精液密度；只有精液表觀活率為5級，活率大于0.8且密度大于2.0X IO9個/mL才能用于冷凍精液制作；
(2)等溫加入基礎稀釋液，使稀釋后精子密度為8XIO8 -1OXlO8個/mL，基礎稀釋液添加量為鮮精液的3-6倍，混勻后轉移至冰箱冷藏室或4°C低溫環境，1.5-2 h水浴冷卻到0-4°C完成第一步稀釋；
(3)在相同溫度下以體積比1:1加入冷凍稀釋液并混勻，此時混合精液密度為4X108-5 X IO8個/mL，甘油濃度為6-8 %，完成第二步稀釋，平衡時間2_6 h。
[0013]奶山羊冷凍 精液細管凍精的制備方法，其特征在于:
由以下兩步降溫法實現:
步驟一:制備基礎稀釋液:
(I)按以下比例準備各組分:
三羥甲基-氨基甲烷 300-400 mM ；
檸檬酸100-130 mM ；
葡萄糖35-45 mM ；
海藻糖260-300 mM ；
維生素C4-6 g/L ；還原型谷胱甘肽4-6 mM ；
牛血清白蛋白8-12 g/L;
三磷酸腺苷0.7-1.5 mM ；
(2)將上述組分與雙蒸水按比例混勻后，0.2 um濾膜過濾，加入復合抗生素，即加入0.05、.055 g/L的泰樂菌素、0.27、.28 g/L的慶大霉素、0.16^0.18 g/L的林可霉素以及0.3~0.35 g/L的奇霉素；
(3)按體積比15-25%的比例，在步驟二得到的混合液中加入卵黃添加液，充分混勻，得到基礎稀釋液；
卵黃添加液由以下步驟制得:
將新鮮無病原菌雞蛋經過雙氯苯雙胍己烷浸泡后抽取卵黃液，以質量體積比為0.035%加入十二烷基磺酸鈉，15 X IO3 g離心I h，吸取上清液經0.45 μ m濾膜過濾得到卵黃添加液；
步驟二:制備冷凍稀釋液:
基礎稀釋液配制好后，按甘油終體積濃度為12-16%的比例，加入甘油，得到冷凍稀釋
液；
步驟三:采用兩步法稀釋奶山羊精液并平衡:
(1)采集新鮮公羊精液，在37°C溫度下對精子的表觀活率、活率及密度進行質量評定:用帶有刻度的集精杯計算每次采精體積；在顯微鏡100倍視野下觀察鮮精的表觀活率，分為0-5級，O級為沒有波動，5級為快速漩渦狀波動；在400倍視野下評定鮮精活率，將鮮精稀釋1000倍后在血球計數板上計算精液密度；只有精液表觀活率為5級，活率大于0.8且密度大于2.0X IO9個/mL才能用于冷凍精液制作；
(2)等溫加入基礎稀釋液，使稀釋后精子密度為8XIO8 -1OXlO8個/mL，基礎稀釋液添加量為鮮精液的3-6倍，混勻后轉移至冰箱冷藏室或4°C低溫環境，1.5-2 h水浴冷卻到0-4°C完成第一步稀釋；
(3)在相同溫度下以體積比1:1加入冷凍稀釋液并混勻，此時混合精液密度為4XIO8-5 X IO8個/mL，甘油濃度為6-8 %，完成第二步稀釋，平衡時間2_6 h ；
步驟四:制備奶山羊冷凍精液細管凍精:
將稀釋平衡后的精液在0-4°C溫度下吸入0.25 mL細管中，用聚乙烯醇粉封口后，第一步降溫即迅速將細管置于距離液氮表面4-5 cm的冷凍架上，熏蒸4-5 min，第二步降溫即將細管投入到液氮中長期保存。
[0014]本發明具有以下優點:
本發明所涉及的奶山羊冷凍精液稀釋液及其制備方法和稀釋方法、以及奶山羊冷凍精液細管凍精的制備方法，對奶山羊精液低溫保存和冷凍保存具有良好的效果，能有效提高解凍后精子活率、頂體完整率及質膜完整性，降低精子畸形率，提高奶山羊凍精生產效率及凍精品質。同時該細管凍精制作工藝操作簡單，生產成本低，有效提高人工授精受胎率及體外授精效率，便于大規模推廣應用。
【具體實施方式】
[0015]下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細的說明。[0016](一)本發明涉及的奶山羊冷凍精液基礎稀釋液的制備方法，由以下步驟實現步驟一:按以下比例準備各組分:
三羥甲基-氨基甲烷(Tris) 300-400 mM ；
檸檬酸
葡萄糖
海藻糖
維生素C (Vc)
還原型谷胱甘肽(GSH)牛血清白蛋白(BSA)三磷酸腺苷(ATP)
100-130 mM ；
35-45 mM ；
260-300 mM ；
4-6 g/L ；
4-6 mM ；
8-12 g/L ；
O 7-1.5 mM ；
步驟二:將上述組分與雙蒸水按比例混勻后，0.2 um濾膜過濾，加入復合抗生素；步驟三:按體積比(vol: vol) 15-25 %的比例,在步驟二得到的混合液中加入卵黃添加液，充分混勻，得到基礎稀釋液。
[0017]步驟二中，加入復合抗生素，即加入0.05~0.055 g/L的泰樂菌素、0.27~0.28 g/L的慶大霉素、0.16^0.18 g/L的林可霉素以及0.3^0.35 g/L的奇霉素。
[0018]步驟三中，卵黃添加液由以下步驟制得:
將新鮮無病原菌雞蛋經過雙氯苯雙胍己烷(洗必泰)浸泡后抽取卵黃液，以質量體積比(wt: vol)為0.035%加入十二烷基磺酸鈉(SDS)，15 X IO3 g離心I h，吸取上清液經0.45μ m濾膜過濾得到卵黃添加液。
[0019](二)本發明所涉及的奶山羊冷凍精液冷凍稀釋液的制備方法，由以下步驟實現:步驟一:按以下比例準備各組分:
三羥甲基-氨基甲烷 300-400 mM ；
檸檬酸葡萄糖海藻糖維生素C還原型谷胱甘肽牛血清白蛋白三磷酸腺苷
100-130 mM ；
35-45 mM ；
260-300 mM ；
4-6 g/L ；
4-6 mM ；
8-12 g/L ；
0.7-1.5 mM ；
步驟二:將上述組分與雙蒸水按比例混勻后，0.2 um濾膜過濾，加入復合抗生素；步驟三:按體積比15-25 %的比例，在步驟二得到的混合液中加入卵黃添加液，充分混勻，得到基礎稀釋液；
步驟四:基礎稀釋液配制好后，按甘油終體積濃度(V01:V01)為12-16%的比例，加入甘油，得到冷凍稀釋液。
[0020]步驟二中，加入復合抗生素，即加入0.05~0.055 g/L的泰樂菌素、0.27~0.28 g/L的慶大霉素、0.16^0.18 g/L的林可霉素以及0.3^0.35 g/L的奇霉素。
[0021]步驟三中，卵黃添加液由以下步驟制得:
將新鮮無病原菌雞蛋經過雙氯苯雙胍己烷浸泡后抽取卵黃液，以質量體積比為0.035%加入十二烷基磺酸鈉，15 X IO3 g離心I h，吸取上清液經0.45 μ m濾膜過濾得到卵黃添加液。
[0022](三)本發明所涉及的奶山羊冷凍精液的稀釋方法，由以下步驟實現:步驟一:制備基礎稀釋液:
(I)按以下比例準備各組分:
三羥甲基-氨基甲烷 300-400 mM ；
(2)將上述組分與雙蒸水按比例混勻后，0.2 um濾膜過濾，加入復合抗生素，即加入0.05、.055 g/L的泰樂菌素、0.27、.28 g/L的慶大霉素、0.16^0.18 g/L的林可霉素以及0.3~0.35 g/L的奇霉素；
(3 )按體積比15-25 %的比例，在步驟二得到的混合液中加入卵黃添加液，充分混勻，得到基礎稀釋液；
卵黃添加液由以下步驟制得:
將新鮮無病原菌雞蛋經過雙氯苯雙胍己烷浸泡后抽取卵黃液，以質量體積比為0.035%加入十二烷基磺酸鈉，15 X IO3 g離心I h，吸取上清液經0.45 μ m濾膜過濾得到卵黃添加液；
步驟二:制備冷凍稀釋液:
基礎稀釋液配制好后，按甘油 終體積濃度為12-16%的比例，加入甘油，得到冷凍稀釋
液；
步驟三:采用兩步法稀釋奶山羊精液并平衡:
(1)采集新鮮公羊精液，在37°C溫度下對精子的表觀活率、活率及密度進行質量評定:用帶有刻度的集精杯計算每次采精體積；在顯微鏡100倍視野下觀察鮮精的表觀活率，分為0-5級，O級為沒有波動，5級為快速漩渦狀波動；在400倍視野下評定鮮精活率，將鮮精稀釋1000倍后在血球計數板上計算精液密度；只有精液表觀活率為5級，活率大于0.8且密度大于2.0X IO9個/mL才能用于冷凍精液制作；
(2)等溫加入基礎稀釋液，使稀釋后精子密度為8XIO8 -1OXlO8個/mL，基礎稀釋液添加量為鮮精液的3-6倍，混勻后轉移至冰箱冷藏室或4°C低溫環境，1.5-2 h水浴冷卻到0-4°C完成第一步稀釋；
(3)在相同溫度下以體積比1:1加入冷凍稀釋液并混勻，此時混合精液密度為4XIO8-5 X IO8個/mL，甘油濃度為6-8 %，完成第二步稀釋，平衡時間2_6 h。
[0023](四)本發明所涉及的奶山羊冷凍精液細管凍精的制備方法，由以下兩步降溫法實現:
步驟一:制備基礎稀釋液:
(I)按以下比例準備各組分:
檸檬酸葡萄糖海藻糖維生素C
100-130 mM ；35-45 mM ；260-300 mM ；
還原型谷胱甘肽牛血清白蛋白三磷酸腺苷
4-6 mM ；
8-12 g/L ；
0.7-1.5 mM ；三羥甲基-氨基甲烷
300-400 mM ；100-130 mM ；35—45 mM ；
檸檬酸葡萄糖海藻糖維生素C
260-300 mM ；
還原型谷胱甘肽牛血清白蛋白三磷酸腺苷
4-6 mM ；
8-12 g/L ；
0.7-1.5 mM ；
(2)將上述組分與雙蒸水按比例混勻后，0.2 um濾膜過濾，加入復合抗生素，即加入0.05、.055 g/L的泰樂菌素、0.27、.28 g/L的慶大霉素、0.16^0.18 g/L的林可霉素以及
0.3~0.35 g/L的奇霉素；
(3)按體積比15-25%的比例，在步驟二得到的混合液中加入卵黃添加液，充分混勻，得到基礎稀釋液；
卵黃添加液由以下步驟制得:
將新鮮無病原菌雞蛋經過雙氯苯雙胍己烷浸泡后抽取卵黃液，以質量體積比為0.035%加入十二烷基磺酸鈉，15 X IO3 g離心I h，吸取上清液經0.45 μ m濾膜過濾得到卵黃添加液；
步驟二:制備冷凍稀釋液:
基礎稀釋液配制好后，按甘油終體積濃度為12-16%的比例，加入甘油，得到冷凍稀釋
液；
步驟三:采用兩步法稀釋奶山羊精液并平衡:
(1)采集新鮮公羊精液，在37°C溫度下對精子的表觀活率、活率及密度進行質量評定:用帶有刻度的集精杯計算每次采精體積；在顯微鏡100倍視野下觀察鮮精的表觀活率，分為0-5級，O級為沒有波動，5級為快速漩渦狀波動；在400倍視野下評定鮮精活率，將鮮精稀釋1000倍后在血球計數板上計算精液密度；只有精液表觀活率為5級，活率大于0.8且密度大于2.0X IO9個/mL才能用于冷凍精液制作；
(2)等溫加入基礎稀釋液，使稀釋后精子密度為8XIO8 -1OXlO8個/mL，基礎稀釋液添加量為鮮精液的3-6倍，混勻后轉移至冰箱冷藏室或4°C低溫環境，1.5-2 h水浴冷卻到0-4°C完成第一步稀釋；
(3)在相同溫度下以體積比1:1加入冷凍稀釋液并混勻，此時混合精液密度為4 X IO8-5 X IO8個/mL，甘油濃度為6-8 %，完成第二步稀釋，平衡時間2_6 h ；
步驟四:制備奶山羊冷凍精液細管凍精:
將稀釋平衡后的精液在0-4°C溫度下吸入0.25 mL細管中，用聚乙烯醇粉封口后，第一步降溫即迅速將細管置于距離液氮表面4-5 cm的冷凍架上，熏蒸4-5 min，第二步降溫即將細管投入到液氮(_196°C)中長期保存。
[0024]以下為奶山羊冷凍精液細管凍精制備的具體實施例:
實施例1:
步驟一:制備基礎 稀釋液:
(I)按以下比例準備各組分:三羥甲基-氨基甲烷300 mM檸檬酸100 mM葡萄糖35 mM ；海藻糖260 mM維生素C4 g/L ；還原型谷胱甘肽4 mM ；牛血清白蛋白8 g/L ；三磷酸腺苷0.7 mM
(2) 將上述組分與雙蒸水按比例混勻后，0.2 um濾膜過濾，加入復合抗生素，即加入0.05 g/L的泰樂菌素、0.27 g/L的慶大霉素、0.16 g/L的林可霉素以及0.3 g/L的奇霉素；
(3)按體積比15%的比例，在步驟二得到的混合液中加入卵黃添加液，充分混勻，得到基礎稀釋液；
卵黃添加液由以下步驟制得:
將新鮮無病原菌雞蛋經過雙氯苯雙胍己烷浸泡后抽取卵黃液，以質量體積比為0.035%加入十二烷基磺酸鈉，15 X IO3 g離心I h，吸取上清液經0.45 μ m濾膜過濾得到卵黃添加液；
步驟二:制備冷凍稀釋液:
基礎稀釋液配制好后，按甘油終體積濃度為12%的比例，加入甘油，得到冷凍稀釋液；
步驟三:采用兩步法稀釋奶山羊精液并平衡:
(1)采集新鮮公羊精液，在37°C溫度下對精子的表觀活率、活率及密度進行質量評定:用帶有刻度的集精杯計算每次采精體積；在顯微鏡100倍視野下觀察鮮精的表觀活率，分為0-5級，O級為沒有波動，5級為快速漩渦狀波動；在400倍視野下評定鮮精活率，將鮮精稀釋1000倍后在血球計數板上計算精液密度；只有精液表觀活率為5級，活率大于0.8且密度大于2.0X IO9個/mL才能用于冷凍精液制作；
(2)等溫加入基礎稀釋液，使稀釋后精子密度為8X IO8個/mL，基礎稀釋液添加量為鮮精液的3倍，混勻后轉移至冰箱冷藏室或4°C低溫環境，1.5 h水浴冷卻到(TC完成第一步稀釋；
(3)在相同溫度下以體積比1:1加入冷凍稀釋液并混勻，此時混合精液密度為4XIO8個/mL，甘油濃度為6%，完成第二步稀釋，平衡時間2 h ；
步驟四:制備奶山羊冷凍精液細管凍精:
將稀釋平衡后的精液在0°C溫度下吸入0.25 mL細管中，用聚乙烯醇粉封口后，第一步降溫即迅速將細管置于距離液氮表面4 cm的冷凍架上，熏蒸4 min，第二步降溫即將細管投入到液氮中長期保存。
[0025] 實施例2:
步驟一:制備基礎稀釋液:
(I)按以下比例準備各組分:
三羥甲基-氨基甲烷 350 mM;
檸檬酸115 mM ;
葡萄糖40 mM ；海藻糖280 mM ；
維生素C5 g/L ；
還原型谷胱甘肽5 mM ；
牛血清白蛋白10 g/L;
三磷酸腺苷1.1 mM ;
(2)將上述組分與雙蒸水按比例混勻后，0.2 um濾膜過濾，加入復合抗生素，即加入0.30 g/L的泰樂菌素、0.27 g/L的慶大霉素、0.17 g/L的林可霉素以及0.30 g/L的奇霉素；
(3)按體積比20%的比例，在步驟二得到的混合液中加入卵黃添加液，充分混勻，得到基礎稀釋液；
卵黃添加液由以下步驟制得:
將新鮮無病原菌雞蛋經過雙氯苯雙胍己烷浸泡后抽取卵黃液，以質量體積比為0.035%加入十二烷基磺酸鈉，15 X IO3 g離心I h，吸取上清液經0.45 μ m濾膜過濾得到卵黃添加液；
步驟二:制備冷凍稀釋液:
基礎稀釋液配制好后，按甘油終體積濃度為14%的比例，加入甘油，得到冷凍稀釋液；步驟三:采用兩步法稀 釋奶山羊精液并平衡:
(1)采集新鮮公羊精液，在37°C溫度下對精子的表觀活率、活率及密度進行質量評定:用帶有刻度的集精杯計算每次采精體積；在顯微鏡100倍視野下觀察鮮精的表觀活率，分為0-5級，O級為沒有波動，5級為快速漩渦狀波動；在400倍視野下評定鮮精活率，將鮮精稀釋1000倍后在血球計數板上計算精液密度；只有精液表觀活率為5級，活率大于0.8且密度大于2.0X IO9個/mL才能用于冷凍精液制作；
(2)等溫加入基礎稀釋液，使稀釋后精子密度為9X IO8個/mL，基礎稀釋液添加量為鮮精液的4倍，混勻后轉移至冰箱冷藏室或4°C低溫環境，1.5 h水浴冷卻到2°C完成第一步稀釋；
(3)在相同溫度下以體積比1:1加入冷凍稀釋液并混勻，此時混合精液密度為4XIO8個/mL，甘油濃度為7 %，完成第二步稀釋，平衡時間4 h ；
步驟四:制備奶山羊冷凍精液細管凍精:
將稀釋平衡后的精液在2°C溫度下吸入0.25 mL細管中，用聚乙烯醇粉封口后，第一步降溫即迅速將細管置于距離液氮表面4 cm的冷凍架上，熏蒸4 min，第二步降溫即將細管投入到液氮中長期保存。
[0026] 實施例3:
步驟一:制備基礎稀釋液:
(I)按以下比例準備各組分:
三羥甲基-氨基甲烷 400 mM;
檸檬酸130 mM ；
葡萄糖45 mM ；
海藻糖300 mM ；
維生素C6 g/L ；還原型谷胱甘肽6 mM ；
牛血清白蛋白12 g/L;三磷酸腺苷1.5 mM ;
(2)將上述組分與雙蒸水按比例混勻后，0.2 um濾膜過濾，加入復合抗生素，即加入0.055 g/L的泰樂菌素、0.28 g/L的慶大霉素、0.18 g/L的林可霉素以及0.35 g/L的奇霉素；
(3)按體積比25%的比例，在步驟二得到的混合液中加入卵黃添加液，充分混勻，得到基礎稀釋液；
卵黃添加液由以下步驟制得:
將新鮮無病原菌雞蛋經過雙氯苯雙胍己烷浸泡后抽取卵黃液，以質量體積比為0.035%加入十二烷基磺酸鈉，15 X IO3 g離心I h，吸取上清液經0.45 μ m濾膜過濾得到卵黃添加液；
步驟二:制備冷凍稀釋液:
基礎稀釋液配制好后，按甘油終體積濃度為16%的比例，加入甘油，得到冷凍稀釋液；
步驟三:采用兩步法稀釋奶山羊精液并平衡:
(1)采集新鮮公羊精液，在37°C溫度下對精子的表觀活率、活率及密度進行質量評定:用帶有刻度的集精杯計算每次采精體積；在顯微鏡100倍視野下觀察鮮精的表觀活率，分為0-5級，O級為沒有波動，5級為快速漩渦狀波動；在400倍視野下評定鮮精活率，將鮮精稀釋1000倍后在血球計數板上計算精液密度；只有精液表觀活率為5級，活率大于0.8且密度大于2.0X IO9個/mL才能用于冷凍精液制作；
(2)等溫加入基礎稀釋液，使稀釋后精子密度為IOXlO8個/mL，基礎稀釋液添加量為鮮精液的6倍，混勻后轉移至冰箱冷藏室或4°C低溫環境，2 h水浴冷卻到4°C完成第一步稀釋；
(3)在相同溫度下以體積比1:1加入冷凍稀釋液并混勻，此時混合精液密度為5X108個/mL，甘油濃度為8 %，完成第二步稀釋，平衡時間6 h；
步驟四:制備奶山羊冷凍精液細管凍精:
將稀釋平衡后的精液在4°C溫度下吸入0.25 mL細管中，用聚乙烯醇粉封口后，第一步降溫即迅速將細管置于距離液氮表面5 cm的冷凍架上，熏蒸5 min，第二步降溫即將細管投入到液氮中長期保存。
[0027]實施例4:
步驟一:制備基礎稀釋液:
(I)按以下比例準備各組分:
三羥甲基-氨基甲烷 375 mM;
檸檬酸124 mM ；
葡萄糖41 mM ；
海藻糖281 mM ；
維生素C5 g/L ；
還原型谷胱甘肽5 mM ；
牛血清白蛋白10 g/L;三磷酸腺苷1.2 mM ;
(2)將上述組分與雙蒸水按比例混勻后，0.2 um濾膜過濾，加入復合抗生素，即加入
0.052 g/L的泰樂菌素、0.28 g/L的慶大霉素、0.17 g/L的林可霉素以及0.33 g/L的奇霉素；
(3)按體積比20%的比例，在步驟二得到的混合液中加入卵黃添加液，充分混勻，得到基礎稀釋液；
卵黃添加液由以下步驟制得:
將新鮮無病原菌雞蛋經過雙氯苯雙胍己烷浸泡后抽取卵黃液，以質量體積比為0.035%加入十二烷基磺酸鈉，15 X IO3 g離心1 h，吸取上清液經0.45 μ m濾膜過濾得到卵黃添加液；
步驟二:制備冷凍稀釋液:
基礎稀釋液配制好后，按甘油終體積濃度為12%的比例，加入甘油，得到冷凍稀釋液；步驟三:采用兩步法稀釋奶山羊精液并平衡:
(1)采集新鮮公羊精液，在37°C溫度下對精子的表觀活率、活率及密度進行質量評定:用帶有刻度的集精杯計算每次采精體積；在顯微鏡100倍視野下觀察鮮精的表觀活率，分為0-5級，O級為沒有波動，5級為快速漩渦狀波動；在400倍視野下評定鮮精活率，將鮮精稀釋1000倍后在血球計數板上計算精液密度；只有精液表觀活率為5級，活率大于0.8且密度大于2.0X IO9個/mL才能用于冷凍精液制作；
(2)等溫加入基礎稀釋液，使稀釋后精子密度為1OXlO8個/mL，基礎稀釋液添加量為鮮精液的3倍，混勻后轉移至冰箱冷藏室或4°C低溫環境，2 h水浴冷卻到4°C完成第一步稀釋；
(3)在相同溫度下以體積比1:1加入冷凍稀釋液并混勻，此時混合精液密度為5X108個/mL，甘油濃度為6 %，完成第二步稀釋，平衡時間3 h；
步驟四:制備奶山羊冷凍精液細管凍精:
將稀釋平衡后的精液在4°C溫度下吸入0.25 mL細管中，用聚乙烯醇粉封口后，第一步降溫即迅速將細管置于距離液氮表面5 cm的冷凍架上，熏蒸5 min，第二步降溫即將細管投入到液氮中長期保存。
[0028]有益效果說明:
采用假陰道法采集27只成年健康薩能奶山羊種公羊(1-4周歲)精液，在35-37°C下對精液的表觀活率，活率及密度進行評定。利用上述兩次稀釋法及兩次降溫法制作成細管凍精。隨機抽取每只個體3支細管凍精進行檢測。結果表明所采集種公羊樣品鮮精密度由
1.9 X 109-2.8 X IO9個/mL范圍內變化，平均密度為2.5 X IO9個/mL，每只種公羊表觀活率均達到最高值，活率在0.75-0.85范圍內變化，平均值為0.8。經解凍后結果顯示，活率在
0.45-0.65范圍內變化，平均是為0.57，頂體完整率平均值為84%。數據結果見表一。
[0029]表一本研究稀釋液及細管制作工藝對山羊精液解凍后品質的影響
【權利要求】
1.奶山羊冷凍精液基礎稀釋液的制備方法，其特征在于：由以下步驟實現：步驟一：按以下比例準備各組分：三羥甲基-氨基甲烷 300-400 mM ；檸檬酸100-130 mM ；葡萄糖35-45 mM ；海藻糖260-300 mM ；維生素C4-6 g/L ；還原型谷胱甘肽4-6 mM ；牛血清白蛋白8-12 g/L;三磷酸腺苷0. 7-1. 5 mM ；步驟二 ：將上述組分與雙蒸水按比例混勻后，0. 2 um濾膜過濾，加入復合抗生素； 步驟三：按體積比15-25 %的比例，在步驟二得到的混合液中加入卵黃添加液，充分混 勻，得到基礎稀釋液。
2.根據權利要求1所述的奶山羊冷凍精液基礎稀釋液的制備方法，其特征在于：步驟二中，加入復合抗生素，即加入0.05-0. 055 g/L的泰樂菌素、0. 27-0. 28 g/L的慶 大霉素、0. 16-0. 18 g/L的林可霉素以及0. 3-0. 35 g/L的奇霉素。
3.根據權利要求1或2所述的奶山羊冷凍精液基礎稀釋液的制備方法，其特征在于： 步驟三中，卵黃添加液由以下步驟制得：將新鮮無病原菌雞蛋經過雙氯苯雙胍己烷浸泡后抽取卵黃液，以質量體積比為0. 035% 加入十二烷基磺酸鈉，15 XlO3 g離心1 h，吸取上清液經0.45 um濾膜過濾得到卵黃添 加液。
4.根據權利要求3所述的制備方法制得的奶山羊冷凍精液基礎稀釋液。
5.奶山羊冷凍精液冷凍稀釋液的制備方法，其特征在于：由以下步驟實現：步驟一：按以下比例準備各組分：三羥甲基-氨基甲烷 300-400 mM ；檸檬酸100-130 mM ；葡萄糖35-45 mM ；海藻糖260-300 mM ；維生素C4-6 g/L ；還原型谷胱甘肽4-6 mM ；牛血清白蛋白8-12 g/L;三磷酸腺苷0. 7-1. 5 mM ；步驟二 ：將上述組分與雙蒸水按比例混勻后，0. 2 um濾膜過濾，加入復合抗生素； 步驟三：按體積比15-25 %的比例，在步驟二得到的混合液中加入卵黃添加液，充分混 勻，得到基礎稀釋液；步驟四：基礎稀釋液配制好后，按甘油終體積濃度為12-16%的比例，加入甘油，得到冷 凍稀釋液。
6.根據權利要求5所述的奶山羊冷凍精液冷凍稀釋液的制備方法，其特征在于:步驟二中，加入復合抗生素，即加入0.05-0.055 g/L的泰樂菌素、0.27-0.28 g/L的慶大霉素、0.16-0.18 g/L的林可霉素以及0.3-0.35 g/L的奇霉素。
7.根據權利要求5或6所述的奶山羊冷凍精液冷凍稀釋液的制備方法，其特征在于:步驟三中，卵黃添加液由以下步驟制得:將新鮮無病原菌雞蛋經過雙氯苯雙胍己烷浸泡后抽取卵黃液，以質量體積比為0.035%加入十二烷基磺酸鈉，15 X IO3 g離心I h，吸取上清液經0.45 μ m濾膜過濾得到卵黃添加液。
8.根據權利要求7所述的制備方法制得的奶山羊冷凍精液冷凍稀釋液。
9.奶山羊冷凍精液的稀釋方法，其特征在于:由以下步驟實現:步驟一:制備基礎稀釋液:(1)按以下比例準備各組分:三羥甲基-氨基甲烷 300-400 mM ；檸檬酸100-130 mM ；葡萄糖35-45 mM ；海藻糖260-300 mM ；維生素C4-6 g/L ；還原型谷胱甘肽4-6 mM ；牛血清白蛋白8-12 g/L;三磷酸腺苷0.7-1.5 mM ；(2)將上述組分與雙蒸水按比例混勻后，0.2 um濾膜過濾，加入復合抗生素，即加入0.05-0.055 g/L的泰樂菌素、0.27-0.28 g/L的慶大霉素、0.16-0.18 g/L的林可霉素以及0.3-0.35 g/L的奇霉素；(3)按體積比15-25%的比例，在步驟二得到的混合液中加入卵黃添加液，充分混勻，得到基礎稀釋液；卵黃添加液由以下步驟制得:將新鮮無病原菌雞蛋經過雙氯苯雙胍己烷浸泡后抽取卵黃液，以質量體積比為0.035%加入十二烷基磺酸鈉，15 X IO3 g離心I h，吸取上清液經0.45 μ m濾膜過濾得到卵黃添加液；步驟二:制備冷凍稀釋液:基礎稀釋液配制好后，按甘油終體積濃度為12-16%的比例，加入甘油，得到冷凍稀釋液；步驟三:采用兩步法稀釋奶山羊精液并平衡:(1)采集新鮮公羊精液，在37°C溫度下對精子的表觀活率、活率及密度進行質量評定:用帶有刻度的集精杯計算每次采精體積；在顯微鏡100倍視野下觀察鮮精的表觀活率，分為0-5級，O級為沒有波動，5級為快速漩渦狀波動；在400倍視野下評定鮮精活率，將鮮精稀釋1000倍后在血球計數板上計算精液密度；只有精液表觀活率為5級，活率大于0.8且密度大于2.0X IO9個/mL才能用于冷凍精液制作；(2)等溫加入基礎稀釋液，使稀釋后精子密度為8XIO8 -1OXlO8個/mL，基礎稀釋液添加量為鮮精液的3-6倍，混勻后轉移至冰箱冷藏室或4°C低溫環境，1.5-2 h水浴冷卻到0-4°C完成第一步稀釋；(3)在相同溫度下以體積比1:1加入冷凍稀釋液并混勻，此時混合精液密度為4XIO8-5 X IO8個/mL，甘油濃度為6-8 %，完成第二步稀釋，平衡時間2_6 h。
10.奶山羊冷凍精液細管凍精的制備方法，其特征在于:由以下兩步降溫法實現:步驟一:制備基礎稀釋液:(1)按以下比例準備各組分:三羥甲基-氨基甲烷 300-400 mM ；檸檬酸.100-130 mM ；葡萄糖.35-45 mM ；海藻糖.260-300 mM ；維生素C.4-6 g/L ；還原型谷胱甘肽4-6 mM ；牛血清白蛋白.8-12 g/L ；三磷酸腺苷.0.7-1.5 mM ；(2)將上述組分與雙蒸水按比例混勻后，0.2 um濾膜過濾，加入復合抗生素，即加入.0.05-0.055 g/L的泰樂菌素、0.27-0.28 g/L的慶大霉素、0.16-0.18 g/L的林可霉素以及.0.3-0.35 g/L的奇霉素；(3)按體積比15-25%的比例，在步驟二得到的混合液中加入卵黃添加液，充分混勻，得到基礎稀釋液；卵黃添加液由以下步驟制得:將新鮮無病原菌雞蛋經過雙氯苯雙胍己烷浸泡后抽取卵黃液，以質量體積比為0.035%加入十二烷基磺酸鈉，15 X IO3 g離心I h，吸取上清液經0.45 μ m濾膜過濾得到卵黃添加液；步驟二:制備冷凍稀釋液:基礎稀釋液配制好后，按甘油終體積濃度為12-16%的比例，加入甘油，得到冷凍稀釋液；步驟三:采用兩步法稀釋奶山羊精液并平衡:(1)采集新鮮公羊精液，在37°C溫度下對精子的表觀活率、活率及密度進行質量評定:用帶有刻度的集精杯計算每次采精體積；在顯微鏡100倍視野下觀察鮮精的表觀活率，分為0-5級，O級為沒有波動，5級為快速漩渦狀波動；在400倍視野下評定鮮精活率，將鮮精稀釋1000倍后在血球計數板上計算精液密度；只有精液表觀活率為5級，活率大于0.8且密度大于2.0X IO9個/mL才能用于冷凍精液制作；(2)等溫加入基礎稀釋液，使稀釋后精子密度為8XIO8 -1OXlO8個/mL，基礎稀釋液添加量為鮮精液的3-6倍，混勻后轉移至冰箱冷藏室或4°C低溫環境，1.5-2 h水浴冷卻到.0-4°C完成第一步稀釋；(3)在相同溫度下以體積比1:1加入冷凍稀釋液并混勻，此時混合精液密度為4XIO8-5 X IO8個/mL，甘油濃度為6-8 %，完成第二步稀釋，平衡時間2_6 h ；步驟四:制備奶山羊冷凍精液細管凍精:將稀釋平衡后的精液在0-4°C溫度下吸入0.25 mL細管中，用聚乙烯醇粉封口后，第一步降溫即迅速將細管置于距離液氮表面4-5 cm的冷凍架上，熏蒸4-5 min，第二步降溫即將細管投入到液氮中長·期保存。
【文檔編號】A01N1/02GK103518706SQ201310491965
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月21日 優先權日:2013年10月21日
【發明者】王維, 羅軍, 史懷平, 席利萌, 孫爽, 高慶華, 張偉, 楊地坤, 朱江江, 石恒波 申請人:西北農林科技大學